Modèle microfluidique d’entérocolite nécrosante incorporant des entéroïdes intestinaux néonatals humains et un microbiome dysbiotique

Résumé

Ce protocole décrit un modèle in vitro d’entérocolite nécrosante (NEC), qui peut être utilisé pour des études mécanistiques de la pathogenèse de la maladie. Il est doté d’une puce microfluidique ensemencée d’entéroïdes intestinaux dérivés de l’intestin néonatal humain, de cellules endothéliales et du microbiome intestinal d’un nouveau-né atteint d’une NEC sévère.

Résumé

L’entérocolite nécrosante (ECN) est une maladie intestinale grave et potentiellement mortelle qui a été difficile à étudier en raison de sa pathogenèse complexe, qui reste incomplètement comprise. La physiopathologie de la NEC comprend la perturbation des jonctions serrées intestinales, l’augmentation de la perméabilité de la barrière intestinale, la mort des cellules épithéliales, la dysbiose microbienne et l’inflammation déréglée. Les outils traditionnels pour étudier la NEC comprennent des modèles animaux, des lignées cellulaires et des organoïdes intestinaux humains ou murins. Bien que les études utilisant ces systèmes modèles aient amélioré la compréhension de la physiopathologie de la maladie, leur capacité à récapituler la complexité de la NEC humaine est limitée. Un modèle in vitro amélioré de NEC utilisant la technologie microfluidique, appelé NEC-on-a-chip, a maintenant été développé. Le modèle NEC-on-a-chip consiste en un dispositif microfluidique ensemencé avec des entéroïdes intestinaux dérivés d’un nouveau-né prématuré, co-cultivé avec des cellules endothéliales humaines et le microbiome d’un nourrisson atteint d’une NEC sévère. Ce modèle est un outil précieux pour les études mécanistiques sur la physiopathologie de la NEC et une nouvelle ressource pour les tests de découverte de médicaments pour les maladies intestinales néonatales. Dans ce manuscrit, une description détaillée du modèle NEC-on-a-chip sera fournie.

Introduction

L’entérocolite nécrosante (ECN) touche les prématurés, avec une incidence allant jusqu’à 10 % chez ceux nés pesant < 1500 g¹. La physiopathologie de la NEC est complexe et comprend des lésions de l’épithélium intestinal, une perturbation des jonctions intestinales serrées, une augmentation de la perméabilité de la barrière intestinale, un dérèglement immunitaire et la mort des cellules épithéliales ^2,3. Notre compréhension des mécanismes impliqués dans la pathogenèse de la NEC reste incomplète et, malgré des décennies de recherche, il n’existe toujours pas de thérapies ciblées efficaces....

Protocole

Les entéroïdes ont été obtenus à partir d’échantillons de l’intestin grêle de nourrissons prématurés (nés entre 22 et 36 semaines de gestation) obtenus au moment de la chirurgie pour une NEC ou d’autres affections intestinales d’étiologies non inflammatoires. Tous les prélèvements et traitements d’échantillons ont été effectués après le consentement éclairé et l’approbation des comités d’examen institutionnels de l’Université Washington à St. Louis (numéros de protocole 201706182 et 201804040 de l’IRB) et de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill (numéro de protocole IRB 21-3134).

1. Isolement et placage de cryptes de l’intest....

Discussion

Ce système NEC-on-a-chip est un nouvel outil puissant qui peut être utilisé pour modéliser la physiopathologie de la NEC. Cette plate-forme fournit un microenvironnement complexe qui ressemble plus étroitement au milieu intestinal in vivo que les modèles précédents en incorporant un système de co-culture avec un flux luminal continu et un étirement. Ces conditions favorisent le développement d’une architecture 3D en forme de villosités tapissée d’un épithélium hautement polarisé constitué de.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
A 83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Gibco	12634010
B-27 Supplement, serum free (50x)	Gibco	17504044
Basic Bio-kit	Emulate	N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	Agilent	7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro	BrandTech	759085D
Cell Recovery Solution	Corning	354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems	Bio-Rad	12011319
Chip Cradle	Emulate	N/A
Chip-S1 Stretchable Chip	Emulate	N/A
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well	Corning	3548
Collagen from human placenta	Sigma-Aldrich	C5533
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit	Cell Biologics	H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL	Fisher Scientific	05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
Countess II automated cell counter	Invitrogen	AMQAX1000
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable	Invitrogen	D7132	Permeability dye
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane	Fisher Scientific	FB12566504
DMEM/F-12	Gibco	11320033
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0	Corning	46-034-CI
ER-1 surface activation reagent	Emulate	ER-1	Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent	Emulate	ER-2	Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm	Fisher Scientific	FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics	6950
Genie Temp-Shaker 300	Scientific Industries, Inc.	SI-G300
Gentamicin	Gibco	15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL)	Corning	25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Invitrogen	H3570
Human Collagen Type I	Sigma-Aldrich	CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Biologics	H-6054
Inverted Microscope	Fisher Scientific	03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths	Fisher Scientific	FSGPD10
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller	Supelco	L3027
L-WRN Cells	American Type Culture Collection	CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	356231	Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	1009005
NAILSTAR UV LAMP	NailStar	NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-274200
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	72340
Orb-HM1 Hub Module	Emulate	N/A
Paraformaldehyde	ThermoFisher	047392.9L
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Rainin	17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8	Rainin	17014966
Pod Portable Module	Emulate	N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)	Avantor Seradigm	1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit	QIAGEN	205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)	PeproTech	315-09
SB 431542	Tocris	1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated	Corning	431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um	Fisher Scientific	22-363-548
Sterile Syringes, 10mL	Fisher Scientific	14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors	Miltex Instruments	MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge	Thermo Scientific	75016052
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Detergent
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596026	RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5	Corning	25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L	Thermo Scientific	13-998-252
Y-27632	Tocris	1254
Zoë-CM1 Culture Module	Emulate	N/A