Folikül Uyarıcı Hormonun Bağımsız Etkilerinin Bir Fare Modelinde İn Vivo Olarak Araştırılması

Özet

Çeşitli ekstragonadal doku ve organlarda folikül stimüle edici hormon (FSH) birçok hastalığın patogenezi ile ilişkilidir. Yumurtalıklı ve FSH ile tedavi edilmiş fare modeli (OVF), FSH'nin ekstragonadal etkilerini araştırmak için kullanılabilir.

Özet

Üreme aşamasından üreme dışı aşamaya (menopoz) geçiş sırasında, birçok kadın azalmış kemik kütlesi, artmış kan lipitleri ve artmış viseral yağlanma dahil olmak üzere önemli fizyolojik ve patolojik değişiklikler yaşar. Menopoz geçişi sırasında folikül uyarıcı hormon (FSH) seviyeleri yükselir. Birçok çalışma, çeşitli ekstragonadal doku ve organlarda FSH'nin çoklu hastalıkların patogenezi ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, FSH'nin in vivo bağımsız etkilerini incelemeye yardımcı olabilecek bir hayvan modeli oluşturmak özellikle önemlidir. Bu çalışmada, hipotalamik-hipofiz-gonadal eksenin etkisini ortadan kaldırmak için C57BL/6 dişi fareler yumurtalıktan çıkarıldı ve estradiol valerat (OVX + E2) ile desteklendi. OVX + E2 fareleri, nispeten stabil östrojen ve yükselen FSH seviyeleri ile karakterize edilen bir fare modeli (OVF) oluşturmak için intraperitoneal enjeksiyon yoluyla çözücü (NS) veya farklı dozlarda rekombinant FSH aldı. Bu nedenle, yüksek serum FSH seviyeleri ile karakterize edilen menopoz geçişinin erken aşamasını taklit etmek için deneysel bir fare modelini başarıyla oluşturduk. OVF modeli, FSH'nin ekstragonadal etkilerini keşfetmeye yönelik çalışmalar için uygun olan kararlı, düşük maliyetli ve kullanımı kolay olma avantajlarına sahiptir. Burada, fare OVF modeli için ayrıntılı protokolleri açıklıyoruz.

Giriş

Menopoz geçişi sırasında folikül uyarıcı hormon (FSH) düzeyleri yükselir (menopozal geçiş terimi 2011 yılında üreme yaşlanması evrelerinde tanımlanmıştır atölye (STRAW) + 10 sistemi)¹. Yükselen FSH seviyeleri ve nispeten stabil östrojen¹ ile karakterize edilen bir dönem olan menopoz geçişi sırasında, kadınlar adet döngüsü değişiklikleri ve çeşitli hücre ve dokuları içeren önemli fizyolojik değişiklikler yaşarlar. Bu değişiklikler kadınların yaşam kalitesini ve sağlığını ciddi şekilde etkileyebilir. FSH'nin etkilerini araştırmak, kadınların yaşam kalitesini ve sağlığını iyileştirebilir.

FSH, ön hipofizdeki gonadotrop hücrelerinden salgılanır ve gonadal fonksiyon ve üremenin kontrolünde kritik öneme sahiptir². FSH'nin işlevine, G proteinine bağlı reseptöre (GPCR) ait olan FSH reseptörü (FSHR) aracılık ^eder.3. FSHR genellikle gonadlarda, yani yumurtalık ve testiste ifade edilir. FSHR'nin karaciğer⁴, hipokampus⁵, osteoklastlar⁶, adipositler⁷ ve endotel hücreleri⁸ dahil olmak üzere çoklu ekstragonadal hücre ve dokularda evrensel olarak eksprese edildiği kanıtlanmıştır. Ortaya çıkan çalışmalar, FSH'nin ekstra gonadal etkilerini ve dislipidemi⁴, Alzheimer hastalığı⁵, osteoporoz ^9,10, ateroskleroz¹¹, obezite⁹ ve kanser^12'deki potansiyel klinik önemini ortaya koymuştur. Bu nedenle, FSH'nin bağımsız etkilerini in vivo olarak incelemeye yardımcı olabilecek bir hayvan modeli oluşturmak, tek başına FSH'nin etkilerini araştırmak için özellikle önemlidir.

Protokolde, nispeten stabil östrojen ve yükselen FSH seviyeleri¹³ ile bir fare modeli oluşturma prosedürünü tanıttık. Fare modeli, yumurtalık cerrahisi ile menopoz geçişini taklit eder ve daha sonra estradiol valerat ve rekombinant FSH ile desteklenir. Yumurtalıklı fareler, sahte olarak çalıştırılan farelerle benzer östrojen seviyelerini korumak için eksojen östrojen ile desteklendiğinden, hipofiz bezindeki östrojen geri bildirimi nedeniyle endojen FSH seviyeleri stabildi. Bu durumda, östrojen seviyelerini değiştirmeden eksojen FSH uygulayarak FSH seviyelerini kontrol edebilir. Böylece, OVF fare modeli östrojenin etkisini dışlayabilir ve FSH'nin ekstragonadal fizyolojik ve patolojik etkilerini gözlemleyebilir. Ayrıntılı ve görselleştirilmiş prosedürün, araştırmacıların laboratuvarlarında OVF fare modelini oluşturmaları ve gerektiğinde menopoz geçişi sırasındaki fizyolojik ve patolojik değişiklikleri araştırmak için uygulamaları için yararlı olduğuna inanıyoruz.

Protokol

Aşağıdaki protokol, araştırma hayvanlarının kullanımına ilişkin tüm kurumsal etik yönergelere uygundur ve Çin'deki Shandong İl Hastanesi'ndeki Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm cerrahi manipülasyonlar derin anestezi altında yapıldı ve hayvanlar işlem sırasında hiçbir aşamada ağrı hissetmedi.

1. Operasyon öncesi hazırlık

1. Alet sterilizasyonu
   1. Ameliyattan önce cerrahi aletleri bir otoklavda (15 dakika boyunca 121 ° C) buharla sterilize edin. Yeterli miktarda tek kullanımlık dikiş ve iğne hazırlayın.
2. Ameliyat platformu kurulumu
   1. Ameliyatı cerrahi prosedürlere ayrılmış bir odada gerçekleştirin. İşlem için en az 60 cm x 60 cm'lik bir tezgah alanı atayın. Alanın yüzeyini %75 alkol ile temizleyin ve tek kullanımlık bir tıbbi havlu ile örtün ve ardından 30 dakika önceden ultraviyole radyasyonla dezenfekte edin (Şekil 1A).
3. Hayvan hazırlama
   1. Tüm hayvanları sıcaklık kontrollü bir odada (20-25 °C) 12 saat aydınlık, 12 saat karanlık döngüde barındırın. 8 haftalık dişi C57BL/6 fareleri ameliyattan önce 1 hafta boyunca barınma tesisine alıştırmak.
   2. Ameliyattan önce fareleri tartın. İşlem sırasında herhangi bir aşamada ağrısızlık elde etmek için 9 haftalık tüm dişi fareleri intraperitoneal Tribromoetanol (280 mg / kg) enjeksiyonu ile genel anestezi ile uygulayın. Ağrıyı hafifletmek için ameliyattan yaklaşık 1 saat önce deri altına meloksikam (2 mg / kg) enjekte edin.
   3. Ameliyat sırasında kornea kuruluğunu önlemek için göz merhemi sürün.
   4. Temiz bir pamuklu çubuk kullanarak sırtınıza epilasyon losyonu uygulayın. Losyonu 3-5 dakika farenin üzerinde bekletin, ardından gazlı bez ve pamuklu çubuklarla tüyleri alın. Farenin arkasındaki tüm tüyler alınana kadar bu adımı tekrarlayın.
   5. Cildi% 75 alkolle temizlemek için gazlı bez ve pamuklu çubuk kullanın. Fareyi lastik bir şerit veya pamuk ip kullanarak ameliyat platformuna sabitleyin (Şekil 1B) ve sırtını temizlemek için iyodofor solüsyonu uygulayın.
      NOT: Ovariektomiden önce anestezi derinliğini bir ayak parmağı kıstırma ile onaylayın.

2. Yumurtalık ameliyatı

NOT: Tribromoetanol yaklaşık 30 dakika muhafaza edilerek ameliyatın mümkün olduğunca tamamlanması sağlanabilir.

1. Tek kullanımlık bir neşter kullanarak uyluk tabanından yukarıya doğru uzunlamasına ~1.0 cm'lik bir dorsal kesi yapın, sadece cilt ve deri altı fasyanın kesildiğinden emin olun ve bu sırada posterior peritonu kesmekten kaçının.
2. Kesi sola doğru çekildiğinde beyaz bir yağ yastığı görülebilir. Mikro forseps ve makas kullanarak intraperitoneal boşluğu ortaya çıkarmak için beyaz yağ yastığı boyunca ~ 0.5 cm kesin.
3. Posterior peritonu kestikten sonra, beyaz yağ yastığını mikro forseps ile intraperitoneal boşluktan yavaşça ve nazikçe çıkarın. Beyaz yağ dokusunu hemen ıslatılmış gazlı bezin dışında% 0.9 steril salin ile nemlendirin. Karın boşluğunun dışındayken açıkta kalan dokuyu daima nemli tutun.
4. Beyaz yağ yastığının alt kısmına pembe granüler bir madde yani yumurtalık eklenir (Şekil 2A). Yumurtalıklar ince bir kanala yani rahime bağlıdır. Uterusun yumurtalık ucunu bağlamak ve sol yumurtalığı çıkarmak için 5-0 emilebilir sütürler kullanın (Şekil 2B).
5. Bir yumurtalığı çıkarırken, çevredeki yağ dokusunu mümkün olduğunca koruyun. Cerrahi aletler ve yumurtalıklar arasında doğrudan temastan kaçının ve yumurtalık dokusunun intraperitoneal implantasyonunu önleyin.
6. Beyaz yağ yastığını dikkatlice intraperitoneal boşluğa geri yerleştirin. Posterior peritonda 5-0 emilebilir sütür ile basit bir aralıklı sütür uygulayın (Şekil 2C). Dikiş tamamlandıktan sonra, kanamaları %0,9 steril tuzlu suya batırılmış gazlı bezle temizleyin.
7. Cilt kesisini sağa doğru çekin ve aynı yöntemi kullanarak sağ yumurtalığı çıkarın.
8. 4-0 emilmeyen dikişlerle aralıklı dikiş atın ve kanamaları %0.9 steril tuzlu suya batırılmış gazlı bezle temizleyin (Şekil 2D).
9. Her iki dikişi de tamamladıktan sonra yarayı bir iyodofor solüsyonu ile temizleyin. İntraperitoneal olarak geniş spektrumlu antibiyotikler enjekte edilir.

3. Operasyon sonrası gözlem

1. Ameliyattan sonra fareleri 37 °C sabit sıcaklıktaki bir battaniyeye taşıyın. Fareler serbestçe hareket edene kadar, hayvanları kendi kafeslerinde tutun. Sternal yaslığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın.
2. Ağrıyı hafifletmek için ameliyattan 24 saat sonra deri altına meloksikam (2 mg/kg) enjekte edin.
3. Cerrahi yaranın herhangi bir komplikasyon belirtisi (ayrışma) olmadan düzgün bir şekilde iyileştiğinden emin olmak için fareleri günlük olarak izleyin.

4. Estradiol takviyesi

1. Estradiol valerat ile desteklenmiş yem hazırlayın. 1 kg yem başına takviye edilmiş 2.6 mg beta-estradiol 17-valerat kullanın.
2. Ameliyatın tamamlanmasından 3 gün sonra, fareleri estradiol valerat ile besleyin.

5. FSH enjeksiyonu

1. Rekombinant insan FSH çözeltisi hazırlayın. Enjeksiyon için rekombinant insan FSH tozunu 100 IU / mL'ye kadar% 0.9 steril salin ile çözün.
2. Fareleri deney planlarına göre gruplandırın ve 2 hafta boyunca intraperitoneal enjeksiyon yoluyla çözücü veya farklı dozlarda rekombinant FSH verin. Rekombinant FSH'nin biyolojik aktivitesine göre, menopoz geçiş döneminde kadınlarda serum FSH seviyesine eşdeğer farelerde FSH enjeksiyon dozunu kullanın.
   NOT: Farklı tedavilere dayanarak, yumurtalıklı östrojen takviyeli fareler rastgele üç gruba ayrıldı, 100 μL / gün çözücü alan çözücü (NS) grubu, günde 15 IU / kg vücut ağırlığı alan düşük doz FSH (L-FSH) grubu ve günde 30 IU / kg vücut ağırlığı alan yüksek doz FSH (H-FSH) grubu.

Tartışmalar

Üreme aşamasından üreme dışı faza (menopoz) geçiş sırasında, birçok kadın önemli fizyolojik ve patolojik değişiklikler yaşar. Menopoz geçişi sırasında FSH seviyeleri yükselir¹. Ortaya çıkan çalışmalar, çeşitli ekstragonadal doku ve organlarda FSH'nin dislipidemi⁴, Alzheimer hastalığı⁵, osteoporoz ^9,10, ateroskleroz¹¹, obezite⁹ ve kanser¹² dahil olmak üzere birçok hastalığın patogenezinde kritik olduğunu ortaya koymuştur. Bu nedenle, FSH'nin in vivo bağımsız etkilerini incelemeye yardımcı olabilecek bir hayvan modeli oluşturmak özellikle önemlidir. OVF fare modeli, nispeten stabil östrojen ve yükselen FSH seviyeleri ile menopoz geçişinin erken aşamasını taklit eder ve özellikle FSH'nin ekstragonadal etkilerini keşfetmeye yönelik çalışmalar için uygundur.

Bu yöntemde ovarektomi, uyluk tabanından yukarıya doğru yaklaşık 1 cm olacak şekilde tek bir sırt sırtı kesisi kullanılarak yapıldı (Şekil 1B). Deri, keskin diseksiyon makası kullanılarak dorsal kaslarla neredeyse birlikte kesildi ve böylece periton boşluğuna erişildi. Ameliyat sonrası kas insizyonu dikiş gerektirmedi ve cilt yarası bilateral olarak tek katgüt sütür ile kapatıldı (Şekil 2). Operasyon, kullanılan diğer yöntemlere kıyasla teknik olarak daha kolay, daha az zaman alıcı ve dişi fareler için daha az zararlıdır.

Ameliyat işlemi sırasında dikkat edilmesi gereken bazı detaylar. İlk olarak, ameliyat sonrası enfeksiyon riskini azaltmak için tüm cerrahi prosedürler temiz ve mümkün olduğunca steril tutulmalıdır. İkincisi, yumurtalık dokusu çok kırılgan olduğundan, intraperitoneal implantasyonu önlemek için cerrahi aletler yumurtalıklara doğrudan temas edemez. Üçüncüsü, ameliyattan sonra, postoperatif hipoterminin ölüme yol açmasını önlemek için fareler iyileşme sırasında 37 °C sabit sıcaklıktaki bir battaniyeye taşındı.

Daha önceki bir çalışma, endojen östrojenin premenopozal kadınların yumurtalık teka hücrelerinde veya postmenopozal kadınların memenin adipoz stromal hücrelerinde ve periferik dokuda küçük miktarlarda sentezlendiğini kanıtlamıştır¹⁴. Serum östrojeni, yumurtalıklı fareler için keskin bir şekilde düştü, ancak elimine edilemez (Şekil 3B). Bununla birlikte, ekstragonadal dokuda sentezlenen endojen östrojen, OVF modelinde östrojen seviyelerinin stabilitesini etkilemez (Şekil 4B).

OVF modelinde bazı sınırlamalar vardır. Cerrahi operasyon dikkatli olmadığında ve yumurtalık intraperitoneal implantasyonuna yol açtığında, model başarısızlığına yol açabilir. Bu durumda, serum östrojeni keskin bir şekilde düşmez ve östrus döngüsünün farklı aşamalarında dalgalanır. Östrojen ve FSH'nin eksojen uygulamasından sonra vücudun dengeye ulaşması yaklaşık 1 hafta sürer. Bu nedenle, 1 hafta içinde meydana gelen OVF modelinin patolojik değişiklikleri FSH'nin etkilerini gösteremez.

Sonuç olarak, OVF modeli istikrarlı, düşük maliyetli ve kullanımı kolay olma avantajlarına sahiptir. Yüksek seviyeli FSH'nin sistemik etkileri, FSH'nin intraperitoneal enjeksiyonundan sonra gözlenebilir; yani, OVF modeli, FSH'nin ekstragonadal etkilerini araştıran çalışmalar için uygundur. Bununla birlikte, model cerrahi ve intraperitoneal enjeksiyon prosedürleri için gereksinimler oldukça yüksektir. Finansman yeterliyse, belirli nakavt modelleri en iyi seçimdir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
beta-estradiol 17-valerate	Macklin	E829824
Estradiol sensitive ELISA	Demeditec	DE4399
Hematoxylin Staining Solution	Beyotime	C0107
Meloxicam	Aladdin	M129228
recombinant human Follicle-stimulating hormone	Merck Serono	N19Z8803G
Tribromoethanol	Sigma	T48402	Aliphatic name: 2,2,2-Tribromoethanol