Untersuchung unabhängiger Effekte des follikelstimulierenden Hormons in vivo in einem Mausmodell

Zusammenfassung

Das follikelstimulierende Hormon (FSH) in verschiedenen extragonadalen Geweben und Organen wird mit der Pathogenese mehrerer Krankheiten in Verbindung gebracht. Das ovariektomierte und FSH-behandelte Mausmodell (OVF) kann verwendet werden, um die extragonadalen Wirkungen von FSH zu untersuchen.

Zusammenfassung

Während des Übergangs von einer reproduktiven zu einer nicht-reproduktiven Phase (Menopause) erleben viele Frauen signifikante physiologische und pathologische Veränderungen, einschließlich einer verminderten Knochenmasse, erhöhter Blutfette und erhöhter viszeraler Adipositas. Der Spiegel des follikelstimulierenden Hormons (FSH) steigt während der Wechseljahre an. Viele Studien haben gezeigt, dass FSH in verschiedenen extragonadalen Geweben und Organen mit der Pathogenese mehrerer Krankheiten verbunden ist. Daher ist es besonders wichtig, ein Tiermodell zu bauen, das helfen kann, die unabhängigen Wirkungen von FSH in vivo zu untersuchen. In dieser Studie wurden weibliche C57BL/6-Mäuse ovariektomiert und mit Östradiolvalerat (OVX + E2) ergänzt, um die Wirkung der Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse zu eliminieren. Die OVX + E2-Mäuse erhielten Lösungsmittel (N.S.) oder verschiedene Dosen rekombinantes FSH über intraperitoneale Injektion, um ein Mausmodell (OVF) zu schaffen, das sich durch relativ stabiles Östrogen und steigende FSH-Spiegel auszeichnet. So ist es uns gelungen, ein experimentelles Mausmodell zu entwickeln, das das frühe Stadium des Übergangs in die Menopause nachahmt, das durch erhöhte Serum-FSH-Spiegel gekennzeichnet ist. Das OVF-Modell hat den Vorteil, dass es stabil, kostengünstig und einfach zu bedienen ist, was für Studien geeignet ist, um die extragonadalen Wirkungen von FSH zu untersuchen. Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle für das Maus-OVF-Modell.

Einleitung

Der Spiegel des follikelstimulierenden Hormons (FSH) steigt während des Übergangs in den Wechseljahren an (der Begriff des Übergangs in den Wechseljahren wurde 2011 in den Phasen des reproduktiven Alterns Workshop (STRAW) + 10 System definiert)¹. Während des Übergangs in die Wechseljahre, einer Zeit, die durch steigende FSH-Werte und relativ stabiles Östrogen^{gekennzeichnet ist 1}, kommt es bei Frauen zu Veränderungen des Menstruationszyklus und zu signifikanten physiologischen Veränderungen, die verschiedene Zellen und Gewebe betreffen. Diese Veränderungen können die Lebensqualität und Gesundheit von Frauen ernsthaft beeinträchtigen. Die Erforschung der Auswirkungen von FSH kann die Lebensqualität und Gesundheit von Frauen verbessern.

FSH wird von gonadotropen Zellen im Hypophysenvorderlappen sezerniert und ist entscheidend für die Kontrolle der Gonadenfunktion und -fortpflanzung². Die Funktion von FSH wird durch den FSH-Rezeptor (FSHR) vermittelt, der zum G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)³ gehört. FSHR wird im Allgemeinen in Gonaden, nämlich dem Eierstock und den Hoden, ausgedrückt. Es wurde nachgewiesen, dass FSHR universell in mehreren extragonadalen Zellen und Geweben exprimiert wird, einschließlich Leber⁴, Hippocampus⁵, Osteoklasten⁶, Adipozyten⁷ und Endothelzellen⁸. Neue Studien haben extragonadale Wirkungen von FSH und seine potenzielle klinische Relevanz bei Dyslipidämie⁴, Alzheimer⁵, Osteoporose ^9,10, Atherosklerose¹¹, Fettleibigkeit⁹ und Krebs¹² gezeigt. Daher ist der Aufbau eines Tiermodells, das helfen kann, die unabhängigen Wirkungen von FSH in vivo zu untersuchen, besonders wichtig, um die Wirkungen von FSH allein zu untersuchen.

In dem Protokoll stellten wir das Verfahren zur Etablierung eines Mausmodells mit relativ stabilem Östrogen und steigenden FSH-Spiegeln^{vor 13}. Das Mausmodell ahmt den Übergang in die Menopause durch eine ovariektomierte Operation nach und wird dann mit Östradiolvalerat und rekombinantem FSH ergänzt. Da die ovariektomierten Mäuse mit exogenem Östrogen ergänzt wurden, um ähnliche Östrogenspiegel wie bei den scheinoperierten Mäusen aufrechtzuerhalten, waren die endogenen FSH-Spiegel aufgrund der Östrogenrückkopplung an der Hypophyse stabil. In diesem Zustand könnte es den FSH-Spiegel durch die Verabreichung von exogenem FSH kontrollieren, ohne den Östrogenspiegel zu verändern. Somit kann das OVF-Mausmodell den Einfluss von Östrogen ausschließen und die extragonadalen physiologischen und pathologischen Effekte von FSH beobachten. Wir glauben, dass das detaillierte und visualisierte Verfahren für Forscher nützlich ist, um das OVF-Mausmodell in ihrem Labor zu etablieren und es bei Bedarf anzuwenden, um physiologische und pathologische Veränderungen während des Übergangs in die Menopause zu untersuchen.

Protokoll

Das folgende Protokoll entsprach allen institutionellen ethischen Richtlinien für die Verwendung von Versuchstieren und wurde von der Tierethikkommission des Shandong Provincial Hospital, China, genehmigt. Alle chirurgischen Eingriffe wurden unter tiefer Betäubung durchgeführt, und die Tiere hatten zu keinem Zeitpunkt des Eingriffs Schmerzen.

1. Vorbereitung vor der Operation

1. Sterilisation von Instrumenten
   1. Chirurgische Instrumente vor der Operation in einem Autoklaven (121 °C für 15 Minuten) mit Dampf sterilisieren. Bereiten Sie ausreichend Einweg-Nahtmaterial und -Nadeln vor.
2. Einrichtung der OP-Plattform
   1. Führen Sie die Operation in einem Raum durch, der für chirurgische Eingriffe vorgesehen ist. Weisen Sie der Operation eine Bankfläche von mindestens 60 cm x 60 cm zu. Reinigen Sie die Oberfläche des Bereichs mit 75%igem Alkohol und decken Sie ihn mit einem medizinischen Einweghandtuch ab und desinfizieren Sie ihn dann 30 Minuten im Voraus mit ultravioletter Strahlung (Abbildung 1A).
3. Zubereitung von Tieren
   1. Unterbringung aller Tiere in einem klimatisierten Raum (20-25 °C) mit einem Zyklus von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkel. Akklimatisieren Sie 8 Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse 1 Woche vor der Operation in der Haltungsanlage.
   2. Wiegen Sie die Mäuse vor der Operation. Verabreichen Sie allen 9 Wochen alten weiblichen Mäusen eine Vollnarkose durch intraperitoneale Injektion von Tribromethanol (280 mg/kg), um in jeder Phase des Eingriffs Schmerzfreiheit zu erreichen. Meloxicam (2 mg/kg) ca. 1 h vor einer Operation zur Schmerzlinderung subkutan injizieren.
   3. Tragen Sie Augensalbe auf, um Hornhauttrockenheit während der Operation zu verhindern.
   4. Tragen Sie die Haarentfernungslotion mit einem sauberen Wattestäbchen auf den Rücken auf. Lassen Sie die Lotion 3-5 Minuten auf einer Maus einwirken, entfernen Sie dann die Haare mit Gaze und Wattestäbchen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Haare von der Rückseite der Maus entfernt wurden.
   5. Verwenden Sie Mulltücher und Wattestäbchen, um die Haut mit 75%igem Alkohol zu reinigen. Befestigen Sie die Maus mit einem Gummistreifen oder einem Baumwollseil auf der Operationsplattform (Abbildung 1B) und tragen Sie Iodophorlösung auf, um den Rücken zu reinigen.
      HINWEIS: Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch eine Zehenkneifung vor der Ovariektomie.

2. Ovariektomie

HINWEIS: Tribromethanol kann ca. 30 Minuten lang aufrechterhalten werden, um sicherzustellen, dass die Operation so weit wie möglich abgeschlossen wird.

1. Machen Sie mit einem Einwegskalpell einen ~1,0 cm langen dorsalen Schnitt in Längsrichtung von der Oberschenkelbasis nach oben, wobei Sie darauf achten, dass nur die Haut und die subkutane Faszie eingeschnitten werden, und vermeiden Sie zu diesem Zeitpunkt einen Schnitt in das hintere Bauchfell.
2. Ziehen Sie den Schnitt nach links, und es ist ein weißes Fettpolster zu sehen. Schneiden Sie ~0,5 cm entlang des weißen Fettpolsters, um die intraperitoneale Höhle mit einer Mikropinzette und einer Schere freizulegen.
3. Nach der Durchtrennung des hinteren Bauchfells wird das weiße Fettpolster langsam und vorsichtig mit einer Mikrozange aus der Intraperitonealhöhle entfernt. Befeuchten Sie das weiße Fettgewebe sofort mit 0,9% steriler Kochsalzlösung außerhalb der getränkten Gaze. Halten Sie freiliegendes Gewebe immer feucht, wenn Sie sich außerhalb der Bauchhöhle befinden.
4. Eine rosafarbene körnige Substanz, nämlich der Eierstock, ist am unteren Teil des weißen Fettpolsters befestigt (Abbildung 2A). Die Eierstöcke sind mit einem schmalen Gang, nämlich der Gebärmutter, verbunden. Verwenden Sie 5-0 resorbierbare Nähte, um das ovarielle Ende der Gebärmutter zu ligieren und den linken Eierstock zu entfernen (Abbildung 2B).
5. Bei der Entfernung eines Eierstocks ist darauf zu achten, dass das umliegende Fettgewebe so weit wie möglich erhalten bleibt. Vermeiden Sie den direkten Kontakt zwischen chirurgischen Instrumenten und den Eierstöcken und verhindern Sie die intraperitoneale Implantation von Eierstockgewebe.
6. Legen Sie das weiße Fettpolster vorsichtig wieder in die Intraperitonealhöhle. Führen Sie eine einfache intermittierende Naht am hinteren Peritoneum mit einer 5-0 resorbierbaren Naht durch (Abbildung 2C). Nachdem die Naht abgeschlossen ist, reinigen Sie alle Blutungen mit 0,9 % steriler, mit Kochsalzlösung getränkter Gaze.
7. Ziehen Sie den Hautschnitt nach rechts und entfernen Sie den rechten Eierstock mit der gleichen Methode.
8. Führen Sie eine intermittierende Naht mit 4-0 nicht resorbierbaren Nähten durch und reinigen Sie alle Blutungen mit 0,9 % steriler, mit Kochsalzlösung getränkter Gaze (Abbildung 2D).
9. Reinigen Sie die Wunde mit einer Jodophorlösung, nachdem Sie beide Nähte abgeschlossen haben. Intraperitoneale Injektion von Breitbandantibiotika.

3. Beobachtung nach der Operation

1. Legen Sie die Mäuse nach der Operation auf eine 37 °C heiße Decke mit konstanter Temperatur. Bis sich die Mäuse frei bewegen können, halten Sie die Tiere in ihrem individuellen Käfig. Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder zu Bewusstsein gekommen ist, um das Brustbein zu halten.
2. Meloxicam (2 mg/kg) 24 Stunden nach der Operation subkutan injizieren, um die Schmerzen zu lindern.
3. Überwachen Sie die Mäuse täglich, um sicherzustellen, dass die Operationswunde richtig heilt und keine Anzeichen von Komplikationen (Dehiszenz) vorhanden sind.

4. Östradiol-Supplementierung

1. Bereiten Sie Futter zu, das mit Östradiolvalerat ergänzt ist. Verwenden Sie 2,6 mg Beta-Östradiol-17-Valerat pro 1 kg Futter.
2. 3 Tage nach Abschluss der Operation füttern Sie die Mäuse mit Östradiolvalerat.

5. FSH-Injektion

1. Bereiten Sie eine rekombinante humane FSH-Lösung vor. Rekombinantes humanes FSH-Pulver zur Injektion mit 0,9 % steriler Kochsalzlösung auf 100 I.E./ml auflösen.
2. Gruppieren Sie Mäuse nach Versuchsplänen und verabreichen Sie 2 Wochen lang Lösungsmittel oder verschiedene Dosen rekombinantes FSH durch intraperitoneale Injektion. Entsprechend der biologischen Aktivität von rekombinantem FSH ist die Injektionsdosis von FSH bei Mäusen anzuwenden, die dem Serum-FSH-Spiegel bei Frauen während der Übergangsphase in den Wechseljahren entspricht.
   HINWEIS: Basierend auf verschiedenen Behandlungen wurden ovariektomierte östrogenergänzte Mäuse nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen eingeteilt: Lösungsmittelgruppe (N.S.), die 100 μl/Tag Lösungsmittel erhielt, niedrig dosierte FSH-GRUPPE (L-FSH), die 15 IE/kg Körpergewicht pro Tag erhielt, und hochdosierte FSH-GRUPPE (H-FSH), die 30 IE/kg Körpergewicht pro Tag erhielt.

Diskussion

Während des Übergangs von einer reproduktiven zu einer nicht-reproduktiven Phase (Menopause) erleben viele Frauen erhebliche physiologische und pathologische Veränderungen. Der FSH-Spiegel steigt während der Wechseljahre an¹. Neue Studien haben gezeigt, dass FSH in verschiedenen extragonadalen Geweben und Organen entscheidend für die Pathogenese mehrerer Krankheiten ist, darunter Dyslipidämie⁴, Alzheimer-Krankheit⁵, Osteoporose ^9,10, Atherosklerose¹¹, Fettleibigkeit⁹ und Krebs¹². Daher ist es besonders wichtig, ein Tiermodell zu bauen, das helfen kann, die unabhängigen Wirkungen von FSH in vivo zu untersuchen. Das OVF-Mausmodell ahmt das frühe Stadium des Übergangs in die Menopause mit relativ stabilem Östrogen und steigenden FSH-Spiegeln nach und eignet sich besonders für Studien zur Untersuchung der extragonadalen Wirkungen von FSH.

Bei dieser Methode wurde die Ovariektomie mit einem einzigen dorsalen Rückenschnitt ca. 1 cm von der Oberschenkelbasis aufwärts durchgeführt (Abbildung 1B). Die Haut wurde mit einer scharfen Präparierschere fast zusammen mit den Rückenmuskeln durchtrennt und so in die Bauchhöhle gelangt. Nach der Operation musste der Muskelschnitt nicht genäht werden und die Hautwunde wurde beidseitig mit einer Catgut-Naht verschlossen (Abbildung 2). Die Operation ist technisch einfacher, weniger zeitaufwändig und weniger schädlich für weibliche Mäuse im Vergleich zu anderen Methoden.

Einige Details, die während des chirurgischen Eingriffs beachtet werden sollten. Zunächst sollten alle chirurgischen Eingriffe sauber und so steril wie möglich gehalten werden, um das Risiko einer postoperativen Infektion zu verringern. Zweitens, da das Eierstockgewebe sehr zerbrechlich ist, können chirurgische Instrumente während der Ovariektomie nicht direkt mit den Eierstöcken in Kontakt kommen, um eine intraperitoneale Implantation zu vermeiden. Drittens wurden die Mäuse nach der Operation während der Genesung auf eine 37 °C heiße Decke mit konstanter Temperatur gebracht, um eine postoperative Unterkühlung zu verhindern, die zum Tod führte.

Eine frühere Studie hat gezeigt, dass endogenes Östrogen in den Thekazellen der Eierstöcke prämenopausaler Frauen oder in Fettstromazellen der Brust von postmenopausalen Frauen und in geringen Mengen im peripheren Gewebe synthetisiert wird¹⁴. Das Serumöstrogen sank bei ovariektomierten Mäusen stark, kann aber nicht eliminiert werden (Abbildung 3B). Das endogene Östrogen, das im extragonadalen Gewebe synthetisiert wird, hat jedoch keinen Einfluss auf die Stabilität des Östrogenspiegels im OVF-Modell (Abbildung 4B).

Das OVF-Modell weist einige Einschränkungen auf. Sobald der chirurgische Eingriff nicht vorsichtig ist und zu einer intraperitonealen Implantation der Eierstöcke führt, kann er zum Versagen des Modells führen. In diesem Fall fällt das Serumöstrogen nicht stark ab und schwankt in verschiedenen Stadien des Brunstzyklus. Nach exogener Gabe von Östrogen und FSH dauert es ca. 1 Woche, bis der Körper ins Gleichgewicht kommt. Somit können pathologische Veränderungen des OVF-Modells, die innerhalb von 1 Woche auftreten, nicht auf die Auswirkungen von FSH hinweisen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das OVF-Modell die Vorteile hat, stabil, kostengünstig und einfach zu bedienen zu sein. Die systemischen Wirkungen von hochdosiertem FSH können nach intraperitonealer Injektion von FSH beobachtet werden; Das heißt, das OVF-Modell eignet sich für Studien, die die extragonadalen Wirkungen von FSH untersuchen. Die Anforderungen an Modellchirurgie und intraperitoneale Injektionsverfahren sind jedoch recht hoch. Wenn die Finanzierung ausreicht, sind spezifische K.O.-Modelle die beste Wahl.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
beta-estradiol 17-valerate	Macklin	E829824
Estradiol sensitive ELISA	Demeditec	DE4399
Hematoxylin Staining Solution	Beyotime	C0107
Meloxicam	Aladdin	M129228
recombinant human Follicle-stimulating hormone	Merck Serono	N19Z8803G
Tribromoethanol	Sigma	T48402	Aliphatic name: 2,2,2-Tribromoethanol