Terapötik Hematopoietik Kök/Progenitör Hücrelerin Toplanması için İn Vivo Osteo-organoid Yaklaşım

Özet

Burada, hasarlı bir hematopoietik ve bağışıklık sisteminin yeniden inşası için terapötik hematopoietik kök/progenitör hücreleri hasat etmek için kemik morfogenetik protein-2 yüklü jelatin iskeleler tarafından tetiklenen in vivo osteo-organoidler kurduk. Genel olarak, bu yaklaşım hücre tedavileri için umut verici bir hücre kaynağı sağlayabilir.

Özet

Hematopoetik kök hücre nakli (HKHT) için yeterli sayıda terapötik hematopoetik kök/progenitör hücre (HSPC) gerekir. Yeterli bir HSPC kaynağını belirlemek için, rekombinant insan kemiği morfogenetik protein-2 (rhBMP-2) ile yüklü iskeleleri farelerde uyluk kemiğinin yakınındaki bir iç kas kesesine implante ederek in vivo bir osteo-organoid geliştirdik. İmplantasyondan 12 hafta sonra, in vivo osteo-organoidleri aldık ve HPSC'ler üzerinde akış sitometrisi analizi yaptık, bu da in vivo osteo-organoidler içinde önemli bir HSPC alt kümesinin varlığını ortaya çıkardı.

Daha sonra farelerde radyasyon yoluyla hematopoietik / bağışıklık sistemi hasarının ölümcül olmayan bir modelini oluşturduk ve ekstrakte edilen osteo-organoid türevli hücreleri radyasyonlu farelerin periferik kanına enjekte ederek hematopoietik kök hücre nakli (HSCT) gerçekleştirdik. Hematopoietik iyileşmenin etkisi hematolojik, periferik kan kimerizmi ve solid organ kimerizmi analizleri ile değerlendirildi. Sonuçlar, in vivo osteo-organoid türevli hücrelerin, ışınlanmış farelerde hasarlı periferik ve katı bağışıklık organlarını hızlı ve verimli bir şekilde yeniden yapılandırabildiğini doğruladı. Bu yaklaşım, HSCT için alternatif bir HSPC kaynağı olarak potansiyele sahiptir ve daha fazla sayıda hastaya fayda sağlar.

Giriş

Hematopoetik kök hücre nakli, çeşitli hematolojik malignitelerin yanı sıra çok sayıda kalıtsal ve otoimmün bozukluk için geleneksel tedavi olarak durmaktadır 1,2,3,4. Bununla birlikte, hematopoietik kök/progenitör hücrelerin (HSPC'ler) sınırlı miktarı ve kökeni, hematopoietik kök hücre naklinin (HSCT) klinik uygulamasının önünde önemli bir engel olarak ortaya ^{çıkmıştır5,6}.

Büyük ölçekli in vitro hücre genişlemesi, terapötik hücrelerin toplanması için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir ^5,7. Çeşitli çalışmalar, tipik olarak kendini yenileyen agonistlerin (sitokinler ve büyüme faktörleri gibi) ve serum albümininin bir kombinasyonunun kullanılması yoluyla HSPC'leri in vitro olarak kendi kendini yenilemeye teşvik eden ve HSPC'lerin ex vivo genişlemesine neden olan koşullar geliştirmiştir⁸. Bununla birlikte, mevcut yöntemlerin, genişletilmiş HSPC'lerin kendi kendini yenileme kapasitesini korumak için hala zaman alıcı ve zorlu olduğunu belirtmek önemlidir⁹.

Yukarıda bahsedilen yöntemin aksine, in vivo hücrelerin toplanması yeni ve yenilikçi bir strateji sunmaktadır. Bu yaklaşım, doğal kemik iliği yapısını taklit eden bir in vivo osteo-organoidin^{kurulmasını içerir 10,11}. Bunu başarmak için, HSPC'ler de dahil olmak üzere bol ve yüksek kaliteli otolog hücre kokteylleri elde etmek için kemik morfogenetik protein-2 (BMP-2) yüklü jelatin iskeleleri kullanarak in vivo osteo-organoidler oluşturuyoruz. Bu osteo-organoidleri terapötik olarak uygulayarak, ışınlama hasarını başarılı bir şekilde tedavi ettik ve osteo-organoidlerden türetilen HSPC'lerin deneysel olarak bozulmuş bağışıklık sistemini hızlı ve stabil bir şekilde yeniden oluşturabileceğini gösterdik.

Protokol

8-10 haftalık erkek ve dişi C57BL/6 fareleri çalışmaya dahil edildi. Tüm fareler, Doğu Çin Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'nin hayvan tesisine yerleştirildi. Tüm deneysel prosedürler, Doğu Çin Bilim ve Teknoloji Üniversitesi (ECUST-21010) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komiteleri tarafından onaylandı.

1. Biyoaktif iskele imalatı

1. Hazırlık
   1. Temizlenmiş ve kurutulmuş cerrahi makası ve cımbızı 1.000 mL'lik bir behere koyun. Beherin ağzını emici kağıtla sarın ve pamuk ipliği ile sıkıca bağlayın.
   2. Beheri yüksek basınçlı sterilizatöre yerleştirin, kapağı sıkıca kapatın, sterilizasyon programını 30 dakika boyunca 121 °C'ye ayarlayın ve sterilizasyon programını başlatın.
   3. Sterilizasyon işleminin tamamlanmasından sonra, sterilize edilmiş kabı çıkarın ve kurutma için 60 °C'ye ayarlanmış bir kurutma fırınına aktarın. Tamamen kuruduktan sonra behere %75 (h/h) alkol püskürtün ve temiz tezgahın üzerine koyun.
   4. İşlemden 2 saat önce rhBMP-2 stok çözeltisini (1.0 mg / mL) çözün.
   5. Oda sıcaklığına çözüldükten sonra, rhBMP-2 stok çözeltisini ve açılmamış jelatin süngeri, biyoaktif iskelelerin imalatı için steril temiz tezgaha aktarın.
      1. Jelatin süngeri (60 mm x 20 mm x 5 mm) sterilize makasla 48 eşit boyutta parçaya (5 mm x 5 mm x 5 mm) (Şekil 1B) kesin ve bunları 48 oyuklu bir plakaya aktarın.
      2. rhBMP-2 stok solüsyonunu, kabarcıkları önlemek için eşit şekilde karıştırmayı sağlamak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Solüsyondan 30 μL aspire edin ve jelatin süngere damla damla ekleyin.
      3. Sonraki dondurarak kurutma işlemini kolaylaştırmak için 48 oyuklu plakayı bir kat parafilm kullanarak kapatın. Jelatin süngeri içeren plakayı temiz tezgahtan çıkarın. Donması için -20 °C'ye koyun. Aynı anda dondurarak kurutma makinesini açın ve -50 °C ila -60 °C sıcaklık aralığına kadar önceden soğutun.
      4. 2 saat dondurduktan sonra, jelatin süngerli kuyu plakasını 12 saat dondurarak kurutucuya koyun. Numunelerin kuruluğunu ve sterilitesini korumak için, dondurarak kurutmadan sonra kuyu plakasını kapatmak için ek bir parafilm tabakası uygulayın. -20 °C buzdolabında, saklayınız.

2. Biyoaktif iskelelerin cerrahi implantasyonu

NOT: Tüm cerrahi aletler kullanım için sterilize edilmiştir.

1. Anesteziden önce fareleri 1 saat aç bırakın. Göz bölgesindeki kuruluğun neden olduğu ameliyat sonrası rahatsızlığı azaltmak için farelerin göz çevresine kayganlaştırıcı bir veteriner merhemi sürün. Fareleri% 1 (a / h) pentobarbital sodyum çözeltisinin (48 mg / kg'lık bir dozda) intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezize edin.
   NOT: Bu protokol, sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyon ile etik olarak onaylanmış anestezi yöntemini kullanır. İzofluran inhalasyonu veya intraperitoneal ketamin-ksilazin enjeksiyonu gibi diğer yöntemler de onaydan sonra kullanılabilir.
2. Sırtüstü bir farede aşağıdaki işaretleri arayarak farelerde anestezi derinliğini doğrulayın: sabit kalp atışı ve solunum, gevşemiş kaslar, hareketsiz uzuvlar, dokunmaya yanıt vermeyen bıyıklar ve pedal refleksinin olmaması. Ek olarak, farelerin derisini dişli forseps ile sıkıştırın veya farelerin ayak parmaklarını veya pençelerini uyarın. Fareler hassas reaksiyonlar gösterirse, anestezi çok hafiftir; Ek anestezi uygulayın. Anestezik düzlem elde edildikten sonra, biyoaktif iskeleyi sol bacağa kolayca implante etmek için fareleri sağ lateral yatık pozisyonda cerrahi alana aktarın.
3. Bir tıraş makinesi kullanarak sol bacağınızdaki kılları tıraş edin. Traş edilmiş bölgeyi her biri 3 kez alternatif klorheksidin ve alkol turları kullanarak dezenfekte edin ve vastus lateralis kasının yan tarafında bulunan arka bacakta kesikler oluşturun. Kaval kemiği yönü boyunca uzanan yaklaşık 3.0 mm uzunluğunda kesiler yapmak için oftalmik makas kullanın.
   NOT: Ameliyat sırasında steril koşulları korumak için, kullanılan cerrahi malzemeler belirlenen yerlerde saklanmalıdır. Operatör dışındaki kişilerle teması önlemek için steril malzemeler temiz bir alana yerleştirilmelidir. Tekrar kullanılabilir cerrahi aletler derhal %75 (h/h) etanol ile dezenfekte edilmelidir. Yaraların havaya maruz kalmasını azaltmak ve enfeksiyon riskini azaltmak için ameliyat süresini en aza indirin.
4. İmplant için cep oluşturmak için, vastus lateralis kasının distal tarafındaki fasyayı tibiaya doğru açın.
5. Biyoaktif iskeleyi yaklaşık 5 mm yüksekliğinde ve 5 mm çapında bir silindire dönüştürmek için oftalmik forseps kullanın. İskeleyi, oftalmik makasla oluşturulan kas yarığı boyunca kas cebine implante edin ve implant cebini fasya boyunca kesintili bir dikiş deseni ile kapatın. Cilt kesisini 4-0 dikiş kullanarak kapatın.
   NOT: Cerrahi prosedür sırasında hayvanlarda konvülsiyon veya idrara çıkma meydana gelmesi, acil önlemlerin derhal uygulanmasını gerektiren aşırı derin anesteziyi gösterir.
6. 2.3-2.5 adımlarını tekrarlayın ve farelerin sağ femur kas kesesine başka bir biyoaktif iskele yerleştirin. Enfeksiyonu önlemek için ameliyattan sonra farelerin cerrahi ve enjeksiyon bölgelerini temizlemek için iyot çubukları kullanın.
   NOT: Her vastus lateralis kasına sadece bir implant yerleştirilebilir.
7. Fareleri, deneyden sonra uyanana kadar 37 ° C'de sabit sıcaklıktaki bir platforma yerleştirin. Kan birikmesini önlemek için fareleri her 10-15 dakikada bir ters çevirin. Ameliyattan sonra, sıcaklığı korumanın yanı sıra, sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözetimsiz bırakmadan ameliyat sonrası fareleri izleyin. Farelerin kalp atış hızı ve solunum hızı gibi önemli göstergelerine çok dikkat edin.
   NOT: Farelerde ön ayakların titremesi, iyileşme aşamasının başladığını gösterir.
8. Fareleri alkol püskürtme ve ultraviyole ışınlama ile dezenfekte edilmiş steril bir kafese geri koyun. Ameliyat geçiren hayvanı tamamen iyileşene kadar diğer hayvanlarla birlikte koymayın. Ek olarak, ameliyat sonrası ağrıyı yönetmek için en az bir gün boyunca meloksikam uygulayın ve daha yoğun ağrı yönetimi için üç güne kadar uzatma seçeneği vardır. Olası yan etkileri belirlemek için ameliyattan sonraki 72 saatlik süre boyunca hayvanı ve yarayı düzenli olarak kontrol edin. Enfeksiyon daha sonra tespit edilirse, önce fareleri% 1 (a / h) pentobarbital sodyum çözeltisinin (48 mg / kg'lık bir dozda) intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla uyuşturarak hayvanları ötenazi yapın, ardından anesteziden sonra servikal çıkık yapın.

3. İmplantasyondan 12 hafta sonra in vivo osteo-organoidlerin karakterizasyonu

NOT: Biyoaktif iskeleler, implantasyondan sonra osteo-organoidler oluşturmak için in vivo olarak gelişecektir.

1. İn vivo osteo-organoidlerin toplanması
   1. İn vivo osteo-organoidler 12 hafta boyunca implante edildiğinde, fareleri% 1 (a / h) pentobarbital sodyum çözeltisinin (48 mg / kg'lık bir dozda) intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezik hale getirin, ardından anesteziden sonra servikal çıkık yapın.
      NOT: Hayvanlara verilen zararı en aza indirmek için, fareler ötenaziden önce servikal çıkık ile uyuşturulmalıdır.
   2. Diseksiyon bölgesinde cilde %75 (h/h) alkol püskürtün.
   3. Arka bacakları gövdeden ayırın ve minyatür makas kullanarak kasları osteo-organoidlerden dikkatlice çıkarın.
   4. Bağlı yumuşak dokuları gazlı bezle çıkarın.
   5. Bazı osteo-organoidleri, histolojik analiz için oda sıcaklığında 24 saat boyunca% 4 (h / h) paraformaldehit (PFA) çözeltisine sabitleyin. HPSC'lerin makroskopik fotoğrafçılığı ve akış sitometrisi analizi için kalan örnekleri kullanın.
2. Makroskopik görüntüler
   1. Osteo-organoidleri mavi bir arka plan plakasına yerleştirin ve bir dijital kamera ile fotoğraflayın.
3. Histolojik analiz
   1. Histolojik boyama için hazırlık
      1. Osteo-organoidleri PFA çözeltisinden ultra saf suya aktarın ve 1 saat bekletin.
      2. 1 hafta boyunca kireç çözme için ultra saf suyu 0,5 M etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ile değiştirin.
      3. Kireçten arındırılmış dokuları bir gömme kasetine yerleştirin ve kaseti 1 saat boyunca ultra saf suya batırın.
      4. Gradyan dehidrasyonu için, gömme kasetini her biri 1 saatlik bir süre boyunca değişen konsantrasyonlarda (v/v): %75, %80, %90 ve %95'te etanole daldırın, ardından %100 (h/h) etanol I ve II'ye her biri 1 saat daldırın.
         NOT: "%100 (h/h) etanol I ve II", gömme kasetinin %100 (h/h) etanol ile doldurulmuş "kap I"e bir kez daldırılması ve ardından %100 (h/h) etanol ile doldurulmuş "kap II"ye ikinci kez daldırılması gerektiğini belirtir.
      5. Dehidrasyondan sonra, gömülü dokuları sırayla 1 saat boyunca %100 (h/h) ksilen ve mutlak etanol (ksilen: etanol hacim oranı 1:1) ve her biri 30 dakika boyunca %100 (h/h) ksilen I ve II karışımına yerleştirin.
      6. Dokuları, her biri 2 saat boyunca 60 ° C'lik sabit bir sıcaklıkta parafin I ve II'ye daldırın.
      7. Balmumuna batırılmış dokuları bir gömme makinesi kullanarak gömmek için, erimiş mumu gömme kalıbına yerleştirin. Balmumu katılaşmadan önce, dokuları dehidrasyon kabından çıkarın ve gömme kalıbına yerleştirin; Onları buna göre etiketleyin. Kalıbı -20 °C donma durumunda soğutun ve balmumu katılaştıktan sonra balmumu bloğunu gömme kalıbından çıkarın ve düzeltin.
      8. Gömülü balmumu bloklarını bir parafin dilimleyici kullanarak 4,5 μm kalınlığında bölümler halinde dilimleyin ve ardından bölümleri cam slaytlara yapıştırın.
      9. Bölümleri 40 °C'de kısa bir süre pişirin ve ardından bir numune kutusunda toplayın ve saklayın.
   2. H & E boyama
      1. Bölümleri bir numune rafına yerleştirin ve 60 °C'de kurutma fırınında 30 dakika pişirin.
      2. Ksilen ve etanoldeki bölümleri deparafinize edin. Parafin bölümlerini sırayla 10 dakika ksilen I, 10 dakika ksilen II, 10 dakika ksilen III, 5 dakika mutlak etanol I, 5 dakika mutlak etanol II, 5 dakika boyunca %90 (h/h) etanol, 5 dakika boyunca %80 (h/h) etanol, 5 dakika boyunca %70 (h/h) etanol, 5 dakika boyunca %50 (h/h) etanol içine yerleştirin ve gradyan mum alma işlemi için saf suya aktarın.
      3. Bölümleri 2 dakika hematoksilen boyama solüsyonuna batırın, ardından 10 dakika akan suda durulayın.
      4. Bölümleri 2 dakika boyunca eozin boyama solüsyonuna batırın.
      5. Bölümleri sırayla 2 dakika boyunca %75 (h/h) etanole, 2 dakika boyunca %85 (h/h) etanole, 5 dakika mutlak etanole, 5 dakika mutlak etanole ve dehidrasyon için 5 dakika ksilene yerleştirin.
      6. Bölümleri ksilenden çıkarın ve nötr balsamla kapatın.
      7. Mikroskop altında kesitleri gözlemleyin ve nötr balsam kuruduktan sonra 10x büyütme ile temsili görüntüler yakalayın.
4. HPSC'ler için akış sitometrisi analizi
   1. Adım 3.1'den elde edilen in vivo osteo-organoidleri bir harç içine yerleştirin ve uygun miktarda boyama tamponu ekleyin. Osteo-organoidleri oftalmik makas kullanarak 1-3 mm çapında parçalar halinde kesin ve harç ve havaneli kullanarak boyama tamponunda ezin. Hücre hayatta kalma oranındaki düşüşü önlemek için bir havaneli kullanarak in vivo osteo-organoidlerin parçalarını öğütmek yerine dikey olarak bastırın.
   2. Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne toplayın ve 300 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
   3. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 3-5 dakika parçalamak için 1 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin.
   4. Hücreleri 1 mL boyama tamponu ile yıkayın ve 300 gözenekli bir naylon filtreden 5 mL akış sitometri tüpüne süzün.
   5. 300 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Akış sitometri tüpünün dibinde kalan yaklaşık 100 μL'yi (hücreleri) canlı / ölü boyama kiti, Peridinin klorofil proteini-Siyanin5.5 (PerCp-Cy5.5) -anti-soy kokteyli (1:10), Fikoeritrin-Siyanin5 (PE-Cy5) -anti-c-kit (1:200), Alexa Fluor 700 (AF700) -anti-Kök hücre antijeni-1 (Sca-1) (1:200), Brilliant Violet 711 (BV711) -anti-CD16 / 32 (1:200), biyo-anti-CD34 (1:200), BV421-anti-CD127 (1:200), PE-CF594-anti-CD135 (1:200), BV510-anti-CD48 (1:200) ve PE-Cy7-anti-CD150 (1:200).
   6. Hücreleri Ca^{2 +} ve Mg^{2 +} içermeyen 1 mL Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile yeniden süspanse edin ve 300 ° C'de 5 dakika boyunca 4 × g'da santrifüjleyin.
   7. Süpernatanı aspire edin ve 4 ° C'de 60 dakika daha PE-streptavidin ikincil antikoru (1:200) ile boyayın.
   8. Hücreleri 1 mL HBSS (Ca^{2 +}, Mg^{2 +} yok) ile yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
   9. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 300 μL HBSS (Ca^{2 +}, Mg^{2 +} yok) ile yeniden süspanse edin.
   10. Daha fazla akış sitometrisi analizi yapmak için çözeltiyi vorteksleyin. HSPC'ler hakkında kantitatif veriler elde etmek için akış sitometrisi yazılımı kullanarak elde edilen verileri daha fazla analiz edin.
       NOT: Akış sitometrisinin veri toplama ve analizi, HSPC'leri¹⁰ tanımlamak için kullanılan tipik geçit stratejileri için önceki makalelerimize ve destekleyici materyallere (Ek Şekil S1) atıfta bulunur.
   11. Bir yan saçılma alanı (SSC-A) ve ileri saçılma alanı (FSC-A) nokta grafiği oluşturun ve bir akış sitometresinde veri toplama sırasında SSC-A ve FSC-A nokta grafiğinde ilgilenilen hücre popülasyonunun (P1) çevreleyen bölgesini geçitleyin. P1 kapısına çift tıklayın; ilk hücre yapışma işlemini gerçekleştirmek için X ekseni için ileri saçılma yüksekliğini (FSC-H) ve Y ekseni için ileri saçılma genişliğini (FSC-W) seçin. Tek hücre kapısına çift tıklayın; ikinci hücre yapışma işlemini gerçekleştirmek için X ekseni için yan saçılma yüksekliğini (SSC-H) ve Y ekseni için yan saçılma genişliğini (SSC-W) seçin. Tek hücreleri seçmek için dikdörtgen geçit aracını kullanın.
   12. Ölü hücreleri hariç tutun. Canlılık belirteçlerini tespit ederek canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırt edin. SSC-A ile Live/Dead arasında bir nokta grafiği oluşturun ve canlı hücrelere karşılık gelen bölgeyi "canlı hücreler" olarak adlandırın.
   13. "Canlı hücrelerde" spesifik antikorlarla etiketlenmiş hücreleri tarayın. Miyeloid hematopoietik kök / progenitör hücre soyundaki soya özgü antikorların pozitif ekspresyonundan etkilenebilecek hücre popülasyonunu, soy negatif (lin^-) geçit kullanarak hariç tutun. Lin- hücrelerini ^kapılayın .
   14. Lin^- hücreleri içindeki farklı hücre alt popülasyonlarını tarayın. ^Lin-cells kapısına çift tıklayın; X ekseni için Sca-1-AF700'ü ve Y ekseni için c-kit-PE-Cy5'i seçin. C-kit ⁺ Sca-1^- hücrelerini LKS^- hücreleri olarak, c-kit ⁺ Sca-1 ⁺ hücrelerini LKS ⁺ hücreleri olarak ve c-kit ve Sca-1 ekspresyonu düşük olan hücreleri LK^loS^lo hücreleri olarak kapılayın. LKS^- kapısına çift tıklayın ve X ekseni için CD34-PE'yi ve Y ekseni için FCγR-BV711'i seçin. LKS⁺ kapısına çift tıklayın; X ekseni için FIt3-PE-CF594'ü ve Y ekseni için IL7Rα-BV421'i seçin ve X ekseni için CD150-PE-Cy7'yi ve Y ekseni için CD48-BV510'u seçin.
   15. Antikorların özgüllüğüne dayanarak, hücre alt popülasyonlarını ayırt etmek için pozitif veya negatif kapıları tanımlayın: hematopoietik kök hücreler (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁺CD48−CD150⁺) ve farklılaşmış hematopoietik progenitörler: multipotent progenitörler (Lin⁻c-kit⁺Sca-1+CD48⁻CD150⁻), ortak lenfoid progenitörler (Lin⁻c-kit-Sca-1-Flt3⁺IL7Rα⁺), yaygın miyeloid progenitörler (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁺FCγR⁻), granülosit-monosit progenitörleri (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁺FCγR⁺) ve megakaryosit eritroid progenitörleri (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁻FCγR⁻).

4. Fare ışınlama modeli

NOT: C57BL/6 fareleri, bir X-ışını ışınlayıcı kullanılarak X-ışınları ile ışınlandı.

1. Hematopoietik / bağışıklık sisteminde ölümcül olmayan bir bozulma elde etmek için, 5 Gri (Gy) fosfat tamponlu salin (PBS) ile tedavi edilen grupta, 5 Gy doğal kemik iliği (BM) ile tedavi edilen grupta vahşi tip (WT) fareleri ve 5 Gy osteo-organoidlerle tedavi edilen grubu transplantasyondan 24 saat önce 5 Gy ışınlamasına (1.25 Gy / dak) maruz bırakın.
   NOT: 0 Gy PBS ile tedavi edilen gruptaki WT farelerinin PBS ile tedavi edildiğinden ve ışınlamaya tabi tutulmadığından emin olun.

5. Hücre tedavisi süreci

NOT: Tüm işlemler steril koşullarda yapılmalıdır.

1. İn vivo osteo-organoid türevli ve doğal kemik iliği türevli hücrelerin edinilmesi
   1. C57BL / 6.SJL-Ptprca Pepcb / BoyJ (CD45.1) farelerinin kas kesesine iki biyoaktif iskele yerleştirin ve in vivo osteo-organoidleri oluşturmak için 12 hafta boyunca inkübe edin. Yukarıda belirtilen bir CD45.1 faresinden iki in vivo osteo-organoid ve iki femur hasat edin. Daha sonra, forseps ve gazlı bez kullanarak osteo-organoidlerin ve femurların yüzeyindeki yumuşak dokuyu temizleyin.
   2. Osteo-organoidleri ve femurları ayrı ayrı bir harç içine yerleştirin ve 1 mL HBSS ekleyin (Ca^{2 +}, Mg^{2 +} yok).
      NOT: Ca^{2 +} ve Mg^{2 +} içermeyen HBSS, hücre agregasyonunu azaltabilir. Transplantasyon için kullanılan solüsyon, herhangi bir potansiyel reddetme reaksiyonunu önlemek için serum bileşenleri içermemelidir.
   3. Numuneleri cerrahi makasla kesin ve bir havan ve havan tokmağında hafifçe ezin.
   4. Hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin ve 300 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
   5. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletlerini 300 μL HBSS (Ca^{2 +}, Mg^{2 +} yok) ile yeniden süspanse edin. Osteo-organoid türevli hücrelerin veya tüm kemik iliği hücrelerinin bir süspansiyonunu elde etmek için iyice karıştırın.
      NOT: İn vivo osteo-organoidden türetilen hücre kokteyllerini tam olarak kullanmak için, tedavi için tüm kemik iliği hücrelerini kullanmayı seçtik. İn vivo osteo-organoidin neden olduğu 30 μg'lık bir BMP-2'deki tipik toplam hücre sayısı 30.000.000-40.000.000'dir.
2. Orbital venöz sinüs enjeksiyonu
   NOT: İn vivo osteo-organoidlerden veya femurlardan toplanan CD45.1⁺ tam kemik iliği hücreleri, orbital venöz sinüs yoluyla sırasıyla subletal olarak ışınlanmış C57BL / 6 (CD45.2) alıcısına enjekte edildi. Orbital venöz sinüs enjeksiyonu ve kuyruk ven enjeksiyonu hayvan deneylerinde yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Orbital venöz sinüs enjeksiyonu, yeni başlayanlar için basitliği ve düşük başarısızlık oranı nedeniyle seçildi. Orbital enjeksiyon işlemi sırasında, farelerin önceden uyuşturulması, hipotermi riskini azaltmak için ısıtılmış bir plaka kullanılması ve hareketi önlemek için farelerin mekanik olarak kısıtlanması gibi bazı koruyucu önlemlerin alınması gerekir.
   1. CD45.2 farelerini bir preanestezi odasına yerleştirin ve izofluran kullanarak anesteziyi indükleyin. Kuruluğu önlemek ve izofluranın neden olduğu oküler tahrişlere karşı koymak için farelerin göz çevresine kayganlaştırıcı bir veteriner merhemi sürün.
      NOT: Hayvanlara verilen zararı en aza indirmek için, orbital venöz sinüs enjeksiyonundan önce farelere izofluran anestezisi uygulanır.
   2. Daha fazla anestezi için fareleri anestezi masasına aktarın.
   3. Farelerde hipotermi olasılığını azaltmak için, ışınlanmış, anestezi uygulanmış fareyi 37 °C'ye ayarlanmış termostatik bir ısıtma yastığına yerleştirin.
   4. Fareyi, tamamen anestezi uygulandıktan sonra başı sağa bakacak şekilde sol lateral yaslanacak şekilde yerleştirin.
   5. Gözü dışarı çıkarmak için, başın üstüne ve çene çizgisi boyunca bir parmağınızı yerleştirin. Cildi nazikçe geriye ve aşağı doğru çekin.
   6. Adım 5.1.5'te elde edilen CD45.1⁺ farelerin in vivo osteo-organoid türevli hücre süspansiyonunun veya doğal kemik iliği türevli hücre süspansiyonunun 200 μL'sini aspire etmek için 25 G'lik bir iğne ile donatılmış 1 mL'lik bir şırınga kullanın.
   7. İğneyi, eğim aşağı, yaklaşık 30°'lik bir açıyla medial kantusa dikkatlice sokun.
      NOT: Enjeksiyonlar genellikle iğne eğimi yukarıdayken yapılır, ancak retro-orbital enjeksiyonlar için, göz hasarı riskini azaltmak için iğne eğimini aşağı yerleştirmek daha iyidir.
   8. İğne ucu gözün tabanına gelene kadar göz küresinin kenarını aşağı doğru takip etmek için iğneyi kullanın.
   9. Enjeksiyonu yavaşça ve pürüzsüz bir şekilde enjekte edin.
   10. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, kurtarma için fareyi kafesine geri koyun.

6. Tedavi etkilerinin değerlendirilmesi

1. Hematolojik analiz
   NOT: Bağışıklık sistemi sulandırma testlerinde alıcıların hematolojisini analiz etmek için, farklı tedavilere tabi tutulan alıcılardan periferik kan örnekleri topladık: 0 Gy PBS tedavisi, 5 Gy PBS tedavisi, 5 Gy doğal BM tedavisi ve 5 Gy osteo-organoid tedavisi. Kan örnekleri transplantasyondan 2 gün önce ve transplantasyondan 2, 4, 8, 12 ve 16 hafta sonra retroorbital ponksiyon yoluyla elde edildi. Aynı gruba ait kan örneğinin bir kısmı hematolojik analiz için, diğer kısmı ise kimerizm analizi için kullanıldı. Submandibular ven veya kuyruk veni gibi farklı kan örnekleme yöntemleri vardır. Retro-orbital ponksiyon, farelerde kan örneklemesi için yaygın yöntemlerden biridir ve etik koşullar altında izin verilir.
   1. Fareleri uyuşturmak ve farelerin gözlerini dışarı çıkarmak için 5.2.1-5.2.5 adımlarını tekrarlayın.
      NOT: Hayvanlara verilen zararı azaltmak için, retro-orbital ponksiyon kan örneklemesinden önce farelere izofluran anestezisi uygulanır.
   2. 0,5 mm çapındaki kılcal boruyu gözün medial kantusuna yerleştirin ve burun düzlemine göre 30°-45° açıyla kaudal olarak yönlendirin.
   3. Basınç uygularken kılcal boruyu nazikçe döndürün ve konjonktival zarlardan geçmesine izin verin. Kılcal hareket yoluyla kanın kılcal boruya akmasına izin verin.
   4. Akışı sürdürmek için kan akmaya başladıktan sonra sürekli basınç uygulayın.
   5. 100 μL kan çektikten sonra, boyundaki basıncı hemen boşaltın. Aynı zamanda, delinme bölgesinden ameliyat sonrası kanamayı önlemek için gözün normal pozisyona dönmesine izin vermek için kılcal boruyu çıkarın.
   6. Kanı derhal% 1.5 (a / h) etilendiamin tetraasetik asit dipotasyum tuzu dihidrat (EDTA-K2) çözeltisi ile yıkanmış ve daha sonra 10 μL% 1.5 (a / h) EDTA-K2 çözeltisi eklenmiş bir santrifüj tüpüne boşaltın. EDTA-K2 çözeltisi ve kanın iyice karışmasını sağlamak ve pıhtılaşmayı önlemek için santrifüj tüpünü hafifçe sallayın.
   7. Yarayı steril pamukla sildikten ve kanamayı durdurmak için hafif bir baskı uyguladıktan sonra, herhangi bir anormallik olmadığından emin olmak için fareleri hemostaz sonrası 1-2 dakika gözlemleyin ve ardından kafeslerine geri koyun.
   8. Beyaz kan hücreleri (WBC), kırmızı kan hücreleri (RBC) ve trombositlerin (PLT) sayıları dahil olmak üzere bir hematoloji analizörü kullanarak her grubun kan örneklerinin bir kısmı üzerinde hematolojik analiz yapın.
      NOT: Tüm kan örneklerini alındıktan sonraki 2 saat içinde analiz edin.
2. Periferik kan kimerizminin analizi
   NOT: Hematolojik analize benzer şekilde, 5 Gy doğal BM ile tedavi edilen ve 5 Gy osteo-organoid ile tedavi edilen gruplardan periferik kan örnekleri, transplantasyondan 2, 4, 8, 12 ve 16 hafta sonra retro-orbital ponksiyon ile toplandı.
   1. Periferik kan kimerizminin analizi için adım 6.1'den elde edilen periferik kan örneğinin diğer kısmını kullanın.
   2. Numuneye 1 mL eritrosit lizis tamponu ekleyin ve 3-5 dakika parçalayın. Kırmızı kan hücrelerinin daha iyi parçalanmasını kolaylaştırmak için numuneyi nazikçe baş aşağı ters çevirin.
   3. 300 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
   4. Süpernatanı atın ve peleti yeniden süspanse etmek için 1 mL HBSS (Ca^{2 +}, Mg^{2 +} yok) ekleyin.
   5. 300 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Santrifüj tüpünün dibinde kalan yaklaşık 100 μL hücreyi, canlı/ölü boyama kiti, PE-anti-CD45.1 (1:200), Floresein İzotiyosiyanat (FITC)-anti-CD45.2 (1:200), PE-Cy7-anti-B220 (1:200), AF700-anti-CD11b (1:200), PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (1:200), PE-Dazzle594-anti-CD4 (1:200) ve Allofikosiyanin (APC)-anti-CD3e (1:200) dahil olmak üzere antikorlar kullanarak boyayın.
   6. Hücreleri 1 mL HBSS (Ca^{2 +}, Mg^{2 +} yok) ile yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
   7. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 300 μL HBSS (Ca^{2 +}, Mg^{2 +} yok) ile yeniden süspanse edin.
   8. Daha fazla akış sitometrisi analizi yapmak için süspansiyonu vorteksleyin.
   9. Hem 5 Gy doğal BM ile tedavi edilen grupta hem de 5 Gy osteo-organoid ile tedavi edilen grupta alıcı farelerin periferik kanındaki HSPC'lerin kimerizm oranı hakkında bilgi edinmek için akış sitometrisi yazılımı kullanarak elde edilen verileri daha fazla analiz edin.
      NOT: Akış sitometrik verilerinin analizi için, CD45.2 alıcılarının periferik kanındaki donör kaynaklı CD45.1⁺ hücrelerini tanımlamak için kullanılan tipik geçit stratejileri için Ek Şekil S2'ye bakın.
   10. Canlı hücrelere karşılık gelen bölgeyi geçit etmek için 3.4.11-3.4.12 adımlarını tekrarlayın.
   11. Başlangıçta hücre popülasyonlarını tanımlayarak ve ardından donör ve alıcı hücreleri ayırt ederek periferik kan kimerizmini analiz edin.
       1. Canlı hücreler içinde spesifik antikor etiketli hücreleri tarayın. X ekseni için CD11b-AF700'ü ve Y ekseni için B220-PE-Cy7'yi seçin. B220 ⁺ CD11b^- hücrelerini B hücreleri olarak, B220-CD11b ⁺ hücrelerini miyeloid hücreler olarak ve B220-CD11b^- hücrelerini çift negatif (DN) hücreler olarak kapılayın.
       2. X ekseni için CD3-APC ve Y ekseni için SSC-A kullanarak DN hücre kapısına çift tıklayın. CD3 ⁺ hücrelerini T hücreleri olarak kapılayın.
       3. X ekseni için CD4-PE-Dazzle594'ü ve Y ekseni için CD8-PerCp-Cy5.5'i seçerek CD3⁺ hücre kapısına çift tıklayın. CD8 ⁺ CD4^- hücrelerini sitotoksik T hücreleri (CTL) ve CD8-CD4 ⁺ hücrelerini düzenleyici T hücreleri (Treg) olarak açın.
   12. Son olarak, donör ve alıcı hücreler üzerinde periferik kan kimerizmi analizi yapılır. Belirlenen hücre popülasyonları içinde, X ekseni için CD45.1-PE'yi ve Y ekseni için CD45.2-FITC'yi seçmek için çift tıklayın. CD45.1⁺ hücrelerini kapatın ve hücre popülasyonu içindeki CD45.1⁺ hücrelerinin oranını belirlemek için hücre sayımı yapın, böylece kimerizm oranını yansıtın.
3. Katı organ kimerizminin analizi
   NOT: Transplantasyondan 16 hafta sonra, 5 Gy BM ile tedavi edilen grupta ve 5 Gy osteo-organoid ile tedavi edilen grupta BM, dalak ve timus kimeraları analiz edildi.
   1. BM'den türetilen hücre peletlerini elde etmek için 5.1.1-5.1.4 adımlarını tekrarlayın.
   2. 300 mL HBSS (Ca^{6 +} , Mg^{2 +} yok) içeren bir hücre kültürü kabının (2 cm) üzerine 2 gözenekli bir naylon filtre yerleştirin.
   3. Disseke dalağı veya timusu naylon filtrenin üzerine yerleştirin.
   4. Bahsedilen organları, 5 mL'lik bir şırınganın ön lastik tıpasını kullanarak, belirgin bir doku yapısı kalmayana kadar, sadece artık fibröz doku kalana kadar öğütün. Hücre canlılığını sağlamak için hücreleri nazikçe tutun.
   5. Süzüntüyü toplayın ve 300 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
   6. Dalak veya timustan elde edilen hücre çökeltilerini elde etmek için süpernatanı çıkarın.
   7. Adım 6.3.1 ve 6.3.6'da elde edilen hücre peletlerine 1 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin ve 3-5 dakika parçalayın.
   8. Boyama ve akış sitometrisi analizi için 6.2.3-6.2.8 adımlarını tekrarlayın.
   9. Hem 5 Gy doğal BM ile tedavi edilen grupta hem de 5 Gy osteo-organoid ile tedavi edilen grupta alıcı farelerin katı organlarındaki (BM, dalak ve timus) HSPC'lerin kimerizm oranı hakkında bilgi edinmek için akış sitometrisi yazılımı kullanarak elde edilen verileri daha fazla analiz edin.
      NOT: Akış sitometrik verilerinin analizi için, CD45.2 alıcılarının BM, dalak ve timusundaki donör kaynaklı CD45.1⁺ hücrelerini tanımlamak için kullanılan tipik geçit stratejileri için Ek Şekil S2'ye atıfta bulunur.
   10. Katı organların kimerizm oranını elde etmek için 6.2.10-6.2.12 adımlarındaki periferik kanı BM, dalak ve timus ile değiştirin.

Sonuçlar

Protokol gereği, steril koşullar altında BMP-2'yi parçalanabilir bir jelatin sünger içine damlatarak biyoaktif bir iskele oluşturduk. İskele daha sonra in vivo osteo-organoidler oluşturmak için farelerin alt ekstremite kaslarına implante edildi. 12 haftalık bir inkübasyon döneminden sonra osteo-organoidler üzerinde makroskopik fotoğraflama, histolojik analiz ve akış sitometrisi analizi yapıldı (Şekil 1A). Jelatin sünger 5 mm x ...

Tartışmalar

Bu protokolde, BMP-2 yüklü jelatin sünger iskeleleri implante ederek kemik iliği benzeri yapılara sahip in vivo osteo-organoidlerin oluşturulmasına yönelik bir yaklaşım sunuyoruz. Bu in vivo osteo-organoidlerin uzun bir süre boyunca (12 haftadan fazla) stabil bir şekilde terapötik HSPC'ler üretebileceğini gösterdik. Hücreleri yükleyen mevcut in vitro genişletme veya in vivo inkübasyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AF700-anti-CD11b (M1/70)	eBioscience	56-0112-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
AF700-anti-Sca-1 (D7)	BioLegend	108141	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
APC-anti-CD3e (145-2C11)	Tonbo	20-0031-U100	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
bio-anti-CD34 (RAM34)	eBioscience	13-0341-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV421-anti-CD127 (IL-7Rα)	BioLegend	135023	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV510-anti-CD48 (HM48-1)	BioLegend	103443	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV711-anti-CD16/32 (93)	BioLegend	101337	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Capillary tube	Shanghai Huake Labware Co.	DC616297403604-100mm/0.5mm
Cell strainer	CORNING	352340
Ethanol	GENERAL-REAGENT	01158566
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) solution	Servicebio	G1105
Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt dihydrate (EDTA-K2)	Solarbio	E8651
FITC-anti-CD45.2 (104)	BioLegend	109806	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Flowjo	Becton, Dickinson & Company		A flow cytometry.
Gelatin sponge	Jiangxi Xiangen Co.		Use under sterile conditions.
HBSS without Ca2+ and Mg2+	Gibco	14170112	HBSS without Ca2+ and Mg2+ can prevent cell aggregation.
Hematology analyzer	Sysmex	pocH-100i Diff
iodine swabs	Xiangtan Mulan Biological Technology Co., Ltd.	01011	To prevent the infection after operation.
Isoflurane	RWD	R510-22-10	To avoid adverse effects of anesthesia waste gases on the environment and laboratory personnel, a gas recovery system should be used in conjunction.
Kraft paper			absorbent paper
LIVE/DEAD Fixable Near IR Dead Cell Staining Kit(used in 3.4.5)	Thermo Fisher Scientific	L34962	A live/dead staining kit. Store at -20 °C. Dissolve in 50 μL of DMSO for working solution.
lubricating vet ointment	Pfizer		To prevent dryness and counteract the ocular irritations caused by isoflurane.
Neutral balsam	Solarbio	G8590
nylon filter	Shanghai Shangshai Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd.		Used for cell filtration.
Paraffin liquid	Macklin	P815706
Paraformaldehyde (PFA) solution	Servicebio	G1101	Immersion fixation is used for routine animal tissues. The volume of fixative used is generally 10-20 times the tissue volume, and fixation at room temperature for 24 hours is sufficient.
PE-anti-CD45.1 (A20)	BioLegend	110708	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-CF594-anti-CD135 (A2F10.1)	BD Biosciences	562537	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy5-anti-c-kit (2B8)	BD Biosciences	105809	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-B220 (RA3-6B2)	BioLegend	103222	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-CD150 (TC15-12F12.2)	BioLegend	115914	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Dazzle594-anti-CD4 (GK1.5)	BioLegend	100456	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Pentobarbital sodium salt	Sigma-Aldrich	57-33-0	Prepare for use at a concentration of 1% (w/v).
PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (53-6.7)	BioLegend	100734	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PerCp-Cy5.5-anti-lineage cocktail	BD Biosciences	561317	Store at 4 °C. Dilute 1:10  for staining.
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702	Store at 4 °C. Use in clean bench.
rhBMP-2	Shanghai Rebone Biomaterials Co.		The concentration of rhBMP-2 in the stock solution is 1.0 mg/mL.
Staining buffer	BioLegend	420201	Store at 4 °C.
Xylene	GENERAL-REAGENT	01018114
Zombie UV Fixable Viability Kit (used in 6.2.5)	BioLegend	423108	A live/dead staining kit. For reconstitution, bring the kit to room temperature; add 100 µL of DMSO to one vial of Zombie UV dye until fully dissolved.