Approche ostéo-organoïde in vivo pour la récolte de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques thérapeutiques

Résumé

Ici, nous avons établi in vivo des ostéo-organoïdes déclenchés par des échafaudages de gélatine chargés de protéine 2 morphogénétique osseuse pour récolter des cellules souches/progénitrices hématopoïétiques thérapeutiques pour la reconstruction d’un système hématopoïétique et immunitaire endommagé. Dans l’ensemble, cette approche peut fournir une source cellulaire prometteuse pour les thérapies cellulaires.

Résumé

La greffe de cellules souches hématopoïétiques (GCSH) nécessite un nombre suffisant de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques thérapeutiques (CPSH). Pour identifier une source adéquate de HSPCs, nous avons développé un ostéo-organoïde in vivo en implantant des échafaudages chargés de protéine morphogénétique osseuse humaine recombinante-2 (rhBMP-2) dans une poche musculaire interne près du fémur chez la souris. Après 12 semaines d’implantation, nous avons récupéré les ostéo-organoïdes in vivo et effectué une analyse par cytométrie en flux sur des HPSC, révélant une présence significative de sous-ensembles de HSPC au sein des ostéo-organoïdes in vivo .

Nous avons ensuite établi un modèle sublétal de lésions hématopoïétiques/immunitaires chez des souris par radiothérapie et effectué une greffe de cellules souches hématopoïétiques (HSCT) en injectant les cellules dérivées d’ostéo-organoïdes extraites dans le sang périphérique de souris irradiées. L’effet de la récupération hématopoïétique a été évalué par des analyses hématologiques, du chimérisme du sang périphérique et du chimérisme des organes solides. Les résultats ont confirmé que les cellules dérivées d’ostéo-organoïdes in vivo peuvent reconstruire rapidement et efficacement les organes immunitaires périphériques et solides endommagés chez les souris irradiées. Cette approche a le potentiel d’être une source alternative de HSPC pour la HSCT, offrant des avantages à un plus grand nombre de patients.

Introduction

La greffe de cellules souches hématopoïétiques est le traitement conventionnel d’une variété d’hémopathies malignes, ainsi que de nombreuses maladies hématopoïétiques et auto-immunes 1,2,3,4. Néanmoins, la quantité et l’origine limitées de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques (HSPC) sont apparues comme un obstacle important à la mise en œuvre clinique de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (HSCT)^5,6.

L’expansion cellulaire in vitro à grande échelle est une méthode couramment utilisée pour récolter des cellules thérapeutiques ^5,7. Diverses études ont mis au point des conditions qui stimulent les HSPC à s’auto-renouveler in vitro, généralement par l’utilisation d’une combinaison d’agonistes de l’auto-renouvellement (tels que les cytokines et les facteurs de croissance) et d’albumine sérique, entraînant l’expansion ex vivo des HSPC⁸. Cependant, il est important de noter que les méthodes actuelles prennent encore du temps et qu’il est difficile de maintenir la capacité d’autorenouvellement des HSPC⁹ élargies.

Contrairement à la méthode susmentionnée, la récolte de cellules in vivo présente une stratégie nouvelle et innovante. Cette approche implique l’établissement d’un ostéo-organoïde in vivo qui imite la structure native de la moelle osseuse^10,11. Pour ce faire, nous formons des ostéo-organoïdes in vivo à l’aide d’échafaudages de gélatine chargés de protéines morphogénétiques osseuses 2 (BMP-2) afin d’obtenir des cocktails de cellules autologues abondants et de haute qualité, y compris des HSPC. En appliquant thérapeutiquement ces ostéo-organoïdes, nous avons traité avec succès les dommages causés par l’irradiation et démontré que les HSPC dérivées des ostéo-organoïdes peuvent reconstituer rapidement et de manière stable le système immunitaire expérimentalement altéré.

Protocole

Des souris C57BL/6 mâles et femelles, âgées de 8 à 10 semaines, ont été incluses dans l’étude. Toutes les souris ont été hébergées dans l’animalerie de l’Université des sciences et technologies de l’Est de la Chine. Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par les comités institutionnels de protection et d’utilisation des animaux de l’Université des sciences et de la technologie de Chine orientale (ECUST-21010).

1. Fabrication d’échafaudages bioactifs

1. Préparation
   1. Mettez les ciseaux chirurgicaux et la pince à épiler nettoyés et séchés dans un bécher de 1 000 ml. Enveloppez l’embouchure du bécher avec du papier absorbant et attachez-le fermement avec du fil de coton.
   2. Placez le bécher dans le stérilisateur à haute pression, fermez bien le couvercle, réglez le programme de stérilisation à 121 °C pendant 30 min et démarrez le programme de stérilisation.
   3. Une fois le processus de stérilisation terminé, retirez et transférez le bécher stérilisé dans un four de séchage réglé à 60 °C pour le séchage. Une fois complètement sec, vaporisez le bécher avec de l’alcool à 75 % (v/v) et placez-le sur le banc propre.
   4. Décongeler la solution mère de rhBMP-2 (1,0 mg/mL) 2 h avant l’intervention.
   5. Une fois décongelé à température ambiante, transférez la solution mère rhBMP-2 et l’éponge de gélatine non ouverte sur le banc stérile propre pour la fabrication d’échafaudages bioactifs.
      1. Coupez l’éponge de gélatine (60 mm x 20 mm x 5 mm) en 48 morceaux de taille uniforme (5 mm x 5 mm x 5 mm) (figure 1B) à l’aide des ciseaux stérilisés et transférez-les dans une plaque à 48 puits.
      2. Mélangez la solution mère rhBMP-2 en pipetant doucement de haut en bas pour assurer un mélange uniforme, en prenant soin d’éviter les bulles. Aspirez 30 μL de la solution et ajoutez-la goutte à goutte à l’éponge de gélatine.
      3. Scellez la plaque à 48 puits à l’aide d’une couche de parafilm pour faciliter le processus de lyophilisation ultérieur. Sortez la plaque contenant l’éponge de gélatine du banc propre. Placez-le à -20 °C pour le congeler. Simultanément, allumez le lyophilisateur et prérefroidissez-le à une température comprise entre -50 °C et -60 °C.
      4. Après 2 h de congélation, placez la plaque de puits avec des éponges de gélatine dans le lyophilisateur pendant 12 h. Pour maintenir la sécheresse et la stérilité des échantillons, appliquez une couche supplémentaire de parafilm pour sceller la plaque du puits après la lyophilisation. Conservez-le dans un réfrigérateur à -20 °C.

2. Implantation chirurgicale d’échafaudages bioactifs

REMARQUE : Tous les instruments chirurgicaux sont stérilisés pour être utilisés.

1. Faites jeûner les souris pendant 1 h avant l’anesthésie. Appliquez une pommade vétérinaire lubrifiante autour des yeux des souris pour réduire l’inconfort postopératoire causé par la sécheresse du contour des yeux. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale d’une solution à 1 % (p/v) de pentobarbital sodique (à une dose de 48 mg/kg).
   REMARQUE : Ce protocole utilise la méthode éthiquement approuvée d’anesthésie avec injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique. D’autres méthodes, telles que l’inhalation d’isoflurane ou l’injection intrapéritonéale de kétamine-xylazine, peuvent également être utilisées après approbation.
2. Confirmez la profondeur de l’anesthésie chez la souris en recherchant les signes suivants chez une souris en décubitus dorsal : rythme cardiaque et respiration réguliers, muscles détendus, membres immobiles, moustaches insensibles au toucher et absence de réflexe de pédale. De plus, pincez la peau des souris avec des pinces dentées ou stimulez les orteils ou les pattes des souris. Si les souris présentent des réactions sensibles, l’anesthésie est trop légère ; administrer une anesthésie supplémentaire. Une fois le plan anesthésique atteint, transférez les souris dans la zone chirurgicale en position couchée latérale droite pour implanter facilement l’échafaudage bioactif dans la jambe gauche.
3. Rasez les poils de la jambe gauche à l’aide d’une machine à raser. Désinfectez la zone rasée en alternant 3 fois plus de chlorhexidine et d’alcool et créez des incisions sur la patte arrière, située sur le côté latéral du muscle vaste latéral. À l’aide de ciseaux ophtalmiques, faites des incisions d’environ 3,0 mm de longueur, en s’étendant le long de la direction du tibia.
   REMARQUE : Pour maintenir des conditions stériles pendant la chirurgie, les articles chirurgicaux utilisés doivent être stockés dans des endroits désignés. Les fournitures stériles doivent être placées dans un endroit propre pour éviter tout contact avec des personnes autres que l’opérateur. Les instruments chirurgicaux réutilisables doivent être rapidement désinfectés avec de l’éthanol à 75 % (v/v). Minimiser la durée de la chirurgie pour réduire l’exposition des plaies à l’air et diminuer le risque d’infection.
4. Pour créer la poche pour l’implant, ouvrez le fascia au niveau de la face distale du muscle vaste latéral, vers le tibia.
5. À l’aide d’une pince ophtalmique, façonner l’échafaudage bioactif en un cylindre d’environ 5 mm de hauteur et 5 mm de diamètre. Implantez l’échafaudage dans la poche musculaire le long de la fente musculaire créée par des ciseaux ophtalmiques et fermez la poche de l’implant avec un motif de suture interrompu à travers le fascia. Fermez l’incision cutanée à l’aide d’une suture 4-0.
   REMARQUE : La survenue de convulsions ou d’urines chez les animaux pendant l’intervention chirurgicale indique une anesthésie excessivement profonde, nécessitant la mise en œuvre rapide de mesures d’urgence.
6. Répétez les étapes 2.3-2.5 et implantez un autre échafaudage bioactif dans la poche musculaire fémorale droite des souris. Utilisez des écouvillons d’iode pour nettoyer les sites chirurgicaux et d’injection des souris après la chirurgie afin de prévenir l’infection.
   REMARQUE : Un seul implant peut être inséré dans chaque muscle vaste latéral.
7. Placez les souris sur une plate-forme à température constante à 37 °C jusqu’à ce qu’elles se réveillent après l’expérience. Retournez les souris toutes les 10 à 15 minutes pour éviter l’accumulation de sang. Après la chirurgie, en plus de maintenir la chaleur, surveillez les souris postopératoires sans laisser l’animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris suffisamment conscience pour maintenir le décubitus sternal. Portez une attention particulière aux indicateurs importants de la présence de souris, tels que la fréquence cardiaque et la fréquence respiratoire.
   REMARQUE : Le tremblement des membres antérieurs chez la souris signifie le début de la phase de récupération.
8. Remettez les souris dans une cage stérile qui a été désinfectée par pulvérisation d’alcool et irradiation ultraviolette. Ne placez pas l’animal qui a subi une intervention chirurgicale avec d’autres animaux avant qu’il ne soit complètement rétabli. De plus, administrez du méloxicam pour gérer la douleur postopératoire pendant au moins une journée, avec la possibilité de prolonger jusqu’à trois jours pour une gestion plus intensive de la douleur. Vérifiez régulièrement l’animal et la plaie pendant les 72 heures suivant l’intervention chirurgicale afin de déceler tout effet indésirable potentiel. Si l’infection est détectée plus tard, euthanasier les animaux en anesthésiant d’abord les souris par injection intrapéritonéale d’une solution à 1 % (p/v) de pentobarbital sodique (à une dose de 48 mg/kg), suivie d’une luxation cervicale après l’anesthésie.

3. Caractérisation des ostéo-organoïdes in vivo 12 semaines après l’implantation

REMARQUE : Les échafaudages bioactifs vont se développer in vivo pour former des ostéo-organoïdes après l’implantation.

1. Collection d’ostéo-organoïdes in vivo
   1. Lorsque les ostéo-organoïdes in vivo ont été implantés pendant 12 semaines, anesthésier les souris par injection intrapéritonéale d’une solution à 1 % (p/v) de pentobarbital sodique (à une dose de 48 mg/kg), suivie d’une luxation cervicale après anesthésie.
      REMARQUE : Pour minimiser les dommages aux animaux, les souris doivent être anesthésiées avant l’euthanasie par luxation cervicale.
   2. Vaporiser de l’alcool à 75 % (v/v) sur la peau au site de dissection.
   3. Déconnectez le membre postérieur du tronc et retirez le muscle des ostéo-organoïdes à l’aide de ciseaux miniatures avec précaution.
   4. Retirez les tissus mous attachés avec de la gaze.
   5. Fixer quelques ostéo-organoïdes dans une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % (v/v) pendant 24 h à température ambiante pour une analyse histologique. Utilisez les échantillons restants pour la photographie macroscopique et l’analyse par cytométrie en flux des HPSC.
2. Images macroscopiques
   1. Placez les ostéo-organoïdes sur une plaque de fond bleu et photographiez-les avec un appareil photo numérique.
3. Analyse histologique
   1. Préparation à la coloration histologique
      1. Transférez les ostéo-organoïdes de la solution PFA dans de l’eau ultrapure et laissez tremper pendant 1 h.
      2. Remplacer l’eau ultrapure par une solution d’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) 0,5 M pour le détartrage pendant 1 semaine.
      3. Placez les tissus décalcifiés dans une cassette d’enrobage et immergez-la dans de l’eau ultrapure pendant 1 h.
      4. Pour la déshydratation par gradient, immerger la cassette d’enrobage dans de l’éthanol à des concentrations variables (v/v) : 75 %, 80 %, 90 % et 95 % pendant une durée de 1 h chacune, suivie d’une immersion dans de l’éthanol à 100 % (v/v) I et II pendant 1 h chacune.
         REMARQUE : Les termes « 100 % (v/v) d’éthanol I et II » indiquent que la cassette d’enrobage doit être immergée une fois dans le « récipient I » rempli d’éthanol à 100 % (v/v), puis immergée une deuxième fois dans le « récipient II » rempli d’éthanol à 100 % (v/v).
      5. Après la déshydratation, placez les tissus intégrés séquentiellement dans un mélange de xylène à 100 % (v/v) et d’éthanol absolu (rapport volumique xylène/éthanol de 1:1) pendant 1 h et de xylène I et II à 100 % (v/v) pendant 30 min chacun.
      6. Immergez les tissus dans la paraffine I et II à une température constante de 60 °C pendant 2 h chacun.
      7. Pour enrober les tissus imbibés de cire à l’aide d’une machine d’enrobage, placez la cire fondue dans le moule d’enrobage. Avant que la cire ne se solidifie, retirez les tissus du récipient de déshydratation et placez-les dans le moule d’enrobage ; Étiquetez-les en conséquence. Refroidissez le moule à -20 °C de congélation et, une fois la cire solidifiée, retirez le bloc de cire du moule d’enrobage et coupez-le.
      8. Coupez les blocs de cire incrustés en sections de 4,5 μm d’épaisseur à l’aide d’une trancheuse à paraffine, puis fixez les sections sur des lames de verre.
      9. Faites cuire brièvement les sections à 40 °C, puis collectez-les et stockez-les dans une boîte d’échantillons.
   2. Coloration H&E
      1. Placez les sections sur une grille d’échantillonnage et faites-les cuire dans une étuve de séchage à 60 °C pendant 30 min.
      2. Déparaffiniser les sections dans du xylène et de l’éthanol. Placez séquentiellement les sections de paraffine dans du xylène I pendant 10 min, du xylène II pendant 10 min, du xylène III pendant 10 min, de l’éthanol absolu I pendant 5 min, de l’éthanol absolu II pendant 5 min, de l’éthanol à 90 % (v/v) pendant 5 min, de l’éthanol à 80 % (v/v) pendant 5 min, de l’éthanol à 70 % (v/v) pendant 5 min, de l’éthanol à 50 % (v/v) pendant 5 min et transférez-les dans de l’eau pure pour un processus de déparaffinage par gradient.
      3. Immergez les sections dans la solution de coloration à l’hématoxyline pendant 2 min, puis rincez-les à l’eau courante pendant 10 min.
      4. Immerger les sections dans la solution de coloration à l’éosine pendant 2 min.
      5. Placez séquentiellement les sections dans de l’éthanol à 75 % (v/v) pendant 2 min, de l’éthanol à 85 % (v/v) pendant 2 min, de l’éthanol absolu pendant 5 min, de l’éthanol absolu pendant 5 min et du xylène pendant 5 min pour la déshydratation.
      6. Retirez les sections de xylène et scellez-les avec du baume neutre.
      7. Observez les coupes au microscope et capturez des images représentatives à un grossissement de 10x après le séchage du baume neutre.
4. Analyse par cytométrie en flux pour les HPSC
   1. Placez les ostéo-organoïdes in vivo obtenus à partir de l’étape 3.1 dans un mortier et ajoutez une quantité appropriée de tampon de coloration. Coupez les ostéo-organoïdes en fragments d’un diamètre de 1 à 3 mm à l’aide de ciseaux ophtalmiques et écrasez-les dans le tampon de coloration à l’aide du mortier et du pilon. Presser verticalement plutôt que broyer les fragments des ostéo-organoïdes in vivo à l’aide d’un pilon pour éviter une baisse du taux de survie cellulaire.
   2. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger et les centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
   3. Retirer le surnageant et ajouter 1 mL de tampon de lyse des globules rouges pour lyser les cellules pendant 3 à 5 min.
   4. Lavez les cellules avec 1 ml de tampon de coloration et filtrez-les à travers un filtre en nylon de 300 mailles dans un tube de cytométrie en flux de 5 ml.
   5. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant. Colorer les environ 100 μL (cellules) restantes au fond du tube de cytométrie en flux à 4 °C pendant 30 min à l’aide d’anticorps, y compris un kit de coloration vivant/mort, un cocktail anti-lignée de protéine de chlorophylle de la péridinine-Cyanine5.5 (PerCp-Cy5.5)-(1:10), Phycoérythrine-Cyanine5 (PE-Cy5)-anti-c (1:200), Alexa Fluor 700(AF700)-antigène anti-cellules souches-1(Sca-1) (1:200), Violet brillant 711(BV711)-anti-CD16/32 (1:200), bio-anti-CD34 (1:200), BV421-anti-CD127 (1:200), PE-CF594-anti-CD135 (1:200), BV510-anti-CD48 (1:200) et PE-Cy7-anti-CD150 (1:200).
   6. Remettre les cellules en suspension avec 1 mL de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) sans Ca²⁺ et Mg²⁺ et centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
   7. Aspirez le surnageant et colorez-le avec l’anticorps secondaire PE-streptavidine (1:200) pendant 60 min supplémentaires à 4 °C.
   8. Remettre les cellules en suspension avec 1 mL de HBSS (pas de Ca²⁺, Mg²⁺) et centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
   9. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 300 μL de HBSS (pas de Ca²⁺, Mg²⁺).
   10. Vortex est la solution pour effectuer d’autres analyses de cytométrie en flux. Analyser davantage les données obtenues à l’aide d’un logiciel de cytométrie en flux pour obtenir des données quantitatives sur les HSPC.
       REMARQUE : La collecte de données et l’analyse de la cytométrie en flux se réfèrent à nos articles précédents et aux documents d’appui (figure supplémentaire S1) pour les stratégies de contrôle typiques utilisées pour identifier les HSPC¹⁰.
   11. Établissez un diagramme de points d’aire de diffusion latérale (SSC-A) en fonction de l’aire de diffusion directe (FSC-A) et identifiez la région environnante de la population cellulaire d’intérêt (P1) dans le diagramme de points SSC-A vs FSC-A lors de l’acquisition de données sur un cytomètre en flux. Double-cliquez sur la porte P1 ; sélectionnez la hauteur de diffusion vers l’avant (FSC-H) pour l’axe X et la largeur de diffusion vers l’avant (FSC-W) pour l’axe Y afin d’effectuer le premier traitement d’adhésion cellulaire. Double-cliquez sur la porte des cellules simples ; sélectionnez la hauteur de diffusion latérale (SSC-H) pour l’axe X et la largeur de diffusion latérale (SSC-W) pour l’axe Y afin d’effectuer le deuxième traitement d’adhésion de cellule. Utilisez l’outil de contrôle rectangulaire pour sélectionner les cellules individuelles.
   12. Excluez les cellules mortes. Distinguer les cellules vivantes des cellules mortes en détectant les marqueurs de viabilité. Établissez un diagramme à points SSC-A vs Live/Dead et gatez la région correspondant aux cellules vivantes, en la nommant « cellules vivantes ».
   13. Cribler les cellules marquées avec des anticorps spécifiques dans des « cellules vivantes ». Exclure la population cellulaire qui peut être affectée par l’expression positive d’anticorps spécifiques à la lignée dans la lignée de cellules souches ou progénitrices hématopoïétiques myéloïdes en utilisant le gating à déclenchement de lignée négative (lin^-). Gate ^{les cellules} linéaires.
   14. Dépistage de différentes sous-populations de cellules à l’intérieur ^{des cellules} linéaires. Double-cliquez sur la porte des cellules linéaires ; sélectionnez Sca-1-AF700 pour l’axe X et c-kit-PE-Cy5 pour l’axe Y. Gate les cellules c-kit⁺Sca-1^- en tant que cellules LKS^, les cellules c-kit⁺Sca-1⁺ en tant que cellules LKS⁺, et les cellules à faible expression de c-kit et Sca-1 en tant que cellules LK^loS^lo. Double-cliquez sur la porte LKS^- et sélectionnez CD34-PE pour l’axe X et FCγR-BV711 pour l’axe Y. Double-cliquez sur la porte LKS⁺ ; sélectionnez FIt3-PE-CF594 pour l’axe X et IL7Rα-BV421 pour l’axe Y, puis CD150-PE-Cy7 pour l’axe X et CD48-BV510 pour l’axe Y.
   15. En fonction de la spécificité des anticorps, identifier les portes positives ou négatives pour distinguer les sous-populations cellulaires : cellules souches hématopoïétiques (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁺CD48⁻CD150⁺) et progéniteurs hématopoïétiques différenciés : progéniteurs multipotents (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁺CD48⁻CD150⁻), progéniteurs lymphoïdes communs (Lin⁻c-kit-Sca-1-Flt3⁺IL7Rα⁺), progéniteurs myéloïdes communs (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁺FCγR⁻), progéniteurs granulocytaires-monocytes (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁺FCγR⁺) et progéniteurs érythroïdes mégacaryocytaires (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁻FCγR⁻).

4. Modèle d’irradiation chez la souris

REMARQUE : Les souris C57BL/6 ont été irradiées aux rayons X à l’aide d’un irradiateur à rayons X.

1. Pour obtenir une altération sublétale du système hématopoïétique/immunitaire, exposez les souris de type sauvage (WT) du groupe traité à une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 5 Gray (Gy), du groupe traité à la moelle osseuse native (BM) 5 Gy et du groupe traité aux ostéo-organoïdes 5 Gy à une irradiation 5 Gy (1,25 Gy/min) 24 h avant la transplantation.
   REMARQUE : Assurez-vous que les souris WT du groupe 0 Gy PBS traitées sont traitées avec PBS et ne subissent pas d’irradiation.

5. Processus de thérapie cellulaire

REMARQUE : Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles.

1. Acquisition in vivo de cellules dérivées d’ostéo-organoïdes et de moelle osseuse native
   1. Implantez deux échafaudages bioactifs dans la poche musculaire de souris C57BL/6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (CD45.1) et incubez-les pendant 12 semaines pour former les ostéo-organoïdes in vivo . Récoltez deux ostéo-organoïdes in vivo et deux fémurs d’une souris CD45.1 mentionnée ci-dessus. Par la suite, dégagez les tissus mous à la surface des ostéo-organoïdes et des fémurs à l’aide de pinces et de gaze.
   2. Placez séparément les ostéo-organoïdes et les fémurs dans un mortier et ajoutez 1 mL de HBSS (pas de Ca²⁺, Mg²⁺).
      REMARQUE : HBSS sans Ca²⁺ et Mg²⁺ peut réduire l’agrégation cellulaire. La solution utilisée pour la transplantation ne doit pas contenir de composants sériques pour éviter toute réaction de rejet potentielle.
   3. Découpez les échantillons avec des ciseaux chirurgicaux et écrasez-les doucement dans un mortier et un pilon.
   4. Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 μm et centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
   5. Retirer le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires avec 300 μL de HBSS (pas de Ca²⁺, Mg²⁺). Bien mélanger pour obtenir une suspension de cellules dérivées d’ostéo-organoïdes ou de cellules entières de moelle osseuse.
      REMARQUE : Pour utiliser pleinement les cocktails cellulaires dérivés de l’ostéo-organoïde in vivo, nous avons choisi d’utiliser des cellules de moelle osseuse entière pour le traitement. Le nombre typique de cellules totales dans un ostéo-organoïde in vivo de 30 μg de BMP-2 induit est de 30 000 000-40 000 000.
2. Injection du sinus veineux orbitaire
   REMARQUE : Des cellules entières de moelle osseuse CD45.1⁺ prélevées sur des ostéo-organoïdes ou des fémurs in vivo ont été injectées par le sinus veineux orbitaire dans le receveur C57BL/6 (CD45.2) irradié sublétellement, respectivement. L’injection orbitaire du sinus veineux et l’injection de la veine de la queue sont des méthodes couramment utilisées dans les expériences sur les animaux. L’injection orbitaire du sinus veineux a été choisie en raison de sa simplicité et de son faible taux d’échec pour les débutants. Au cours du processus d’injection orbitaire, certaines mesures de protection doivent être prises, telles que la pré-anesthésie des souris, l’utilisation d’une plaque chauffante pour réduire le risque d’hypothermie et la contention mécanique des souris pour empêcher tout mouvement.
   1. Placez les souris CD45.2 dans une chambre de préanesthésie et induisez l’anesthésie à l’aide d’isoflurane. Appliquez une pommade vétérinaire lubrifiante autour des yeux des souris pour prévenir la sécheresse et contrer les irritations oculaires causées par l’isoflurane.
      REMARQUE : Pour minimiser les dommages aux animaux, l’anesthésie à l’isoflurane est administrée aux souris avant l’injection dans le sinus veineux orbitaire.
   2. Transférez les souris sur la table d’anesthésie pour une anesthésie supplémentaire.
   3. Pour réduire le risque d’hypothermie chez les souris, placez la souris irradiée et anesthésiée sur un coussin chauffant thermostatique réglé à 37 °C.
   4. Placez la souris en position latérale gauche, la tête tournée vers la droite après avoir été complètement anesthésiée.
   5. Pour faire saillir l’œil, placez un doigt sur le dessus de la tête et le long de la mâchoire. Tirez doucement la peau vers l’arrière et vers le bas.
   6. À l’aide d’une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 25 G, aspirer 200 μL de suspension cellulaire dérivée d’ostéo-organoïdes in vivo ou de suspension de cellules natives dérivées de la moelle osseuse de souris CD45.1⁺ obtenue à l’étape 5.1.5.
   7. Introduisez soigneusement l’aiguille, biseautez vers le bas, à un angle d’environ 30°, dans le canthus médial.
      REMARQUE : Les injections sont généralement administrées avec le biseau de l’aiguille vers le haut, mais pour les injections rétro-orbitaires, il est préférable de positionner le biseau de l’aiguille vers le bas pour réduire le risque de lésions oculaires.
   8. Utilisez l’aiguille pour suivre le bord du globe oculaire vers le bas jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille soit à la base de l’œil.
   9. Injectez lentement et doucement l’injectat.
   10. Une fois l’injection terminée, remettez la souris dans sa cage pour la récupérer.

6. Évaluation des effets du traitement

1. Analyse hématologique
   REMARQUE : Pour analyser l’hématologie des receveurs dans les tests de reconstitution du système immunitaire, nous avons prélevé des échantillons de sang périphérique chez des receveurs soumis à différents traitements : traitement 0 Gy PBS, traitement 5 Gy PBS, traitement 5 Gy BM natif et traitement ostéo-organoïde 5 Gy. Les échantillons de sang ont été obtenus par ponction rétro-orbitaire 2 jours avant et 2, 4, 8, 12 et 16 semaines après la transplantation. Une partie de l’échantillon de sang du même groupe a été utilisée pour l’analyse hématologique, tandis que l’autre partie a été utilisée pour l’analyse du chimérisme. Il existe différentes méthodes de prélèvement sanguin, telles que la veine sous-mandibulaire ou la veine de la queue. La ponction rétro-orbitaire est l’une des méthodes courantes de prélèvement sanguin chez la souris et est autorisée dans des conditions éthiques.
   1. Répétez les étapes 5.2.1 à 5.2.5 pour anesthésier les souris et faire saillir les yeux des souris.
      REMARQUE : Pour atténuer les dommages causés aux animaux, une anesthésie à l’isoflurane est administrée aux souris avant le prélèvement sanguin par ponction rétroorbitaire.
   2. Positionnez le tube capillaire d’un diamètre de 0,5 mm dans le canthus médial de l’œil et dirigez-le caudalement à un angle de 30° à 45° par rapport au plan du nez.
   3. Faites pivoter doucement le tube capillaire tout en appliquant une pression, lui permettant de pénétrer à travers les membranes conjonctivales. Permettez au sang de circuler dans le tube capillaire par capillarité.
   4. Appliquez une pression continue après que le sang commence à circuler pour maintenir le flux.
   5. Après avoir prélevé 100 μL de sang, relâchez immédiatement la pression sur le cou. Simultanément, retirez le tube capillaire pour permettre à l’œil de revenir à la position normale afin d’éviter les saignements postopératoires du site de ponction.
   6. Expulser rapidement le sang dans un tube à centrifuger qui a été lavé avec une solution de sel dipotassique d’acide tétraacétique éthylènediamine à 1,5 % (p/v), puis auquel on a ajouté 10 μL de solution d’EDTA-K2 à 1,5 % (p/v). Secouez doucement le tube de centrifugation pour assurer un mélange complet de la solution EDTA-K2 et du sang, empêchant ainsi la coagulation.
   7. Après avoir essuyé la plaie avec un coton stérile et appliqué une légère pression pour arrêter le saignement, observez les souris pendant 1 à 2 minutes après l’hémostase pour vous assurer qu’il n’y a pas d’anomalies, puis remettez-les dans leurs cages.
   8. Effectuez une analyse hématologique sur une partie des échantillons de sang de chaque groupe à l’aide d’un analyseur d’hématologie, y compris le nombre de globules blancs (GB), de globules rouges (GR) et de plaquettes (PLT).
      REMARQUE : Analysez tous les échantillons de sang dans les 2 heures suivant le prélèvement.
2. Analyse du chimérisme du sang périphérique
   REMARQUE : À l’instar de l’analyse hématologique, des échantillons de sang périphérique provenant de groupes 5 Gy traités par BM natif et de 5 groupes traités par ostéo-organoïdes Gy ont été prélevés par ponction rétro-orbitaire 2, 4, 8, 12 et 16 semaines après la transplantation.
   1. Utilisez l’autre partie de l’échantillon de sang périphérique obtenue à l’étape 6.1 pour l’analyse du chimérisme du sang périphérique.
   2. Ajouter 1 mL de tampon de lyse érythrocytaire à l’échantillon et laisser agir pendant 3 à 5 minutes. Retournez doucement l’échantillon pour faciliter une meilleure lyse des globules rouges.
   3. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
   4. Jeter le surnageant et ajouter 1 mL de HBSS (pas de Ca²⁺, Mg²⁺) pour remettre la pastille en suspension.
   5. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant. Colorer environ 100 μL de cellules restantes au fond du tube de centrifugation à 4 °C pendant 30 minutes à l’aide d’anticorps, y compris un kit de coloration vivant/mort, PE-anti-CD45.1 (1:200), Isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-anti-CD45.2 (1:200), PE-Cy7-anti-B220 (1:200), AF700-anti-CD11b (1:200), PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (1:200), PE-Dazzle594-anti-CD4 (1:200) et Allophycocyanine (APC)-anti-CD3e (1:200).
   6. Remettre les cellules en suspension avec 1 mL de HBSS (pas de Ca²⁺, Mg²⁺) et centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
   7. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 300 μL de HBSS (pas de Ca²⁺, Mg²⁺).
   8. Vortex la suspension pour effectuer une analyse plus poussée de cytométrie en flux.
   9. Analyser davantage les données obtenues à l’aide d’un logiciel de cytométrie en flux pour obtenir des informations sur le taux de chimérisme des HSPC dans le sang périphérique des souris receveuses dans le groupe traité par BM natif 5 Gy et le groupe traité par ostéo-organoïde 5 Gy.
      REMARQUE : Pour l’analyse des données de cytométrie en flux, se reporter à la figure supplémentaire S2 pour connaître les stratégies de contrôle typiques utilisées pour identifier les cellules CD45.1⁺ dérivées d’un donneur dans le sang périphérique des receveurs de CD45.2.
   10. Répétez les étapes 3.4.11 à 3.4.12 pour bloquer la région correspondant aux cellules vivantes.
   11. Analysez le chimérisme du sang périphérique en identifiant d’abord les populations cellulaires, puis en distinguant les cellules donneuses et receveuses.
       1. Criblez des cellules spécifiques marquées par des anticorps dans des cellules vivantes. Sélectionnez CD11b-AF700 pour l’axe X et B220-PE-Cy7 pour l’axe Y. Gate les cellules B220⁺CD11b^- en tant que cellules B, les cellules B220-CD11b⁺ en tant que cellules myéloïdes et les cellules B220-CD11b^- en tant que cellules double-négatives (DN).
       2. Double-cliquez sur la porte des cellules DN, en utilisant CD3-APC pour l’axe X et SSC-A pour l’axe Y. Gate les cellules CD3⁺ en tant que cellules T.
       3. Double-cliquez sur la porte des cellules CD3⁺, en sélectionnant CD4-PE-Dazzle594 pour l’axe X et CD8-PerCp-Cy5.5 pour l’axe Y. Gate les cellules CD8⁺CD4^- en tant que lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et les cellules CD8-CD4⁺ en tant que cellules T régulatrices (Treg).
   12. Enfin, l’analyse du chimérisme du sang périphérique est effectuée sur les cellules donneuses et receveuses. Dans les populations de cellules désignées, double-cliquez pour sélectionner CD45.1-PE pour l’axe X et CD45.2-FITC pour l’axe Y. Repérez les cellules CD45.1⁺ et effectuez un comptage cellulaire pour déterminer la proportion de cellules CD45.1⁺ dans la population cellulaire, reflétant ainsi le taux de chimérisme.
3. Analyse du chimérisme d’organe solide
   REMARQUE : À 16 semaines après la transplantation, les chimères de la BM, de la rate et du thymus ont été analysées dans le groupe traité par 5 Gy BM et le groupe traité par ostéo-organoïde 5 Gy.
   1. Répétez les étapes 5.1.1 à 5.1.4 pour obtenir les pastilles de cellules dérivées du BM.
   2. Placez un filtre en nylon de 300 mailles au-dessus d’une boîte de culture cellulaire (6 cm) contenant 1 mL de HBSS (pas de Ca²⁺, Mg²⁺).
   3. Placez la rate ou le thymus disséqué sur le filtre en nylon.
   4. Broyez les organes mentionnés à l’aide du bouchon en caoutchouc avant d’une seringue de 5 ml jusqu’à ce qu’il ne reste plus de structure tissulaire évidente, seulement du tissu fibreux résiduel. Manipulez les cellules avec précaution pour assurer leur viabilité.
   5. Prélever le filtrat et centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
   6. Retirez le surnageant pour obtenir les précipités cellulaires dérivés de la rate ou du thymus.
   7. Ajouter 1 mL de tampon de lyse des globules rouges aux pastilles cellulaires obtenues aux étapes 6.3.1 et 6.3.6 et laisser agir pendant 3 à 5 minutes.
   8. Répéter les étapes 6.2.3 à 6.2.8 pour la coloration et l’analyse par cytométrie en flux.
   9. Analyser davantage les données obtenues à l’aide d’un logiciel de cytométrie en flux pour obtenir des informations sur le taux de chimérisme des HSPC dans les organes solides (BM, rate et thymus) des souris receveuses dans le groupe 5 Gy natif traité par BM et le groupe 5 Gy traité par ostéo-organoïde.
      REMARQUE : Pour l’analyse des données de cytométrie en flux, se référer à la figure supplémentaire S2 pour les stratégies de contrôle typiques utilisées pour identifier les cellules CD45.1⁺ dérivées du donneur dans la BM, la rate et le thymus des receveurs de CD45.2.
   10. Remplacer le sang périphérique aux étapes 6.2.10 à 6.2.12 par la BM, la rate et le thymus pour obtenir le taux de chimérisme des organes solides.

Résultats

Conformément au protocole, nous avons créé un échafaudage bioactif en faisant couler du BMP-2 dans une éponge de gélatine dégradable dans des conditions stériles. L’échafaudage a ensuite été implanté dans les muscles des membres inférieurs de souris pour établir in vivo des ostéo-organoïdes. Après une période d’incubation de 12 semaines, nous avons effectué une photographie macroscopique, une analyse histologique et une analyse par cytométrie en flux sur ...

Discussion

Dans ce protocole, nous présentons une approche permettant d’établir in vivo des ostéo-organoïdes avec des structures semblables à celles de la moelle osseuse en implantant des échafaudages en éponge de gélatine chargés de BMP-2. Nous démontrons que ces ostéo-organoïdes in vivo peuvent produire de manière stable des HSPC thérapeutiques sur une longue période de temps (plus de 12 semaines). Par rapport aux méthodes d’expansion in vitro ou d?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AF700-anti-CD11b (M1/70)	eBioscience	56-0112-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
AF700-anti-Sca-1 (D7)	BioLegend	108141	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
APC-anti-CD3e (145-2C11)	Tonbo	20-0031-U100	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
bio-anti-CD34 (RAM34)	eBioscience	13-0341-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV421-anti-CD127 (IL-7Rα)	BioLegend	135023	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV510-anti-CD48 (HM48-1)	BioLegend	103443	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV711-anti-CD16/32 (93)	BioLegend	101337	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Capillary tube	Shanghai Huake Labware Co.	DC616297403604-100mm/0.5mm
Cell strainer	CORNING	352340
Ethanol	GENERAL-REAGENT	01158566
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) solution	Servicebio	G1105
Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt dihydrate (EDTA-K2)	Solarbio	E8651
FITC-anti-CD45.2 (104)	BioLegend	109806	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Flowjo	Becton, Dickinson & Company		A flow cytometry.
Gelatin sponge	Jiangxi Xiangen Co.		Use under sterile conditions.
HBSS without Ca2+ and Mg2+	Gibco	14170112	HBSS without Ca2+ and Mg2+ can prevent cell aggregation.
Hematology analyzer	Sysmex	pocH-100i Diff
iodine swabs	Xiangtan Mulan Biological Technology Co., Ltd.	01011	To prevent the infection after operation.
Isoflurane	RWD	R510-22-10	To avoid adverse effects of anesthesia waste gases on the environment and laboratory personnel, a gas recovery system should be used in conjunction.
Kraft paper			absorbent paper
LIVE/DEAD Fixable Near IR Dead Cell Staining Kit(used in 3.4.5)	Thermo Fisher Scientific	L34962	A live/dead staining kit. Store at -20 °C. Dissolve in 50 μL of DMSO for working solution.
lubricating vet ointment	Pfizer		To prevent dryness and counteract the ocular irritations caused by isoflurane.
Neutral balsam	Solarbio	G8590
nylon filter	Shanghai Shangshai Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd.		Used for cell filtration.
Paraffin liquid	Macklin	P815706
Paraformaldehyde (PFA) solution	Servicebio	G1101	Immersion fixation is used for routine animal tissues. The volume of fixative used is generally 10-20 times the tissue volume, and fixation at room temperature for 24 hours is sufficient.
PE-anti-CD45.1 (A20)	BioLegend	110708	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-CF594-anti-CD135 (A2F10.1)	BD Biosciences	562537	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy5-anti-c-kit (2B8)	BD Biosciences	105809	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-B220 (RA3-6B2)	BioLegend	103222	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-CD150 (TC15-12F12.2)	BioLegend	115914	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Dazzle594-anti-CD4 (GK1.5)	BioLegend	100456	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Pentobarbital sodium salt	Sigma-Aldrich	57-33-0	Prepare for use at a concentration of 1% (w/v).
PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (53-6.7)	BioLegend	100734	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PerCp-Cy5.5-anti-lineage cocktail	BD Biosciences	561317	Store at 4 °C. Dilute 1:10  for staining.
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702	Store at 4 °C. Use in clean bench.
rhBMP-2	Shanghai Rebone Biomaterials Co.		The concentration of rhBMP-2 in the stock solution is 1.0 mg/mL.
Staining buffer	BioLegend	420201	Store at 4 °C.
Xylene	GENERAL-REAGENT	01018114
Zombie UV Fixable Viability Kit (used in 6.2.5)	BioLegend	423108	A live/dead staining kit. For reconstitution, bring the kit to room temperature; add 100 µL of DMSO to one vial of Zombie UV dye until fully dissolved.