Abordagem osteoorganoide in vivo para coleta de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas terapêuticas

Resumo

Aqui, estabelecemos osteo-organoides in vivo desencadeados por andaimes de gelatina carregados com proteína 2 morfogenética óssea para colher células-tronco / progenitoras hematopoiéticas terapêuticas para a reconstrução de um sistema hematopoiético e imunológico danificado. No geral, essa abordagem pode fornecer uma fonte celular promissora para terapias celulares.

Resumo

O transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) requer um número suficiente de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas terapêuticas (HSPCs). Para identificar uma fonte adequada de HSPCs, desenvolvemos um osteo-organoide in vivo implantando andaimes carregados com proteína morfogenética óssea humana recombinante-2 (rhBMP-2) em uma bolsa muscular interna perto do fêmur em camundongos. Após 12 semanas de implantação, recuperamos os osteoorganoides in vivo e realizamos análises de citometria de fluxo em HPSCs, revelando uma presença significativa de subconjuntos de HSPC dentro dos osteoorganoides in vivo .

Em seguida, estabelecemos um modelo subletal de lesão hematopoiética / do sistema imunológico em camundongos por meio de radiação e realizamos o transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) injetando as células derivadas de osteo-organoides extraídas no sangue periférico de camundongos irradiados. O efeito da recuperação hematopoiética foi avaliado por meio de análises hematológicas, de quimerismo do sangue periférico e de quimerismo de órgãos sólidos. Os resultados confirmaram que as células derivadas de osteo-organoides in vivo podem reconstruir de forma rápida e eficiente órgãos imunológicos periféricos e sólidos danificados em camundongos irradiados. Essa abordagem tem potencial como fonte alternativa de HSPCs para TCTH, oferecendo benefícios a um número maior de pacientes.

Introdução

O transplante de células-tronco hematopoiéticas é a terapia convencional para uma variedade de malignidades hematológicas, bem como inúmeras doenças hereditárias e autoimunes 1,2,3,4. No entanto, a quantidade e origem restritas de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) surgiram como um impedimento substancial para a implementação clínica do transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH)^5,6.

A expansão celular in vitro em larga escala é um método comumente empregado para a coleta de células terapêuticas ^5,7. Vários estudos desenvolveram condições que estimulam as HSPCs a se auto-renovarem in vitro, normalmente por meio do uso de uma combinação de agonistas de autorrenovação (como citocinas e fatores de crescimento) e albumina sérica, resultando na expansão ex vivo das HSPCs⁸. No entanto, é importante notar que os métodos atuais ainda são demorados e desafiadores para manter a capacidade de autorrenovação dos HSPCs expandidos⁹.

Em contraste com o método acima mencionado, a colheita de células in vivo apresenta uma estratégia nova e inovadora. Essa abordagem envolve o estabelecimento de um osteoorganoide in vivo que mimetiza a estrutura nativa da medula óssea^10,11. Para conseguir isso, formamos osteo-organoides in vivo usando andaimes de gelatina carregados com proteína morfogenética óssea-2 (BMP-2) para obter coquetéis de células autólogas abundantes e de alta qualidade, incluindo HSPCs. Ao aplicar terapeuticamente esses osteo-organoides, tratamos com sucesso os danos da irradiação e demonstramos que os HSPCs derivados dos osteo-organoides podem reconstituir de forma rápida e estável o sistema imunológico experimentalmente prejudicado.

Protocolo

Camundongos C57BL/6 machos e fêmeas, com idades entre 8 e 10 semanas, foram incluídos no estudo. Todos os ratos foram alojados nas instalações de animais da Universidade de Ciência e Tecnologia da China Oriental. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Ciência e Tecnologia da China Oriental (ECUST-21010).

1. Fabricação de andaimes bioativos

1. Preparação
   1. Coloque a tesoura cirúrgica limpa e seca e a pinça em um copo de 1.000 mL. Enrole a boca do copo com papel absorvente e amarre-o firmemente com fio de algodão.
   2. Coloque o copo no esterilizador de alta pressão, feche bem a tampa, ajuste o programa de esterilização para 121 °C por 30 min e inicie o programa de esterilização.
   3. Após a conclusão do processo de esterilização, retirar e transferir o copo esterilizado para uma estufa de secagem regulada a 60 °C para secagem. Depois de completamente seco, borrife o copo com álcool 75% (v/v) e coloque-o na bancada limpa.
   4. Descongele a solução-mãe rhBMP-2 (1,0 mg/ml) 2 h antes do procedimento.
   5. Depois de descongelado à temperatura ambiente, transfira a solução de estoque rhBMP-2 e a esponja de gelatina fechada para a bancada limpa estéril para a fabricação de andaimes bioativos.
      1. Corte a esponja de gelatina (60 mm x 20 mm x 5 mm) em 48 pedaços de tamanho uniforme (5 mm x 5 mm x 5 mm) (Figura 1B) com a tesoura esterilizada e transfira-os para uma placa de 48 poços.
      2. Misture a solução estoque rhBMP-2 pipetando para cima e para baixo suavemente para garantir uma mistura uniforme, tomando cuidado para evitar bolhas. Aspirar 30 μL da solução e adicioná-lo gota a gota à esponja de gelatina.
      3. Sele a placa de 48 poços usando uma camada de parafilme para facilitar o processo de liofilização subsequente. Retire o prato que contém a esponja de gelatina da bancada limpa. Coloque-o a -20 °C para ser congelado. Simultaneamente, ligue o liofilizador e pré-resfrie-o a uma faixa de temperatura de -50 °C a -60 °C.
      4. Após congelar por 2 h, coloque a placa de poço com esponjas de gelatina no liofilizador por 12 h. Para manter a secura e esterilidade das amostras, aplique uma camada adicional de parafilme para selar a placa do poço após a liofilização. Guarde-o em uma geladeira a -20 °C.

2. Implantação cirúrgica de scaffolds bioativos

NOTA: Todos os instrumentos cirúrgicos são esterilizados para uso.

1. Jejue os camundongos por 1 h antes da anestesia. Aplique uma pomada veterinária lubrificante ao redor dos olhos dos camundongos para reduzir o desconforto pós-operatório causado pelo ressecamento na área dos olhos. Anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal de solução a 1% (p / v) de pentobarbital sódico (na dose de 48 mg / kg).
   NOTA: Este protocolo usa o método eticamente aprovado de anestesia com injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico. Outros métodos, como inalação de isoflurano ou injeção intraperitoneal de cetamina-xilazina, também podem ser usados após aprovação.
2. Confirme a profundidade da anestesia em camundongos procurando os seguintes sinais em um camundongo supino: batimentos cardíacos e respiração constantes, músculos relaxados, membros imóveis, bigodes que não respondem ao toque e ausência de reflexo pedal. Além disso, aperte a pele dos camundongos com uma pinça dentada ou estimule os dedos dos pés ou as patas dos camundongos. Se os camundongos apresentarem reações sensíveis, a anestesia é muito leve; Administre anestesia adicional. Depois que o plano anestésico for alcançado, transfira os camundongos para a área cirúrgica na posição reclinada lateral direita para implantar facilmente o andaime bioativo na perna esquerda.
3. Raspe o cabelo da perna esquerda usando uma máquina de barbear. Desinfete a área raspada usando rodadas alternadas de clorexidina e álcool 3 vezes cada e faça incisões na perna traseira, localizada na lateral do músculo vasto lateral. Use tesoura oftálmica para fazer incisões de aproximadamente 3,0 mm de comprimento, estendendo-se ao longo da direção da tíbia.
   NOTA: Para manter as condições estéreis durante a cirurgia, os itens cirúrgicos usados devem ser armazenados em locais designados. Os suprimentos estéreis devem ser colocados em uma área limpa para evitar o contato com outras pessoas que não o operador. Os instrumentos cirúrgicos reutilizáveis devem ser prontamente desinfetados com etanol a 75% (v/v). Minimize a duração da cirurgia para reduzir a exposição das feridas ao ar e diminuir o risco de infecção.
4. Para criar a loja para o implante, abra a fáscia na face distal do músculo vasto lateral, em direção à tíbia.
5. Use uma pinça oftálmica para moldar o andaime bioativo em um cilindro, com aproximadamente 5 mm de altura e 5 mm de diâmetro. Implante o andaime na bolsa muscular ao longo da fenda muscular criada por tesoura oftálmica e feche a bolsa do implante com um padrão de sutura interrompido através da fáscia. Feche a incisão na pele usando uma sutura 4-0.
   NOTA: A ocorrência de convulsões ou micção em animais durante o procedimento cirúrgico indica anestesia excessivamente profunda, necessitando de implementação imediata de medidas de emergência.
6. Repita as etapas 2.3-2.5 e implante outro andaime bioativo na bolsa do músculo femoral direito dos camundongos. Use cotonetes de iodo para limpar os locais cirúrgicos e de injeção dos camundongos após a cirurgia para prevenir infecções.
   NOTA: Apenas um implante pode ser inserido em cada músculo vasto lateral.
7. Colocar os ratinhos numa plataforma de temperatura constante a 37 °C até acordarem após a experiência. Vire os ratos a cada 10-15 minutos para evitar o acúmulo de sangue. Após a cirurgia, além de manter o calor, monitore os camundongos pós-operatórios sem deixar o animal sem vigilância até que ele recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Preste muita atenção aos indicadores importantes dos camundongos, como frequência cardíaca e frequência respiratória.
   NOTA: O tremor dos membros anteriores em camundongos significa o início da fase de recuperação.
8. Coloque os ratos de volta em uma gaiola estéril que foi desinfetada com pulverização de álcool e irradiação ultravioleta. Não coloque o animal que foi submetido a cirurgia com outros animais até que ele esteja totalmente recuperado. Além disso, administre meloxicam para controlar a dor pós-operatória por pelo menos um dia, com a opção de estender até três dias para um controle mais intenso da dor. Verifique o animal e a ferida regularmente durante o período pós-operatório de 72 horas para identificar possíveis efeitos adversos. Se a infecção for detectada posteriormente, eutanasiar os animais anestesiando primeiro os camundongos por meio de injeção intraperitoneal de uma solução a 1% (p / v) de pentobarbital sódico (na dose de 48 mg / kg), seguida de luxação cervical após a anestesia.

3. Caracterização de osteo-organoides in vivo 12 semanas após a implantação

NOTA: Os andaimes bioativos se desenvolverão in vivo para formar osteo-organoides após a implantação.

1. Coleção de osteo-organoides in vivo
   1. Quando os osteo-organoides in vivo tiverem sido implantados por 12 semanas, anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal de solução a 1% (p / v) de pentobarbital sódico (na dose de 48 mg / kg), seguida de luxação cervical após a anestesia.
      NOTA: Para minimizar os danos aos animais, os camundongos devem ser anestesiados antes da eutanásia por luxação cervical.
   2. Pulverize álcool 75% (v/v) na pele no local da dissecção.
   3. Desconecte o membro posterior do tronco e remova o músculo dos osteo-organoides usando uma tesoura em miniatura com cuidado.
   4. Remova os tecidos moles presos com gaze.
   5. Fixe alguns osteo-organoides em uma solução de paraformaldeído (PFA) a 4% (v / v) por 24 h em temperatura ambiente para análise histológica. Utilize as amostras restantes para fotografia macroscópica e análise de citometria de fluxo de HPSCs.
2. Imagens macroscópicas
   1. Coloque os osteo-organoides em uma placa de fundo azul e fotografe-os com uma câmera digital.
3. Análise histológica
   1. Preparação para coloração histológica
      1. Transfira os osteo-organoides da solução de PFA para água ultrapura e deixe de molho por 1 h.
      2. Substitua a água ultrapura por solução de ácido etilenodiamina tetracético (EDTA) 0,5 M para descalcificação por 1 semana.
      3. Coloque os lenços descalcificados em um de embutir e mergulhe o em água ultrapura por 1 h.
      4. Para desidratação gradiente, mergulhar o de embutimento em etanol em concentrações variadas (v/v): 75%, 80%, 90% e 95% por uma duração de 1 h cada, seguido de imersão em etanol 100% (v/v) I e II por 1 h cada.
         NOTA: "100% (v/v) etanol I e II" indica que o de embutir deve ser imerso uma vez no "recipiente I" cheio de etanol 100% (v/v) e depois imerso uma segunda vez no "recipiente II" cheio de etanol 100% (v/v).
      5. Após a desidratação, colocar os tecidos embebidos sequencialmente em uma mistura de xileno a 100% (v/v) e etanol absoluto (xileno: relação volume de etanol de 1:1) por 1 h e xileno I e II a 100% (v/v) por 30 min cada.
      6. Mergulhar os tecidos em parafina I e II a uma temperatura constante de 60 °C durante 2 h cada.
      7. Para embutir os tecidos embebidos em cera usando uma máquina de embutir, coloque a cera derretida no molde de embutir. Antes que a cera solidifique, retire os lenços do recipiente de desidratação e coloque-os no molde de embutir; rotule-os de acordo. Resfrie o molde a -20 °C e, depois que a cera solidificar, remova o bloco de cera do molde de incorporação e corte-o.
      8. Corte os blocos de cera embutidos em seções de 4,5 μm de espessura usando um cortador de parafina e, em seguida, fixe as seções em lâminas de vidro.
      9. Cozer brevemente as secções a 40 °C e, em seguida, recolhê-las e guardá-las numa caixa de amostras.
   2. Coloração H&E
      1. Coloque as seções em uma grade de amostras e leve ao forno a 60 °C por 30 min.
      2. Desparafinizar as seções em xileno e etanol. Coloque sequencialmente as seções de parafina em xileno I por 10 min, xileno II por 10 min, xileno III por 10 min, etanol absoluto I por 5 min, etanol absoluto II por 5 min, etanol 90% (v/v) por 5 min, etanol 80% (v/v) por 5 min, etanol 70% (v/v) por 5 min, etanol 50% (v/v) por 5 min e transfira para água pura para um processo de desparafinação gradiente.
      3. Mergulhe as seções na solução de coloração de hematoxilina por 2 min e depois enxágue-as em água corrente por 10 min.
      4. Mergulhe as seções em solução de coloração de eosina por 2 min.
      5. Sequencialmente, coloque as seções em etanol a 75% (v/v) por 2 min, etanol a 85% (v/v) por 2 min, etanol absoluto por 5 min, etanol absoluto por 5 min e xileno por 5 min para desidratação.
      6. Retire as seções de xileno e sele-as com bálsamo neutro.
      7. Observe as seções sob o microscópio e capture imagens representativas com uma ampliação de 10x após a secagem do bálsamo neutro.
4. Análise de citometria de fluxo para HPSCs
   1. Colocar os osteo-organoides in vivo obtidos no passo 3.1 numa argamassa e adicionar uma quantidade adequada de tampão de coloração. Corte os osteo-organoides em fragmentos com um diâmetro de 1-3 mm usando uma tesoura oftálmica e esmague-os no tampão de coloração usando o almofariz e o pilão. Pressione verticalmente em vez de triturar os fragmentos dos osteo-organoides in vivo usando um pilão para evitar um declínio na taxa de sobrevivência celular.
   2. Recolher a suspensão celular para um tubo de centrifugação e centrifugá-los a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
   3. Remova o sobrenadante e adicione 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos para lisar as células por 3-5 min.
   4. Lave as células com 1 mL de tampão de coloração e filtre-as através de um filtro de náilon de malha 300 em um tubo de citometria de fluxo de 5 mL.
   5. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante. Corar os restantes cerca de 100 μL (células) no fundo do tubo de citometria de fluxo a 4 °C durante 30 min utilizando anticorpos, incluindo um kit de coloração vivo/morto, Peridinina clorofila proteína-cianina 5.5 (PerCp-Cy5.5) -anti-linhagem (1:10), Ficoeritrina-cianina5 (PE-Cy5)-anti-c-kit (1:200), Alexa Fluor 700 (AF700) - anti-células estaminais-1 (Sca-1) (1:200), Violeta brilhante 711 (BV711) - anti-CD16/32 (1:200), bio-anti-CD34 (1:200), BV421-anti-CD127 (1:200), PE-CF594-anti-CD135 (1:200), BV510-anti-CD48 (1:200) e PE-Cy7-anti-CD150 (1:200).
   6. Ressuspenda as células com 1 ml de solução salina equilibrada de Hanks (HBSS) sem Ca²⁺ e Mg²⁺ e centrifugue a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
   7. Aspire o sobrenadante e core com anticorpo secundário PE-estreptavidina (1:200) por mais 60 minutos a 4 °C.
   8. Ressuspenda as células com 1 mL de HBSS (sem Ca²⁺, Mg²⁺) e centrifugue a 300 × g por 5 min a 4 °C.
   9. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com 300 μL de HBSS (sem Ca²⁺, Mg²⁺).
   10. Vortex a solução para realizar análises adicionais de citometria de fluxo. Analise ainda mais os dados obtidos usando o software de citometria de fluxo para obter dados quantitativos sobre HSPCs.
       NOTA: A coleta e análise de dados da citometria de fluxo referem-se aos nossos artigos anteriores e materiais de apoio (Figura Suplementar S1) para as estratégias típicas de gating usadas para identificar HSPCs¹⁰.
   11. Estabeleça um gráfico de pontos de área de dispersão lateral (SSC-A) versus área de dispersão direta (FSC-A) e bloqueie a região circundante da população de células de interesse (P1) no gráfico de pontos SSC-A vs FSC-A durante a aquisição de dados em um citômetro de fluxo. Clique duas vezes na porta P1; selecione a altura de dispersão direta (FSC-H) para o eixo X e a largura de dispersão direta (FSC-W) para o eixo Y para realizar o primeiro tratamento de adesão celular. Clique duas vezes no portão de células únicas; selecione a altura de dispersão lateral (SSC-H) para o eixo X e a largura de dispersão lateral (SSC-W) para o eixo Y para realizar o tratamento de adesão da segunda célula. Use a ferramenta de passagem retangular para selecionar as células individuais.
   12. Exclua células mortas. Distinguir células vivas de células mortas detectando marcadores de viabilidade. Estabeleça um gráfico de pontos de SSC-A vs Vivo/Morto e gate a região correspondente às células vivas, nomeando-a "células vivas".
   13. Rastreie as células marcadas com anticorpos específicos em "células vivas". Exclua a população de células que pode ser afetada pela expressão positiva de anticorpos específicos da linhagem na linhagem de células-tronco hematopoiéticas/progenitoras mieloides usando gating de linhagem negativa (lin^-). Portão ^{das células} lineares.
   14. Rastreie diferentes subpopulações de células dentro das ^lin-cells. Clique duas vezes no portão ^lin-cells; selecione Sca-1-AF700 para o eixo X e c-kit-PE-Cy5 para o eixo Y. Gate as células c-kit⁺Sca-1^- como as células LKS^-, as células c-kit⁺Sca-1⁺ como as células LKS⁺ e as células com baixa expressão de c-kit e Sca-1 como as células LK^loS^lo. Clique duas vezes na porta LKS e selecione CD34-PE para o eixo X e FCγR-BV711 para o eixo Y. Clique duas vezes no portão LKS⁺; selecione FIt3-PE-CF594 para o eixo X e IL7Rα-BV421 para o eixo Y e selecione CD150-PE-Cy7 para o eixo X e CD48-BV510 para o eixo Y.
   15. Com base na especificidade dos anticorpos, identifique portões positivos ou negativos para distinguir subpopulações celulares: células-tronco hematopoiéticas (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁺CD48⁻CD150⁺) e progenitores hematopoiéticos diferenciados: progenitores multipotentes (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁺CD48⁻CD150⁻), progenitores linfóides comuns (Lin⁻c-kit-Sca-1-Flt3⁺IL7Rα⁺), progenitores mielóides comuns (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁺FCγR⁻), progenitores de granulócitos-monócitos (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁺FCγR⁺) e progenitores eritróides de megacariócitos (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁻FCγR⁻).

4. Modelo de irradiação de camundongos

NOTA: Os camundongos C57BL / 6 foram irradiados com raios-X usando um irradiador de raios-X.

1. Para alcançar o comprometimento subletal do sistema hematopoiético/imunológico, exponha camundongos do tipo selvagem (WT) no grupo tratado com solução salina tamponada com fosfato de 5 Gray (Gy) (PBS), o grupo tratado com medula óssea nativa (BM) de 5 Gy e o grupo tratado com osteoorganoides de 5 Gy à irradiação de 5 Gy (1,25 Gy/min) 24 h antes do transplante.
   NOTA: Certifique-se de que os camundongos WT no grupo tratado com PBS 0 Gy sejam tratados com PBS e não sejam submetidos à irradiação.

5. Processo de terapia celular

NOTA: Todos os procedimentos devem ser feitos em condições estéreis.

1. Aquisição de células derivadas de osteo-organoides e nativas da medula óssea in vivo
   1. Implante dois andaimes bioativos na bolsa muscular de camundongos C57BL / 6.SJL-Ptprca Pepcb / BoyJ (CD45.1) e incube-os por 12 semanas para formar os osteo-organoides in vivo . Colher dois osteo-organoides in vivo e dois fêmures de um camundongo CD45.1 mencionado acima. Em seguida, limpe o tecido mole na superfície dos osteo-organoides e fêmures usando fórceps e gaze.
   2. Coloque separadamente os osteo-organoides e fêmures em uma argamassa e adicione 1 mL de HBSS (sem Ca²⁺, Mg²⁺).
      NOTA: HBSS sem Ca²⁺ e Mg²⁺ pode reduzir a agregação celular. A solução utilizada para o transplante não deve conter componentes séricos para evitar potenciais reações de rejeição.
   3. Corte as amostras com uma tesoura cirúrgica e esmague-as suavemente em um pilão.
   4. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 40 μm e centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
   5. Remova o sobrenadante e ressuspenda os grânulos celulares com 300 μL de HBSS (sem Ca²⁺, Mg²⁺). Misture bem para obter uma suspensão de células derivadas de osteo-organoides ou células inteiras da medula óssea.
      NOTA: Para utilizar totalmente os coquetéis celulares derivados do osteo-organoide in vivo, optamos por usar células inteiras da medula óssea para terapia. O número típico de células totais em um osteo-organoide in vivo induzido por BMP-2 de 30 μg é de 30.000.000-40.000.000.
2. Injeção do seio venoso orbital
   NOTA: Células da medula óssea total CD45.1⁺ coletadas de osteo-organoides ou fêmures in vivo foram injetadas através do seio venoso orbital no receptor C57BL/6 (CD45.2) subletalmente irradiado, respectivamente. A injeção do seio venoso orbital e a injeção da veia da cauda são métodos comumente usados em experimentos com animais. A injeção do seio venoso orbitário foi escolhida devido à sua simplicidade e baixa taxa de falha para iniciantes. Durante o processo de injeção orbital, certas medidas de proteção precisam ser tomadas, como pré-anestesiar os camundongos, usar uma placa aquecida para reduzir o risco de hipotermia e conter mecanicamente os camundongos para evitar o movimento.
   1. Coloque os camundongos CD45.2 em uma câmara de pré-anestesia e induza a anestesia com isoflurano. Aplique uma pomada veterinária lubrificante ao redor dos olhos dos camundongos para evitar o ressecamento e neutralizar as irritações oculares causadas pelo isoflurano.
      NOTA: Para minimizar os danos aos animais, a anestesia com isoflurano é administrada a camundongos antes da injeção do seio venoso orbital.
   2. Transfira os camundongos para a mesa de anestesia para anestesia adicional.
   3. Para reduzir a probabilidade de hipotermia em camundongos, coloque o camundongo irradiado e anestesiado em uma almofada de aquecimento termostática ajustada a 37 ° C.
   4. Coloque o mouse em decúbito lateral esquerdo com a cabeça voltada para a direita após ser totalmente anestesiado.
   5. Para projetar o olho, coloque um dedo no topo da cabeça e ao longo da linha da mandíbula. Puxe suavemente a pele para trás e para baixo.
   6. Utilizar uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de 25 G para aspirar 200 μL da suspensão in vivo de células derivadas de osteo-organoides ou da suspensão de células nativas derivadas da medula óssea de ratinhos CD45.1⁺ obtidos no passo 5.1.5.
   7. Introduza cuidadosamente a agulha, chanfrada para baixo, em um ângulo de aproximadamente 30°, no canto medial.
      NOTA: As injeções geralmente são administradas com o chanfro da agulha para cima, mas para injeções retroorbitais, é melhor posicionar o chanfro da agulha para baixo para reduzir o risco de danos aos olhos.
   8. Use a agulha para seguir a borda do globo ocular para baixo até que a ponta da agulha esteja na base do olho.
   9. Injete lenta e suavemente o injetado.
   10. Após a conclusão da injeção, coloque o mouse de volta em sua gaiola para recuperação.

6. Avaliação dos efeitos do tratamento

1. Análise hematológica
   NOTA: Para analisar a hematologia dos receptores em ensaios de reconstituição do sistema imunológico, coletamos amostras de sangue periférico de receptores submetidos a diferentes tratamentos: tratamento com PBS de 0 Gy, tratamento de PBS de 5 Gy, tratamento de BM nativo de 5 Gy e tratamento osteoorganoide de 5 Gy. As amostras de sangue foram obtidas por punção retro-orbital 2 dias antes e 2, 4, 8, 12 e 16 semanas após o transplante. Uma parte da amostra de sangue do mesmo grupo foi usada para análise hematológica, enquanto a outra parte foi usada para análise de quimerismo. Existem diferentes métodos de coleta de sangue, como através da veia submandibular ou da veia da cauda. A punção retro-orbital é um dos métodos comuns de amostragem de sangue em camundongos e é permitida em condições éticas.
   1. Repita as etapas 5.2.1-5.2.5 para anestesiar os camundongos e projetar os olhos dos camundongos.
      NOTA: Para mitigar os danos aos animais, a anestesia com isoflurano é administrada aos camundongos antes da amostragem de sangue por punção retroorbital.
   2. Posicione o tubo capilar com um diâmetro de 0,5 mm no canto medial do olho e direcione-o caudalmente em um ângulo de 30 ° a 45 ° em relação ao plano do nariz.
   3. Gire o tubo capilar suavemente enquanto aplica pressão, permitindo que ele penetre nas membranas conjuntivais. Permita que o sangue flua para o tubo capilar por ação capilar.
   4. Aplique pressão contínua depois que o sangue começar a fluir para manter o fluxo.
   5. Depois de tirar 100 μL de sangue, libere a pressão no pescoço imediatamente. Simultaneamente, remova o tubo capilar para permitir que o olho retorne à posição normal para evitar sangramento pós-operatório do local da punção.
   6. Expulse imediatamente o sangue para um tubo de centrífuga que tenha sido lavado com solução de sal dipotássico de ácido etilenodiamina tetracético a 1,5% (p / v) (EDTA-K2) e, em seguida, adicionado 10 μL de solução de EDTA-K2 a 1,5% (p / v). Agite suavemente o tubo da centrífuga para garantir uma mistura completa da solução de EDTA-K2 e sangue, evitando a coagulação.
   7. Depois de limpar a ferida com algodão estéril e aplicar uma leve pressão para parar o sangramento, observe os camundongos por 1-2 minutos após a hemostasia para garantir que não haja anormalidades e, em seguida, devolva-os às suas gaiolas.
   8. Realize análises hematológicas em uma parte das amostras de sangue de cada grupo usando um analisador hematológico, incluindo as contagens de glóbulos brancos (leucócitos), glóbulos vermelhos (RBC) e plaquetas (PLT).
      NOTA: Analise todas as amostras de sangue dentro de 2 h após a coleta.
2. Análise do quimerismo do sangue periférico
   NOTA: Semelhante à análise hematológica, amostras de sangue periférico dos grupos 5 Gy tratados com BM nativo e 5 Gy tratados com osteo-organoides foram coletadas por punção retro-orbital 2, 4, 8, 12 e 16 semanas após o transplante.
   1. Use a outra porção da amostra de sangue periférico obtida na etapa 6.1 para análise do quimerismo do sangue periférico.
   2. Adicione 1 mL de tampão de lise eritrocitária à amostra e lise por 3-5 min. Inverta a amostra de cabeça para baixo suavemente para facilitar uma melhor lise dos glóbulos vermelhos.
   3. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
   4. Descarte o sobrenadante e adicione 1 mL de HBSS (sem Ca²⁺, Mg²⁺) para ressuspender o pellet.
   5. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante. Manchar os restantes cerca de 100 μL de células no fundo do tubo de centrifugação a 4 °C durante 30 min utilizando anticorpos, incluindo um kit de coloração vivo/morto, PE-anti-CD45.1 (1:200), isotiocianato de fluoresceína (FITC)-anti-CD45.2 (1:200), PE-Cy7-anti-B220 (1:200), AF700-anti-CD11b (1:200), PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (1:200), PE-Dazzle594-anti-CD4 (1:200) e aloficocianina (APC)-anti-CD3e (1:200).
   6. Ressuspenda as células com 1 mL de HBSS (sem Ca²⁺, Mg²⁺) e centrifugue a 300 × g por 5 min a 4 °C.
   7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com 300 μL de HBSS (sem Ca²⁺, Mg²⁺).
   8. Vortex a suspensão para realizar análises adicionais de citometria de fluxo.
   9. Analise ainda mais os dados obtidos usando software de citometria de fluxo para obter informações sobre a taxa de quimerismo de HSPCs no sangue periférico de camundongos receptores no grupo tratado com BM nativo de 5 Gy e no grupo tratado com osteo-organoide de 5 Gy.
      NOTA: Para a análise dos dados de citometria de fluxo, consulte a Figura Suplementar S2 para as estratégias típicas de gating usadas para ^{identificar células} CD45.1+ derivadas de doadores no sangue periférico de receptores CD45.2.
   10. Repita as etapas 3.4.11-3.4.12 para bloquear a região correspondente às células vivas.
   11. Analise o quimerismo do sangue periférico identificando inicialmente as populações de células e, posteriormente, discernindo as células do doador e do receptor.
       1. Rastreie células marcadas com anticorpos específicos dentro de células vivas. Selecione CD11b-AF700 para o eixo X e B220-PE-Cy7 para o eixo Y. Gate as células B220⁺CD11b^- como células B, as células B220-CD11b⁺ como células mielóides e as células B220-CD11b^- como células duplamente negativas (DN).
       2. Clique duas vezes na porta de células DN, usando CD3-APC para o eixo X e SSC-A para o eixo Y. ^Bloqueie as células CD3+ como células T.
       3. Clique duas vezes na porta de células CD3⁺, selecionando CD4-PE-Dazzle594 para o eixo X e CD8-PerCp-Cy5.5 para o eixo Y. Gate as células CD8 ⁺ CD4^- como células T citotóxicas (CTL) e as células CD8-CD4 ⁺ como células T reguladoras (Treg).
   12. Finalmente, a análise do quimerismo do sangue periférico é realizada nas células do doador e do receptor. Dentro das populações de células designadas, clique duas vezes para selecionar CD45.1-PE para o eixo X e CD45.2-FITC para o eixo Y. Bloqueie as células CD45.1⁺ e realize a contagem de células para determinar a proporção de células CD45.1⁺ dentro da população de células, refletindo assim a taxa de quimerismo.
3. Análise do quimerismo de órgãos sólidos
   NOTA: Às 16 semanas após o transplante, as quimeras de MO, baço e timo foram analisadas no grupo tratado com 5 Gy de BM e no grupo de 5 Gy tratado com osteo-organoide.
   1. Repita as etapas 5.1.1-5.1.4 para obter os pellets de células derivados do BM.
   2. Coloque um filtro de náilon de malha 300 acima de uma placa de cultura de células (6 cm) contendo 1 mL de HBSS (sem Ca²⁺, Mg²⁺).
   3. Coloque o baço ou timo dissecado no filtro de nylon.
   4. Triture os órgãos mencionados usando a rolha de borracha frontal de uma seringa de 5 mL até que nenhuma estrutura de tecido óbvia permaneça, apenas tecido fibroso residual. Manuseie as células com cuidado para garantir a viabilidade celular.
   5. Recolher o filtrado e centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
   6. Remover o sobrenadante para obter os precipitados celulares derivados do baço ou do timo.
   7. Adicione 1 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos aos grânulos celulares obtidos nos passos 6.3.1 e 6.3.6 e lise durante 3-5 min.
   8. Repita as etapas 6.2.3-6.2.8 para coloração e análise de citometria de fluxo.
   9. Analise ainda mais os dados obtidos usando o software de citometria de fluxo para obter informações sobre a taxa de quimerismo de HSPCs nos órgãos sólidos (MO, baço e timo) de camundongos receptores no grupo tratado com BM nativo de 5 Gy e no grupo tratado com osteo-organoide de 5 Gy.
      NOTA: Para a análise de dados de citometria de fluxo, consulte a Figura Suplementar S2 para as estratégias típicas de gating usadas para ^{identificar células} CD45.1+ derivadas de doadores em MO, baço e timo de receptores CD45.2.
   10. Substitua o sangue periférico nas etapas 6.2.10-6.2.12 por MO, baço e timo para obter a taxa de quimerismo de órgãos sólidos.

Resultados

De acordo com o protocolo, criamos um andaime bioativo pingando BMP-2 em uma esponja de gelatina degradável em condições estéreis. O andaime foi então implantado nos músculos dos membros inferiores de camundongos para estabelecer osteo-organoides in vivo . Após um período de incubação de 12 semanas, realizamos fotografia macroscópica, análise histológica e análise de citometria de fluxo nos osteo-organoides (Figura 1A). A esponja de ge...

Discussão

Neste protocolo, apresentamos uma abordagem para estabelecer osteo-organoides in vivo com estruturas semelhantes à medula óssea por meio do implante de scaffolds de esponja de gelatina carregados com BMP-2. Demonstramos que esses osteoorganoides in vivo podem produzir HSPCs terapêuticos de forma estável por um longo período de tempo (mais de 12 semanas). Em comparação com os métodos existentes de expansão in vitro ou incubação in vivo que ca...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AF700-anti-CD11b (M1/70)	eBioscience	56-0112-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
AF700-anti-Sca-1 (D7)	BioLegend	108141	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
APC-anti-CD3e (145-2C11)	Tonbo	20-0031-U100	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
bio-anti-CD34 (RAM34)	eBioscience	13-0341-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV421-anti-CD127 (IL-7Rα)	BioLegend	135023	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV510-anti-CD48 (HM48-1)	BioLegend	103443	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV711-anti-CD16/32 (93)	BioLegend	101337	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Capillary tube	Shanghai Huake Labware Co.	DC616297403604-100mm/0.5mm
Cell strainer	CORNING	352340
Ethanol	GENERAL-REAGENT	01158566
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) solution	Servicebio	G1105
Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt dihydrate (EDTA-K2)	Solarbio	E8651
FITC-anti-CD45.2 (104)	BioLegend	109806	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Flowjo	Becton, Dickinson & Company		A flow cytometry.
Gelatin sponge	Jiangxi Xiangen Co.		Use under sterile conditions.
HBSS without Ca2+ and Mg2+	Gibco	14170112	HBSS without Ca2+ and Mg2+ can prevent cell aggregation.
Hematology analyzer	Sysmex	pocH-100i Diff
iodine swabs	Xiangtan Mulan Biological Technology Co., Ltd.	01011	To prevent the infection after operation.
Isoflurane	RWD	R510-22-10	To avoid adverse effects of anesthesia waste gases on the environment and laboratory personnel, a gas recovery system should be used in conjunction.
Kraft paper			absorbent paper
LIVE/DEAD Fixable Near IR Dead Cell Staining Kit(used in 3.4.5)	Thermo Fisher Scientific	L34962	A live/dead staining kit. Store at -20 °C. Dissolve in 50 μL of DMSO for working solution.
lubricating vet ointment	Pfizer		To prevent dryness and counteract the ocular irritations caused by isoflurane.
Neutral balsam	Solarbio	G8590
nylon filter	Shanghai Shangshai Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd.		Used for cell filtration.
Paraffin liquid	Macklin	P815706
Paraformaldehyde (PFA) solution	Servicebio	G1101	Immersion fixation is used for routine animal tissues. The volume of fixative used is generally 10-20 times the tissue volume, and fixation at room temperature for 24 hours is sufficient.
PE-anti-CD45.1 (A20)	BioLegend	110708	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-CF594-anti-CD135 (A2F10.1)	BD Biosciences	562537	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy5-anti-c-kit (2B8)	BD Biosciences	105809	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-B220 (RA3-6B2)	BioLegend	103222	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-CD150 (TC15-12F12.2)	BioLegend	115914	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Dazzle594-anti-CD4 (GK1.5)	BioLegend	100456	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Pentobarbital sodium salt	Sigma-Aldrich	57-33-0	Prepare for use at a concentration of 1% (w/v).
PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (53-6.7)	BioLegend	100734	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PerCp-Cy5.5-anti-lineage cocktail	BD Biosciences	561317	Store at 4 °C. Dilute 1:10  for staining.
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702	Store at 4 °C. Use in clean bench.
rhBMP-2	Shanghai Rebone Biomaterials Co.		The concentration of rhBMP-2 in the stock solution is 1.0 mg/mL.
Staining buffer	BioLegend	420201	Store at 4 °C.
Xylene	GENERAL-REAGENT	01018114
Zombie UV Fixable Viability Kit (used in 6.2.5)	BioLegend	423108	A live/dead staining kit. For reconstitution, bring the kit to room temperature; add 100 µL of DMSO to one vial of Zombie UV dye until fully dissolved.