Enfoque osteo-organoide in vivo para la recolección de células madre/progenitoras hematopoyéticas terapéuticas

Resumen

Aquí, establecimos osteoorganoides in vivo activados por andamios de gelatina cargados con proteína morfogenética ósea 2 para recolectar células madre/progenitoras hematopoyéticas terapéuticas para la reconstrucción de un sistema hematopoyético e inmunológico dañado. En general, este enfoque puede proporcionar una fuente celular prometedora para las terapias celulares.

Resumen

El trasplante de células madre hematopoyéticas (TCMH) requiere un número suficiente de células madre/progenitoras hematopoyéticas terapéuticas (HSPC). Para identificar una fuente adecuada de HSPCs, desarrollamos un osteo-organoide in vivo mediante la implantación de andamios cargados con proteína morfogenética ósea humana recombinante-2 (rhBMP-2) en una bolsa muscular interna cerca del fémur en ratones. Después de 12 semanas de la implantación, recuperamos los osteoorganoides in vivo y realizamos un análisis de citometría de flujo en HPSC, revelando una presencia significativa de subconjuntos de HSPC dentro de los osteoorganoides in vivo .

A continuación, establecimos un modelo subletal de lesión del sistema hematopoyético/inmunitario en ratones a través de la radiación y realizamos un trasplante de células madre hematopoyéticas (TCMH) inyectando las células derivadas de osteoorganoides extraídas en la sangre periférica de ratones radiados. El efecto de la recuperación hematopoyética se evaluó mediante análisis hematológicos, de quimerismo de sangre periférica y de quimerismo de órganos sólidos. Los resultados confirmaron que las células derivadas de osteoorganoides in vivo pueden reconstruir rápida y eficazmente órganos inmunitarios periféricos y sólidos dañados en ratones irradiados. Este enfoque tiene potencial como una fuente alternativa de HSPC para el TCMH, ofreciendo beneficios a un mayor número de pacientes.

Introducción

El trasplante de células madre hematopoyéticas se presenta como la terapia convencional para una variedad de neoplasias malignas hematológicas, así como para numerosos trastornos hereditarios y autoinmunes 1,2,3,4. Sin embargo, la cantidad restringida y el origen de las células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) han surgido como un impedimento sustancial para la implementación clínica del trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT)^5,6.

La expansión celular in vitro a gran escala es un método comúnmente empleado para recolectar células terapéuticas ^5,7. Diversos estudios han desarrollado condiciones que estimulan a las HSPC a autorrenovarse in vitro, generalmente mediante el uso de una combinación de agonistas de autorrenovación (como citocinas y factores de crecimiento) y albúmina sérica, lo que resulta en la expansión ex vivo de las HSPC⁸. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los métodos actuales siguen siendo lentos y desafiantes para mantener la capacidad de autorrenovación de los HSPC ampliados⁹.

En contraste con el método antes mencionado, la recolección de células in vivo presenta una estrategia nueva e innovadora. Este abordaje implica el establecimiento de un osteoorganoide in vivo que imita la estructura nativa de la médula ósea^10,11. Para lograr esto, formamos osteoorganoides in vivo utilizando andamios de gelatina cargados con proteína morfogenética ósea-2 (BMP-2) para obtener cócteles de células autólogas abundantes y de alta calidad, incluidas las HSPC. Mediante la aplicación terapéutica de estos osteoorganoides, hemos tratado con éxito el daño por irradiación y hemos demostrado que las HSPC derivadas de los osteoorganoides pueden reconstituir de forma rápida y estable el sistema inmunitario dañado experimentalmente.

Protocolo

Se incluyeron en el estudio ratones machos y hembras C57BL/6, de 8 a 10 semanas de edad. Todos los ratones fueron alojados en las instalaciones de animales de la Universidad de Ciencia y Tecnología del Este de China. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Ciencia y Tecnología del Este de China (ECUST-21010).

1. Fabricación de andamios bioactivos

1. Preparación
   1. Coloque las tijeras quirúrgicas y las pinzas limpias y secas en un vaso de precipitados de 1.000 ml. Envuelve la boca del vaso con papel absorbente y átalo bien con hilo de algodón.
   2. Coloque el vaso de precipitados en el esterilizador de alta presión, cierre bien la tapa, ajuste el programa de esterilización a 121 °C durante 30 minutos e inicie el programa de esterilización.
   3. Una vez finalizado el proceso de esterilización, retire y transfiera el vaso de precipitados esterilizado a un horno de secado a 60 °C para su secado. Una vez que esté completamente seco, rocíe el vaso de precipitados con alcohol al 75% (v/v) y colóquelo en el banco limpio.
   4. Descongele la solución madre de rhBMP-2 (1,0 mg/ml) 2 h antes del procedimiento.
   5. Una vez descongelado a temperatura ambiente, transfiera la solución madre rhBMP-2 y la esponja de gelatina sin abrir al banco limpio estéril para la fabricación de andamios bioactivos.
      1. Corta la esponja de gelatina (60 mm x 20 mm x 5 mm) en 48 pedazos de tamaño uniforme (5 mm x 5 mm x 5 mm) (Figura 1B) con las tijeras esterilizadas y transfiérelos a un plato de 48 pocillos.
      2. Mezcle la solución madre rhBMP-2 pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para asegurar una mezcla uniforme, teniendo cuidado de evitar burbujas. Aspire 30 μL de la solución y agréguela gota a gota a la esponja de gelatina.
      3. Selle la placa de 48 pocillos con una capa de parafilm para facilitar el posterior proceso de liofilización. Saca el plato que contiene la esponja de gelatina del banco limpio. Colócalo a -20 °C para congelarlo. Al mismo tiempo, encienda el liofilizador y preenfríelo a un rango de temperatura de -50 °C a -60 °C.
      4. Después de congelar durante 2 h, coloque la placa de pocillos con esponjas de gelatina en el liofilizador durante 12 h. Para mantener la sequedad y esterilidad de las muestras, aplique una capa adicional de parafilm para sellar la placa del pocillo después de la liofilización. Guárdelo en un refrigerador a -20 °C.

2. Implantación quirúrgica de andamios bioactivos

NOTA: Todos los instrumentos quirúrgicos están esterilizados para su uso.

1. Ayuna a los ratones durante 1 hora antes de la anestesia. Aplique una pomada veterinaria lubricante alrededor de los ojos de los ratones para reducir las molestias postoperatorias causadas por la sequedad en el área de los ojos. Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de solución de pentobarbital sódico al 1% (p/v) (a una dosis de 48 mg/kg).
   NOTA: Este protocolo utiliza el método de anestesia éticamente aprobado con inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico. Otros métodos, como la inhalación de isoflurano o la inyección intraperitoneal de ketamina-xilacina, también se pueden utilizar después de la aprobación.
2. Confirme la profundidad de la anestesia en ratones buscando los siguientes signos en un ratón supino: latidos cardíacos y respiración constantes, músculos relajados, extremidades inmóviles, bigotes que no responden al tacto y ausencia de un reflejo pedal. Además, pellizca la piel de los ratones con pinzas dentadas o estimula los dedos de los pies o las patas de los ratones. Si los ratones muestran reacciones sensibles, la anestesia es demasiado ligera; Administre anestesia adicional. Una vez alcanzado el plano anestésico, se transfieren los ratones a la zona quirúrgica en posición recostada lateral derecha para implantar fácilmente el andamio bioactivo en la pierna izquierda.
3. Afeita el vello de la pierna izquierda con una máquina de afeitar. Desinfecte el área afeitada con rondas alternas de clorhexidina y alcohol 3 veces cada una, y cree incisiones en la pata trasera, ubicada en el lado lateral del músculo vasto lateral. Utilice tijeras oftálmicas para hacer incisiones de aproximadamente 3,0 mm de longitud, que se extiendan a lo largo de la dirección de la tibia.
   NOTA: Para mantener las condiciones estériles durante la cirugía, los artículos quirúrgicos usados deben almacenarse en los lugares designados. Los suministros estériles deben colocarse en un área limpia para evitar el contacto con personas que no sean el operador. Los instrumentos quirúrgicos reutilizables deben desinfectarse rápidamente con etanol al 75% (v/v). Minimice la duración de la cirugía para reducir la exposición de las heridas al aire y disminuir el riesgo de infección.
4. Para crear el bolsillo para el implante, abra la fascia en la cara distal del músculo vasto lateral, hacia la tibia.
5. Utilice pinzas oftálmicas para dar forma al andamio bioactivo en un cilindro, de aproximadamente 5 mm de altura y 5 mm de diámetro. Implante el andamio en la bolsa muscular a lo largo de la hendidura muscular creada por las tijeras oftálmicas y cierre la bolsa del implante con un patrón de sutura interrumpido a través de la fascia. Cierre la incisión en la piel con una sutura 4-0.
   NOTA: La aparición de convulsiones o micción en los animales durante el procedimiento quirúrgico indica una anestesia excesivamente profunda, lo que requiere la implementación inmediata de medidas de emergencia.
6. Repita los pasos 2.3-2.5 e implante otro andamio bioactivo en la bolsa del músculo femoral derecho de los ratones. Use hisopos de yodo para limpiar los sitios quirúrgicos y de inyección de los ratones después de la cirugía para prevenir infecciones.
   NOTA: Solo se puede insertar un implante en cada músculo vasto lateral.
7. Coloque a los ratones en una plataforma de temperatura constante a 37 °C hasta que se despierten después del experimento. Dale la vuelta a los ratones cada 10-15 minutos para evitar que la sangre se acumule. Después de la cirugía, además de mantener el calor, monitoree a los ratones postoperatorios sin dejar al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener el decúbito esternal. Preste mucha atención a los indicadores importantes de los ratones, como la frecuencia cardíaca y la frecuencia respiratoria.
   NOTA: El temblor de las extremidades anteriores en ratones significa el inicio de la fase de recuperación.
8. Vuelva a colocar a los ratones en una jaula estéril que haya sido desinfectada con rociado de alcohol e irradiación ultravioleta. No coloque al animal que ha sido sometido a una cirugía con otros animales hasta que se haya recuperado por completo. Además, administre meloxicam para controlar el dolor postoperatorio durante al menos un día, con la opción de extenderlo hasta tres días para un manejo más intensivo del dolor. Revise al animal y la herida regularmente durante el período postoperatorio de 72 horas para identificar cualquier efecto adverso potencial. Si la infección se detecta más tarde, se debe sacrificar a los animales anestesiando primero a los ratones mediante una inyección intraperitoneal de una solución de pentobarbital sódico al 1% (p/v) (a una dosis de 48 mg/kg), seguida de una luxación cervical después de la anestesia.

3. Caracterización de osteoorganoides in vivo 12 semanas después de la implantación

NOTA: Los andamios bioactivos se desarrollarán in vivo para formar osteoorganoides después de la implantación.

1. Colección de osteoorganoides in vivo
   1. Una vez implantados los osteoorganoides in vivo durante 12 semanas, anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de solución de pentobarbital sódico al 1% (p/v) (a una dosis de 48 mg/kg), seguida de luxación cervical después de la anestesia.
      NOTA: Para minimizar el daño a los animales, los ratones deben ser anestesiados antes de la eutanasia por dislocación cervical.
   2. Rocíe alcohol al 75% (v/v) sobre la piel en el sitio de la disección.
   3. Desconecte la extremidad trasera del tronco y retire el músculo de los osteoorganoides con unas tijeras en miniatura con cuidado.
   4. Retire los tejidos blandos adheridos con una gasa.
   5. Fijar algunos osteoorganoides en una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% (v/v) durante 24 h a temperatura ambiente para el análisis histológico. Utilice las muestras restantes para la fotografía macroscópica y el análisis de citometría de flujo de HPSC.
2. Imágenes macroscópicas
   1. Coloque los osteo-organoides en una placa de fondo azul y fotografíelos con una cámara digital.
3. Análisis histológico
   1. Preparación para la tinción histológica
      1. Transfiera los osteoorganoides de la solución de PFA a agua ultrapura y remoje durante 1 h.
      2. Reemplace el agua ultrapura con una solución de ácido etilendiaminérgico tetraacético (EDTA) 0,5 M para la descalcificación durante 1 semana.
      3. Coloque los pañuelos descalcificados en un casete de inclusión y sumerja el casete en agua ultrapura durante 1 h.
      4. Para la deshidratación en gradiente, sumerja el casete de inclusión en etanol a concentraciones variables (v/v): 75%, 80%, 90% y 95% durante 1 h cada una, seguido de una inmersión en etanol I y II al 100% (v/v) durante 1 h cada uno.
         NOTA: "100% (v/v) etanol I y II" indica que el casete de inclusión debe sumergirse una vez en el "contenedor I" lleno de etanol al 100% (v/v) y luego sumergirse una segunda vez en el "contenedor II" lleno con etanol al 100% (v/v).
      5. Después de la deshidratación, coloque los tejidos incrustados secuencialmente en una mezcla de xileno al 100% (v/v) y etanol absoluto (xileno: relación de volumen de etanol de 1:1) durante 1 h y xileno 100% (v/v) I y II durante 30 min cada uno.
      6. Sumergir los tejidos en parafina I y II a una temperatura constante de 60 °C durante 2 h cada uno.
      7. Para incrustar los pañuelos empapados en cera con una máquina de incrustación, coloque la cera derretida en el molde de incrustación. Antes de que la cera se solidifique, retire los tejidos del recipiente de deshidratación y colóquelos en el molde de inclusión; etiquételos en consecuencia. Enfríe el molde a -20 °C en condiciones de congelación y, después de que la cera se solidifique, retire el bloque de cera del molde de inclusión y recórtelo.
      8. Corta los bloques de cera incrustados en secciones de 4,5 μm de grosor con una cortadora de parafina y luego pega las secciones a portaobjetos de vidrio.
      9. Hornee brevemente las secciones a 40 °C y luego recójalas y guárdelas en una caja de muestras.
   2. Tinción de H&E
      1. Coloque las secciones en una rejilla de muestras y hornee en un horno de secado a 60 °C durante 30 min.
      2. Desparafinar las secciones en xileno y etanol. Coloque secuencialmente las secciones de parafina en xileno I durante 10 minutos, xileno II durante 10 minutos, xileno III durante 10 minutos, etanol absoluto I durante 5 minutos, etanol absoluto II durante 5 minutos, etanol al 90% (v/v) durante 5 minutos, etanol al 80% (v/v) durante 5 minutos, etanol al 70% (v/v) durante 5 minutos, etanol al 50% (v/v) durante 5 minutos y transfiéralo a agua pura para un proceso de desparafinado en gradiente.
      3. Sumerja las secciones en la solución de tinción de hematoxilina durante 2 minutos, luego enjuáguelas con agua corriente durante 10 minutos.
      4. Sumerja las secciones en una solución de tinción de eosina durante 2 min.
      5. Coloque secuencialmente las secciones en etanol al 75% (v/v) durante 2 min, etanol al 85% (v/v) durante 2 min, etanol absoluto durante 5 min, etanol absoluto durante 5 min y xileno durante 5 min para deshidratación.
      6. Saca las secciones de xileno y séllalas con bálsamo neutro.
      7. Observe las secciones bajo el microscopio y capture imágenes representativas con un aumento de 10x después de que el bálsamo neutro se haya secado.
4. Análisis de citometría de flujo para HPSC
   1. Colocar los osteoorganoides in vivo obtenidos en el paso 3.1 en un mortero y añadir una cantidad adecuada de tampón de tinción. Cortar los osteoorganoides en fragmentos de 1-3 mm de diámetro con unas tijeras oftálmicas y triturarlos en el tampón de tinción con el mortero. Presione verticalmente en lugar de moler los fragmentos de los osteoorganoides in vivo utilizando un mortero para evitar una disminución en la tasa de supervivencia celular.
   2. Recoja la suspensión de la célula en un tubo de centrífuga y centrifugue a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
   3. Retire el sobrenadante y agregue 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos para lisar las células durante 3-5 minutos.
   4. Lave las células con 1 mL de tampón de tinción y fíltrelas a través de un filtro de nylon de malla 300 en un tubo de citometría de flujo de 5 mL.
   5. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Teñir los aproximadamente 100 μL restantes (células) en la parte inferior del tubo de citometría de flujo a 4 °C durante 30 min utilizando anticuerpos, incluido un kit de tinción vivo/muerto, Proteína de clorofila de peridina-Cianina5.5 (PerCp-Cy5.5)-cóctel anti-linaje (1:10), Ficoeritrina-Cianina5 (PE-Cy5)-kit anti-c-(1:200), Alexa Fluor 700(AF700)-anti-Antígeno de células madre-1(Sca-1) (1:200), Violeta brillante 711(BV711)-anti-CD16/32 (1:200), bio-anti-CD34 (1:200), BV421-anti-CD127 (1:200), PE-CF594-anti-CD135 (1:200), BV510-anti-CD48 (1:200) y PE-Cy7-anti-CD150 (1:200).
   6. Vuelva a suspender las células con 1 mL de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) sin Ca²⁺ y Mg²⁺ y centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
   7. Aspirar el sobrenadante y teñir con el anticuerpo secundario PE-estreptavidina (1:200) durante 60 min adicionales a 4 °C.
   8. Vuelva a suspender las células con 1 mL de HBSS (sin Ca²⁺, Mg²⁺) y centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
   9. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células con 300 μL de HBSS (sin Ca²⁺, Mg²⁺).
   10. Vortex es la solución para realizar más análisis de citometría de flujo. Analice más a fondo los datos obtenidos utilizando software de citometría de flujo para obtener datos cuantitativos sobre HSPC.
       NOTA: La recopilación de datos y el análisis de la citometría de flujo se refieren a nuestros artículos anteriores y a los materiales de apoyo (Figura complementaria S1) para conocer las estrategias típicas de compuerta utilizadas para identificar las HSPC¹⁰.
   11. Establezca un diagrama de puntos de área de dispersión lateral (SSC-A) frente a área de dispersión directa (FSC-A) y controle la región circundante de la población de células de interés (P1) en el diagrama de puntos SSC-A frente a FSC-A durante la adquisición de datos en un citómetro de flujo. Haga doble clic en la puerta P1; seleccione la altura de dispersión hacia adelante (FSC-H) para el eje X y el ancho de dispersión hacia adelante (FSC-W) para el eje Y para realizar el primer tratamiento de adhesión de celdas. Haga doble clic en la puerta de celdas individuales; seleccione la altura de dispersión lateral (SSC-H) para el eje X y el ancho de dispersión lateral (SSC-W) para el eje Y para realizar el tratamiento de adhesión de la segunda celda. Utilice la herramienta de compuerta rectangular para seleccionar las celdas individuales.
   12. Excluir las células muertas. Distinga las células vivas de las células muertas mediante la detección de marcadores de viabilidad. Establezca un diagrama de puntos de SSC-A frente a Vivo/Muerto y controle la región correspondiente a las células vivas, nombrándola "células vivas".
   13. Examinar las células marcadas con anticuerpos específicos en "células vivas". Excluir la población celular que puede verse afectada por la expresión positiva de anticuerpos específicos del linaje en el linaje de células madre/progenitoras hematopoyéticas mieloides mediante el uso de la activación negativa al linaje (lin^-). Puerta de las celdas lin^-
   14. Cribado de diferentes subpoblaciones de células dentro de las células lin^- . Haga doble clic en la puerta ^de las celdas lineales; seleccione Sca-1-AF700 para el eje X y c-kit-PE-Cy5 para el eje Y. Cierre las celdas c-kit ⁺ Sca-1^- como las celdas LKS, las celdas c-kit ⁺ Sca-1⁺ como las celdas LKS⁺ y las celdas con baja expresión de c-kit y Sca-1 como las celdas LK^loS^lo. Haga doble clic en la puerta LKS^- y seleccione CD34-PE para el eje X y FCγR-BV711 para el eje Y. Haga doble clic en la puerta LKS⁺; seleccione FIt3-PE-CF594 para el eje X e IL7Rα-BV421 para el eje Y y seleccione CD150-PE-Cy7 para el eje X y CD48-BV510 para el eje Y.
   15. Con base en la especificidad de los anticuerpos, identifique las puertas positivas o negativas para distinguir las subpoblaciones celulares: células madre hematopoyéticas (^{Lin-c-kit +} Sca-1 ⁺ CD48 ⁻CD150 ⁺) y progenitores hematopoyéticos diferenciados: progenitores multipotentes (Lin⁻c-kit ⁺ Sca-1 ⁺ CD48 ⁻ CD150⁻), progenitores linfoides comunes (Lin⁻c-kit-Sca-1-Flt3 ⁺ IL7Rα⁺), progenitores mieloides comunes (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁺FCγR⁻), progenitores de granulocitos monocitos (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁺FCγR⁺) y progenitores eritroides de megacariocitos (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁻FCγR⁻).

4. Modelo de irradiación de ratón

NOTA: Los ratones C57BL/6 fueron irradiados con rayos X utilizando un irradiador de rayos X.

1. Para lograr un deterioro subletal del sistema hematopoyético/inmunitario, exponga a los ratones de tipo salvaje (WT) del grupo tratado con solución salina tamponada con fosfato (PBS) de 5 Gray (Gy), al grupo tratado con médula ósea nativa (BM) de 5 Gy y al grupo tratado con osteoorganoides de 5 Gy a una irradiación de 5 Gy (1,25 Gy/min) 24 h antes del trasplante.
   NOTA: Asegúrese de que los ratones WT en el grupo tratado con PBS de 0 Gy sean tratados con PBS y no se sometan a irradiación.

5. Proceso de terapia celular

NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en condiciones estériles.

1. Adquisición in vivo de células derivadas de osteo-organoides y células nativas derivadas de la médula ósea
   1. Implante dos andamios bioactivos en la bolsa muscular de ratones C57BL/6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (CD45.1) y los incube durante 12 semanas para formar los osteoorganoides in vivo . Recolecta dos osteoorganoides in vivo y dos fémures de un ratón CD45.1 mencionado anteriormente. Posteriormente, limpie el tejido blando de la superficie de los osteoorganoides y fémures con pinzas y gasas.
   2. Coloque por separado los osteoorganoides y los fémures en un mortero y agregue 1 mL de HBSS (no Ca²⁺, Mg²⁺).
      NOTA: El HBSS sin Ca²⁺ y Mg²⁺ puede reducir la agregación celular. La solución utilizada para el trasplante no debe contener componentes séricos para evitar posibles reacciones de rechazo.
   3. Corta las muestras con unas tijeras quirúrgicas y tritúralas suavemente en un mortero.
   4. Filtrar la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 μm y centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
   5. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares con 300 μL de HBSS (sin Ca²⁺, Mg²⁺). Mezclar bien para obtener una suspensión de células derivadas de osteo-organoides o células enteras de la médula ósea.
      NOTA: Para utilizar completamente los cócteles celulares derivados del osteo-organoide in vivo, elegimos usar células de médula ósea entera para la terapia. El número típico de células totales en un osteoorganoide in vivo inducido in vivo por BMP-2 de 30 μg es de 30.000.000 a 40.000.000.
2. Inyección de seno venoso orbitario
   NOTA: Las células de médula ósea entera CD45.1⁺ recogidas de osteoorganoides o fémures in vivo se inyectaron a través del seno venoso orbitario en el receptor C57BL/6 (CD45.2) irradiado subletalmente, respectivamente. La inyección del seno venoso orbitario y la inyección de la vena de la cola son métodos comúnmente utilizados en experimentos con animales. Se eligió la inyección del seno venoso orbitario debido a su simplicidad y baja tasa de fracaso para los principiantes. Durante el proceso de inyección orbital, se deben tomar ciertas medidas de protección, como la preanestesia de los ratones, el uso de una placa calentada para reducir el riesgo de hipotermia y la restricción mecánica de los ratones para evitar el movimiento.
   1. Colocar los ratones CD45.2 en una cámara de preanestesia e inducir la anestesia con isoflurano. Aplique una pomada veterinaria lubricante alrededor de los ojos de los ratones para prevenir la sequedad y contrarrestar las irritaciones oculares causadas por el isoflurano.
      NOTA: Para minimizar el daño a los animales, se administra anestesia con isoflurano a los ratones antes de la inyección del seno venoso orbitario.
   2. Transfiera los ratones a la mesa de anestesia para recibir más anestesia.
   3. Para reducir la probabilidad de hipotermia en ratones, coloque el ratón irradiado y anestesiado sobre una almohadilla térmica termostática a 37 °C.
   4. Coloque el ratón en decúbito lateral izquierdo con la cabeza hacia la derecha después de estar completamente anestesiado.
   5. Para protuberar el ojo, coloque un dedo en la parte superior de la cabeza y a lo largo de la línea de la mandíbula. Tire suavemente de la piel hacia atrás y hacia abajo.
   6. Utilice una jeringa de 1 ml provista de una aguja de 25 G para aspirar 200 μl de la suspensión celular in vivo derivada de osteoorganoides o de la suspensión celular nativa derivada de la médula ósea de ratones CD45.1⁺ obtenida en el paso 5.1.5.
   7. Introduzca con cuidado la aguja, biselada hacia abajo, en un ángulo de aproximadamente 30°, en el canto medial.
      NOTA: Las inyecciones generalmente se administran con el bisel de la aguja hacia arriba, pero para las inyecciones retroorbitarias, es mejor colocar el bisel de la aguja hacia abajo para reducir el riesgo de daño ocular.
   8. Use la aguja para seguir el borde del globo ocular hacia abajo hasta que la punta de la aguja esté en la base del ojo.
   9. Inyecte lenta y suavemente la inyección.
   10. Una vez completada la inyección, vuelva a colocar el ratón en su jaula para su recuperación.

6. Evaluación de los efectos del tratamiento

1. Análisis hematológico
   NOTA: Para analizar la hematología de los receptores en los ensayos de reconstitución del sistema inmune, se recolectaron muestras de sangre periférica de receptores sometidos a diferentes tratamientos: tratamiento con 0 Gy PBS, tratamiento con 5 Gy PBS, tratamiento con 5 Gy con BM nativo y 5 Gy tratamiento con osteoorganoides. Las muestras de sangre se obtuvieron mediante punción retroorbitaria 2 días antes y 2, 4, 8, 12 y 16 semanas después del trasplante. Una porción de la muestra de sangre del mismo grupo se utilizó para el análisis hematológico, mientras que la otra parte se utilizó para el análisis de quimerismo. Existen diferentes métodos de toma de muestras de sangre, como a través de la vena submandibular o la vena de la cola. La punción retroorbitaria es uno de los métodos comunes para la toma de muestras de sangre en ratones y está permitida bajo condiciones éticas.
   1. Repita los pasos 5.2.1-5.2.5 para anestesiar a los ratones y protruir los ojos de los ratones.
      NOTA: Para mitigar el daño a los animales, se administra anestesia con isoflurano a los ratones antes de la toma de muestras de sangre por punción retroorbital.
   2. Coloque el tubo capilar con un diámetro de 0,5 mm en el canto medial del ojo y diríjalo caudalmente en un ángulo de 30°-45° con respecto al plano de la nariz.
   3. Gire el tubo capilar suavemente mientras aplica presión, permitiendo que penetre a través de las membranas conjuntivales. Permita que la sangre fluya hacia el tubo capilar a través de la acción capilar.
   4. Aplique presión continua después de que la sangre comience a fluir para mantener el flujo.
   5. Después de extraer 100 μL de sangre, libere la presión sobre el cuello inmediatamente. Al mismo tiempo, retire el tubo capilar para permitir que el ojo vuelva a su posición normal y evitar el sangrado postoperatorio del sitio de punción.
   6. Expulsar rápidamente la sangre a un tubo de centrífuga que se había lavado con una solución de sal dipotásica dipotásica dipotásica (EDTA-K2) al 1,5% (p/v) y luego se le habían añadido 10 μL de solución de EDTA-K2 al 1,5% (p/v). Agite suavemente el tubo de centrífuga para asegurar una mezcla completa de la solución de EDTA-K2 y la sangre, evitando la formación de coágulos.
   7. Después de limpiar la herida con algodón estéril y aplicar una ligera presión para detener el sangrado, observe a los ratones durante 1-2 minutos después de la hemostasia para asegurarse de que no haya anomalías y luego devuélvalos a sus jaulas.
   8. Realizar análisis hematológicos en una porción de las muestras de sangre de cada grupo utilizando un analizador de hematología, incluidos los recuentos de glóbulos blancos (WBC), glóbulos rojos (RBC) y plaquetas (PLT).
      NOTA: Analice todas las muestras de sangre dentro de las 2 horas posteriores a la recolección.
2. Análisis del quimerismo de sangre periférica
   NOTA: De manera similar al análisis hematológico, se recolectaron muestras de sangre periférica de los grupos tratados con 5 Gy con BM nativo y 5 Gy tratados con osteoorganoides mediante punción retroorbitaria a las 2, 4, 8, 12 y 16 semanas después del trasplante.
   1. Utilice la otra porción de la muestra de sangre periférica obtenida en el paso 6.1 para el análisis del quimerismo de sangre periférica.
   2. Añadir 1 mL de tampón de lisis globular a la muestra y lisar durante 3-5 min. Invierta la muestra al revés suavemente para facilitar una mejor lisis de los glóbulos rojos.
   3. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
   4. Deseche el sobrenadante y agregue 1 mL de HBSS (no Ca²⁺, Mg²⁺) para resuspender el pellet.
   5. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Teñir los aproximadamente 100 μl restantes de células en la parte inferior del tubo de centrífuga a 4 °C durante 30 min utilizando anticuerpos, incluido un kit de tinción vivo/muerto, PE-anti-CD45.1 (1:200), isotiocianato de fluoresceína (FITC)-anti-CD45.2 (1:200), PE-Cy7-anti-B220 (1:200), AF700-anti-CD11b (1:200), PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (1:200), PE-Dazzle594-anti-CD4 (1:200) y aloficocianina (APC)-anti-CD3e (1:200).
   6. Vuelva a suspender las células con 1 mL de HBSS (sin Ca²⁺, Mg²⁺) y centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
   7. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células con 300 μL de HBSS (sin Ca²⁺, Mg²⁺).
   8. Agite la suspensión para realizar más análisis de citometría de flujo.
   9. Analice más a fondo los datos obtenidos utilizando software de citometría de flujo para obtener información sobre la tasa de quimerismo de las HSPC en la sangre periférica de los ratones receptores tanto en el grupo tratado con BM nativo de 5 Gy como en el grupo tratado con osteoorganoides de 5 Gy.
      NOTA: Para el análisis de los datos de citometría de flujo, consulte la Figura Suplementaria S2 para conocer las estrategias típicas de compuerta utilizadas para identificar las células CD45.1⁺ derivadas del donante en la sangre periférica de los receptores de CD45.2.
   10. Repita los pasos 3.4.11-3.4.12 para controlar la región correspondiente a las células vivas.
   11. Analice el quimerismo de la sangre periférica identificando inicialmente las poblaciones celulares y, posteriormente, discerniendo las células donantes y receptoras.
       1. Cribado de células marcadas con anticuerpos específicos dentro de células vivas. Seleccione CD11b-AF700 para el eje X y B220-PE-Cy7 para el eje Y. Bloquea las células B220⁺CD11b^- como células B, las células B220-CD11b⁺ como células mieloides y las células B220-CD11b^- como células dobles negativas (DN).
       2. Haga doble clic en la puerta de las celdas DN, utilizando CD3-APC para el eje X y SSC-A para el eje Y. Bloquea las células CD3⁺ como células T.
       3. Haga doble clic en la puerta de celdas CD3⁺, seleccionando CD4-PE-Dazzle594 para el eje X y CD8-PerCp-Cy5.5 para el eje Y. Bloquean las células CD8⁺CD4^- como células T citotóxicas (CTL) y las células CD8-CD4⁺ como células T reguladoras (Treg).
   12. Finalmente, se realiza un análisis de quimerismo de sangre periférica en las células donante y receptora. Dentro de las poblaciones de celdas designadas, haga doble clic para seleccionar CD45.1-PE para el eje X y CD45.2-FITC para el eje Y. Conecte las células CD45.1⁺ y realice el recuento de células para determinar la proporción de células CD45.1⁺ dentro de la población celular, reflejando así la tasa de quimerismo.
3. Análisis del quimerismo de órganos sólidos
   NOTA: A las 16 semanas después del trasplante, se analizaron las quimeras de BM, bazo y timo en el grupo tratado con 5 Gy BM y en el grupo tratado con osteoorganoides de 5 Gy.
   1. Repita los pasos 5.1.1-5.1.4 para obtener los gránulos de celda derivados del BM.
   2. Coloque un filtro de nylon de malla 300 sobre una placa de cultivo celular (6 cm) que contenga 1 mL de HBSS (no Ca²⁺, Mg²⁺).
   3. Coloque el bazo o el timo disecado en el filtro de nylon.
   4. Muela los órganos mencionados con el tapón de goma delantero de una jeringa de 5 ml hasta que no quede ninguna estructura tisular evidente, solo tejido fibroso residual. Manipule las células con cuidado para garantizar la viabilidad de la célula.
   5. Recoja el filtrado y la centrífuga a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
   6. Eliminar el sobrenadante para obtener los precipitados celulares derivados del bazo o del timo.
   7. Añadir 1 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos a los gránulos de células obtenidos en los pasos 6.3.1 y 6.3.6, y lisar durante 3-5 min.
   8. Repita los pasos 6.2.3-6.2.8 para el análisis de tinción y citometría de flujo.
   9. Analice más a fondo los datos obtenidos utilizando un software de citometría de flujo para obtener información sobre la tasa de quimerismo de las HSPC en los órganos sólidos (BM, bazo y timo) de los ratones receptores tanto en el grupo tratado con BM nativo de 5 Gy como en el grupo tratado con osteoorganoides de 5 Gy.
      NOTA: Para el análisis de los datos de citometría de flujo, consulte la Figura Suplementaria S2 para conocer las estrategias típicas de compuerta utilizadas para identificar las células CD45.1⁺ derivadas del donante en el BM, el bazo y el timo de los receptores de CD45.2.
   10. Reemplace la sangre periférica en los pasos 6.2.10-6.2.12 con BM, bazo y timo para obtener la tasa de quimerismo de los órganos sólidos.

Resultados

De acuerdo con el protocolo, hemos creado un andamio bioactivo mediante el goteo de BMP-2 en una esponja de gelatina degradable en condiciones estériles. A continuación, el andamio se implantó en los músculos de las extremidades inferiores de los ratones para establecer osteoorganoides in vivo . Después de un período de incubación de 12 semanas, realizamos fotografía macroscópica, análisis histológico y análisis de citometría de flujo en los osteoorganoides (

Discusión

En este protocolo, presentamos un enfoque para establecer osteo-organoides in vivo con estructuras similares a la médula ósea mediante la implantación de andamios de esponja de gelatina cargados con BMP-2. Demostramos que estos osteoorganoides in vivo pueden producir HSPCs terapéuticas de forma estable durante un largo periodo de tiempo (más de 12 semanas). En comparación con los métodos existentes de expansión in vitro o incubación in vivo qu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AF700-anti-CD11b (M1/70)	eBioscience	56-0112-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
AF700-anti-Sca-1 (D7)	BioLegend	108141	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
APC-anti-CD3e (145-2C11)	Tonbo	20-0031-U100	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
bio-anti-CD34 (RAM34)	eBioscience	13-0341-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV421-anti-CD127 (IL-7Rα)	BioLegend	135023	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV510-anti-CD48 (HM48-1)	BioLegend	103443	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV711-anti-CD16/32 (93)	BioLegend	101337	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Capillary tube	Shanghai Huake Labware Co.	DC616297403604-100mm/0.5mm
Cell strainer	CORNING	352340
Ethanol	GENERAL-REAGENT	01158566
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) solution	Servicebio	G1105
Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt dihydrate (EDTA-K2)	Solarbio	E8651
FITC-anti-CD45.2 (104)	BioLegend	109806	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Flowjo	Becton, Dickinson & Company		A flow cytometry.
Gelatin sponge	Jiangxi Xiangen Co.		Use under sterile conditions.
HBSS without Ca2+ and Mg2+	Gibco	14170112	HBSS without Ca2+ and Mg2+ can prevent cell aggregation.
Hematology analyzer	Sysmex	pocH-100i Diff
iodine swabs	Xiangtan Mulan Biological Technology Co., Ltd.	01011	To prevent the infection after operation.
Isoflurane	RWD	R510-22-10	To avoid adverse effects of anesthesia waste gases on the environment and laboratory personnel, a gas recovery system should be used in conjunction.
Kraft paper			absorbent paper
LIVE/DEAD Fixable Near IR Dead Cell Staining Kit(used in 3.4.5)	Thermo Fisher Scientific	L34962	A live/dead staining kit. Store at -20 °C. Dissolve in 50 μL of DMSO for working solution.
lubricating vet ointment	Pfizer		To prevent dryness and counteract the ocular irritations caused by isoflurane.
Neutral balsam	Solarbio	G8590
nylon filter	Shanghai Shangshai Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd.		Used for cell filtration.
Paraffin liquid	Macklin	P815706
Paraformaldehyde (PFA) solution	Servicebio	G1101	Immersion fixation is used for routine animal tissues. The volume of fixative used is generally 10-20 times the tissue volume, and fixation at room temperature for 24 hours is sufficient.
PE-anti-CD45.1 (A20)	BioLegend	110708	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-CF594-anti-CD135 (A2F10.1)	BD Biosciences	562537	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy5-anti-c-kit (2B8)	BD Biosciences	105809	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-B220 (RA3-6B2)	BioLegend	103222	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-CD150 (TC15-12F12.2)	BioLegend	115914	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Dazzle594-anti-CD4 (GK1.5)	BioLegend	100456	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Pentobarbital sodium salt	Sigma-Aldrich	57-33-0	Prepare for use at a concentration of 1% (w/v).
PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (53-6.7)	BioLegend	100734	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PerCp-Cy5.5-anti-lineage cocktail	BD Biosciences	561317	Store at 4 °C. Dilute 1:10  for staining.
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702	Store at 4 °C. Use in clean bench.
rhBMP-2	Shanghai Rebone Biomaterials Co.		The concentration of rhBMP-2 in the stock solution is 1.0 mg/mL.
Staining buffer	BioLegend	420201	Store at 4 °C.
Xylene	GENERAL-REAGENT	01018114
Zombie UV Fixable Viability Kit (used in 6.2.5)	BioLegend	423108	A live/dead staining kit. For reconstitution, bring the kit to room temperature; add 100 µL of DMSO to one vial of Zombie UV dye until fully dissolved.