In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit etablierten wir in vivo Osteo-Organoide, die durch knochenmorphogenetische Protein-2-beladene Gelatinegerüste ausgelöst wurden, um therapeutische hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen für die Rekonstruktion eines geschädigten hämatopoetischen und Immunsystems zu gewinnen. Insgesamt kann dieser Ansatz eine vielversprechende Zellquelle für Zelltherapien darstellen.

Zusammenfassung

Die hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) erfordert eine ausreichende Anzahl von therapeutischen hämatopoetischen Stamm-/Vorläuferzellen (HSPCs). Um eine adäquate Quelle für HSPCs zu identifizieren, entwickelten wir ein in vivo Osteo-Organoid, indem wir Gerüste, die mit rekombinantem humanem morphogenetischem Knochenprotein-2 (rhBMP-2) beladen waren, in einen internen Muskelbeutel in der Nähe des Femurs bei Mäusen implantierten. Nach 12 Wochen nach der Implantation haben wir die in vivo Osteo-Organoide entnommen und eine durchflusszytometrische Analyse an HPSCs durchgeführt, die ein signifikantes Vorhandensein von HSPC-Untergruppen in den in vivo Osteo-Organoiden zeigte.

Anschließend etablierten wir ein subletales Modell der Schädigung des hämatopoetischen Immunsystems bei Mäusen durch Bestrahlung und führten eine hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) durch, indem wir die extrahierten von Osteoorganoiden abgeleiteten Zellen in das periphere Blut von bestrahlten Mäusen injizierten. Die Wirkung der hämatopoetischen Erholung wurde durch hämatologische Analysen, Chimärismen des peripheren Blutes und Chimärismen fester Organe untersucht. Die Ergebnisse bestätigten, dass in vivo von Osteo-Organoiden abgeleitete Zellen in bestrahlten Mäusen schnell und effizient geschädigte periphere und feste Immunorgane rekonstruieren können. Dieser Ansatz birgt Potenzial als alternative Quelle für HSPCs für HSCT und bietet Vorteile für eine größere Anzahl von Patienten.

Einleitung

Die hämatopoetische Stammzelltransplantation ist die konventionelle Therapie für eine Vielzahl von hämatologischen Malignomen sowie für zahlreiche Erb- und Autoimmunerkrankungen 1,2,3,4. Dennoch haben sich die begrenzte Menge und Herkunft von hämatopoetischen Stamm-/Vorläuferzellen (HSPCs) als wesentliches Hindernis für die klinische Durchführung der hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) ^erwiesen5,6.

Die großflächige In-vitro-Zellexpansion ist eine häufig eingesetzte Methode zur Gewinnung therapeutischer Zellen ^5,7. In verschiedenen Studien wurden Bedingungen entwickelt, die HSPCs dazu anregen, sich in vitro selbst zu erneuern, typischerweise durch die Verwendung einer Kombination aus Selbsterneuerungsagonisten (wie Zytokinen und Wachstumsfaktoren) und Serumalbumin, was zu einer Ex-vivo-Expansion von HSPCs führt⁸. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die derzeitigen Methoden immer noch zeitaufwändig und herausfordernd sind, um die Selbsterneuerungsfähigkeit erweiterter HSPCs aufrechtzuerhalten⁹.

Im Gegensatz zu der oben genannten Methode stellt die Zellernte in vivo eine neue und innovative Strategie dar. Dieser Ansatz beinhaltet die Etablierung eines in vivo Osteo-Organoids, das die native Knochenmarkstruktur nachahmt^10,11. Um dies zu erreichen, bilden wir in vivo Osteo-Organoide unter Verwendung von knochenmorphogenetischen Protein-2 (BMP-2)-beladenen Gelatinegerüsten, um reichlich und qualitativ hochwertige autologe Zellcocktails, einschließlich HSPCs, zu erhalten. Durch die therapeutische Anwendung dieser Osteo-Organoide haben wir erfolgreich Strahlenschäden behandelt und gezeigt, dass HSPCs, die von den Osteo-Organoiden abgeleitet werden, das experimentell beeinträchtigte Immunsystem schnell und stabil rekonstituieren können.

Protokoll

Männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 8-10 Wochen wurden in die Studie eingeschlossen. Alle Mäuse wurden in der Tierhaltung der East China University of Science and Technology untergebracht. Alle Versuchsverfahren wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees der East China University of Science and Technology (ECUST-21010) genehmigt.

1. Herstellung eines bioaktiven Gerüsts

1. Präparat
   1. Geben Sie die gereinigte und getrocknete chirurgische Schere und Pinzette in ein 1.000-ml-Becherglas. Wickeln Sie die Öffnung des Bechers mit saugfähigem Papier ein und binden Sie es mit Baumwollfaden fest.
   2. Setzen Sie das Becherglas in den Hochdrucksterilisator ein, schließen Sie den Deckel fest, stellen Sie das Sterilisationsprogramm für 30 min auf 121 °C ein und starten Sie das Sterilisationsprogramm.
   3. Nach Abschluss des Sterilisationsvorgangs wird das sterilisierte Becherglas herausgenommen und zum Trocknen in einen auf 60 °C eingestellten Trockenofen gebracht. Sobald es vollständig getrocknet ist, besprühen Sie das Becherglas mit 75% (v/v) Alkohol und stellen Sie es auf die Reinbank.
   4. Tauen Sie die rhBMP-2-Stammlösung (1,0 mg/ml) 2 Stunden vor dem Eingriff auf.
   5. Nach dem Auftauen auf Raumtemperatur die rhBMP-2-Stammlösung und den ungeöffneten Gelatineschwamm zur Herstellung von bioaktiven Gerüsten auf die sterile Reinbank geben.
      1. Schneiden Sie den Gelatineschwamm (60 mm x 20 mm x 5 mm) mit der sterilisierten Schere in 48 gleichmäßig große Stücke (5 mm x 5 mm x 5 mm) (Abbildung 1B) und geben Sie diese auf eine 48-Well-Platte.
      2. Mischen Sie die rhBMP-2-Stammlösung, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, um eine gleichmäßige Durchmischung zu gewährleisten, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen. Aspirieren Sie 30 μl der Lösung und geben Sie sie tropfenweise zum Gelatineschwamm.
      3. Versiegeln Sie die 48-Well-Platte mit einer Schicht Parafilm, um den anschließenden Gefriertrocknungsprozess zu erleichtern. Nehmen Sie die Platte mit dem Gelatineschwamm aus der sauberen Bank. Stellen Sie es bei -20 °C zum Einfrieren auf. Schalten Sie gleichzeitig den Gefriertrockner ein und kühlen Sie ihn auf einen Temperaturbereich von -50 °C bis -60 °C vor.
      4. Nach dem Einfrieren für 2 h die Well-Platte mit den Gelatineschwämmen für 12 h in den Gefriertrockner legen. Um die Trockenheit und Sterilität der Proben zu erhalten, tragen Sie eine zusätzliche Schicht Parafilm auf, um die Well-Platte nach der Gefriertrocknung zu versiegeln. Lagern Sie es im Kühlschrank bei -20 °C.

2. Chirurgische Implantation von bioaktiven Gerüsten

HINWEIS: Alle chirurgischen Instrumente sind für den Gebrauch sterilisiert.

1. Fasten Sie die Mäuse 1 h vor der Anästhesie. Tragen Sie eine befeuchtende Tiersalbe um die Augen von Mäusen auf, um postoperative Beschwerden durch Trockenheit in der Augenpartie zu reduzieren. Anästhesieren Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 1% (w/v) Lösung von Pentobarbital-Natrium (in einer Dosis von 48 mg/kg).
   HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet die ethisch anerkannte Methode der Anästhesie mit intraperitonealer Natrium-Pentobarbital-Injektion. Auch andere Methoden, wie die Isofluran-Inhalation oder die intraperitoneale Injektion von Ketamin-Xylazin, können nach der Zulassung eingesetzt werden.
2. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie bei Mäusen, indem Sie bei einer liegenden Maus nach den folgenden Anzeichen suchen: gleichmäßiger Herzschlag und Atmung, entspannte Muskeln, unbewegliche Gliedmaßen, Schnurrhaare, die nicht auf Berührung reagieren, und Fehlen eines Pedalreflexes. Kneifen Sie zusätzlich mit einer Zahnzange in die Haut der Mäuse oder stimulieren Sie die Zehen oder Pfoten von Mäusen. Zeigen die Mäuse empfindliche Reaktionen, ist die Anästhesie zu leicht; Verabreichen Sie eine zusätzliche Anästhesie. Nachdem die Anästhesieebene erreicht ist, bringen Sie die Mäuse in die Operationszone in der rechten seitlichen Liegeposition, um das bioaktive Gerüst leicht in das linke Bein zu implantieren.
3. Rasieren Sie die Haare am linken Bein mit einer Rasiermaschine. Desinfizieren Sie den rasierten Bereich mit abwechselnden Runden Chlorhexidin und Alkohol jeweils 3 Mal und machen Sie Schnitte am Hinterbein, das sich auf der lateralen Seite des Musculus vastus lateralis befindet. Verwenden Sie eine Augenschere, um Schnitte von etwa 3,0 mm Länge zu machen, die sich entlang der Richtung der Tibia erstrecken.
   HINWEIS: Um während der Operation sterile Bedingungen zu gewährleisten, sollten die verwendeten chirurgischen Gegenstände an den dafür vorgesehenen Orten gelagert werden. Steriles Material sollte in einem sauberen Bereich aufbewahrt werden, um den Kontakt mit anderen Personen als dem Bediener zu vermeiden. Wiederverwendbare chirurgische Instrumente sollten umgehend mit 75 % (v/v) Ethanol desinfiziert werden. Minimieren Sie die Dauer der Operation, um die Exposition der Wunden gegenüber der Luft zu verringern und das Infektionsrisiko zu verringern.
4. Um die Tasche für das Implantat zu schaffen, öffnen Sie die Faszie an der distalen Seite des Musculus vastus lateralis in Richtung Tibia.
5. Verwenden Sie eine Augenzange, um das bioaktive Gerüst zu einem Zylinder mit einer Höhe von ca. 5 mm und einem Durchmesser von 5 mm zu formen. Implantieren Sie das Gerüst in die Muskeltasche entlang des durch die Augenschere erzeugten Muskelschlitzes und verschließen Sie die Implantattasche mit einem unterbrochenen Nahtbild durch die Faszie. Verschließen Sie den Hautschnitt mit einer 4-0-Naht.
   HINWEIS: Das Auftreten von Krämpfen oder Wasserlassen bei Tieren während des chirurgischen Eingriffs deutet auf eine übermäßig tiefe Anästhesie hin, die eine sofortige Einleitung von Notfallmaßnahmen erforderlich macht.
6. Wiederholen Sie die Schritte 2.3-2.5 und implantieren Sie ein weiteres bioaktives Gerüst in den rechten Femurmuskelbeutel der Mäuse. Verwenden Sie Jodtupfer, um die Operations- und Injektionsstellen der Mäuse nach der Operation zu reinigen, um eine Infektion zu vermeiden.
   HINWEIS: In jeden Musculus vastus lateralis kann nur ein Implantat eingesetzt werden.
7. Platzieren Sie die Mäuse auf einer Plattform mit konstanter Temperatur bei 37 °C, bis sie nach dem Experiment aufwachen. Drehen Sie die Mäuse alle 10-15 Minuten um, um Blutansammlungen zu verhindern. Nach der Operation können Sie nicht nur die Wärme aufrechterhalten, sondern auch die postoperativen Mäuse überwachen, ohne das Tier unbeaufsichtigt zu lassen, bis es wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten. Achten Sie genau auf wichtige Indikatoren von Mäusen, wie Herzfrequenz und Atemfrequenz.
   HINWEIS: Das Zittern der Vordergliedmaßen bei Mäusen bedeutet den Beginn der Erholungsphase.
8. Setzen Sie die Mäuse wieder in einen sterilen Käfig, der mit Alkoholspray und UV-Bestrahlung desinfiziert wurde. Setzen Sie das operierte Tier nicht zu anderen Tieren, bis es sich vollständig erholt hat. Verabreichen Sie zusätzlich Meloxicam, um die postoperativen Schmerzen mindestens einen Tag lang zu behandeln, mit der Option, die Behandlung auf bis zu drei Tage zu verlängern, um eine intensivere Schmerzbehandlung zu erreichen. Kontrollieren Sie das Tier und die Wunde regelmäßig während der 72 Stunden nach der Operation, um mögliche Nebenwirkungen festzustellen. Wenn die Infektion später festgestellt wird, euthanasieren Sie die Tiere, indem Sie die Mäuse zuerst durch intraperitoneale Injektion einer 1%igen (w/v) Lösung von Pentobarbital-Natrium (in einer Dosis von 48 mg/kg) anästhesieren, gefolgt von einer Gebärmutterhalsdislokation nach der Anästhesie.

3. Charakterisierung von in vivo Osteo-Organoiden 12 Wochen nach der Implantation

HINWEIS: Die bioaktiven Gerüste entwickeln sich in vivo nach der Implantation zu Osteo-Organoiden.

1. Sammlung von in vivo Osteo-Organoiden
   1. Wenn die In-vivo-Osteoorganoide 12 Wochen lang implantiert wurden, anästhesieren Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 1% (w/v) Lösung von Pentobarbital-Natrium (in einer Dosis von 48 mg/kg), gefolgt von einer zervikalen Luxation nach der Anästhesie.
      HINWEIS: Um den Schaden für Tiere so gering wie möglich zu halten, sollten Mäuse vor der Euthanasie durch Zervixluxation betäubt werden.
   2. Sprühen Sie 75% (v/v) Alkohol auf die Haut an der Stelle der Sektion.
   3. Trennen Sie die hintere Gliedmaße vom Rumpf und entfernen Sie den Muskel vorsichtig mit einer Minischere von den Osteoorganoiden.
   4. Entfernen Sie die anhaftenden Weichteile mit Gaze.
   5. Fixieren Sie einige Osteoorganoide in einer 4%igen (v/v) Paraformaldehyd (PFA)-Lösung für 24 Stunden bei Raumtemperatur für die histologische Analyse. Verwenden Sie die restlichen Proben für die makroskopische Fotografie und die Durchflusszytometrie-Analyse von HPSCs.
2. Makroskopische Bilder
   1. Legen Sie die Osteo-Organoide auf eine blaue Hintergrundplatte und fotografieren Sie sie mit einer Digitalkamera.
3. Histologische Analyse
   1. Vorbereitung für die histologische Färbung
      1. Die Osteoorganoide aus der PFA-Lösung in Reinstwasser überführen und 1 h einweichen.
      2. Ersetzen Sie Reinstwasser durch 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Lösung zur Entkalkung für 1 Woche.
      3. Legen Sie entkalktes Gewebe in eine Einbettkassette und tauchen Sie die Kassette 1 h lang in Reinstwasser.
      4. Für die Gradientendehydratisierung tauchen Sie die Einbettkassette für eine Dauer von jeweils 1 h in Ethanol in unterschiedlichen Konzentrationen (v/v): 75 %, 80 %, 90 % und 95 %, gefolgt von einem Eintauchen in 100 % (v/v) Ethanol I und II für jeweils 1 h.
         HINWEIS: "100 % (v/v) Ethanol I und II" bedeutet, dass die Einbettkassette einmal in den mit 100 % (v/v) Ethanol gefüllten "Behälter I" und dann ein zweites Mal in den mit 100 % (v/v) Ethanol gefüllten "Behälter II" eingetaucht werden sollte.
      5. Nach der Dehydratisierung legen Sie das eingebettete Gewebe nacheinander für 1 h in ein Gemisch aus 100 % (v/v) Xylol und absolutem Ethanol (Xylol: Ethanol-Volumenverhältnis von 1:1) und 100 % (v/v) Xylol I und II für jeweils 30 min.
      6. Tauchen Sie die Gewebe in Paraffin I und II bei einer konstanten Temperatur von 60 °C für jeweils 2 h.
      7. Um das in Wachs getränkte Gewebe mit einer Einbettmaschine einzubetten, geben Sie das geschmolzene Wachs in die Einbettform. Bevor das Wachs erstarrt, nehmen Sie das Gewebe aus dem Dehydratisierungsbehälter und legen Sie es in die Einbettform; Beschriften Sie sie entsprechend. Kühlen Sie die Form bei -20 °C Gefriertemperatur ab und entfernen Sie nach dem Erstarren des Wachses den Wachsblock aus der Einbettform und schneiden Sie ihn ab.
      8. Schneiden Sie die eingebetteten Wachsblöcke mit einem Paraffinschneider in 4,5 μm dicke Abschnitte und kleben Sie die Schnitte dann auf Objektträger.
      9. Die Abschnitte bei 40 °C kurz backen und anschließend auffangen und in einer Probierbox aufbewahren.
   2. H&E-Färbung
      1. Die Stücke auf ein Gitter legen und im Trockenschrank bei 60 °C 30 min backen.
      2. Entparaffinieren Sie die Abschnitte in Xylol und Ethanol. Die Paraffinabschnitte werden nacheinander 10 min lang in Xylol I, 10 min lang Xylol II, 10 min lang Xylol III 10 min, 5 min absolutes Ethanol I, 5 min absolutes Ethanol II, 5 min lang 90 % (v/v) Ethanol, 5 min lang 80 % (v/v) Ethanol, 5 min lang 70 % (v/v) Ethanol und 5 min lang 5 % Ethanol eingelegt und für einen Gradientenentparaffinierungsprozess in reines Wasser überführt.
      3. Tauchen Sie die Schnitte 2 Minuten lang in die Hämatoxylin-Färbelösung, spülen Sie sie dann 10 Minuten lang unter fließendem Wasser ab.
      4. Tauchen Sie die Schnitte 2 Minuten lang in Eosin-Färbelösung.
      5. Platzieren Sie die Abschnitte nacheinander 2 Minuten lang in 75 % (v/v) Ethanol, 2 Minuten lang 85 % (v/v) Ethanol, 5 Minuten lang absolutes Ethanol, 5 Minuten lang absolutes Ethanol und 5 Minuten lang Xylol zur Dehydratisierung.
      6. Nehmen Sie die Abschnitte aus dem Xylol und versiegeln Sie sie mit neutralem Balsam.
      7. Betrachten Sie die Schnitte unter dem Mikroskop und nehmen Sie repräsentative Bilder mit einer 10-fachen Vergrößerung auf, nachdem der neutrale Balsam getrocknet ist.
4. Durchflusszytometrische Analyse für HPSCs
   1. Die in vivo Osteoorganoide aus Schritt 3.1 werden in einen Mörser gegeben und eine geeignete Menge Färbepuffer zugegeben. Schneiden Sie die Osteoorganoide mit einer Augenschere in Fragmente mit einem Durchmesser von 1-3 mm und zerkleinern Sie sie im Färbepuffer mit Mörser und Stößel. Drücken Sie die Fragmente der in vivo-Osteoorganoide mit einem Stößel vertikal, anstatt sie zu zerkleinern, um einen Rückgang der Zellüberlebensrate zu verhindern.
   2. Die Zellsuspension wird in ein Zentrifugenröhrchen gegeben und bei 300 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
   3. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzu, um die Zellen 3-5 Minuten lang zu lysieren.
   4. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml Färbepuffer und filtrieren Sie sie durch einen 300-Mesh-Nylonfilter in ein 5-ml-Durchflusszytometrieröhrchen.
   5. Bei 300 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Färben Sie die restlichen ca. 100 μl (Zellen) am Boden des Durchflusszytometrie-Röhrchens bei 4 °C für 30 Minuten mit Antikörpern, einschließlich eines Lebend-/Tot-Färbekits, Peridinin-Chlorophyll-Protein-Cyanin5.5 (PerCp-Cy5.5)-Anti-Lineage-Cocktail (1:10), Phycoerythrin-Cyanin5 (PE-Cy5)-Anti-C-Kit (1:200), Alexa Fluor 700(AF700)-Anti-Stammzellen-Antigen-1(Sca-1) (1:200), Brilliant Violet 711(BV711)-Anti-CD16/32 (1:200), Bio-Anti-CD34 (1:200), BV421-Anti-CD127 (1:200), PE-CF594-Anti-CD135 (1:200), BV510-Anti-CD48 (1:200) und PE-Cy7-Anti-CD150 (1:200).
   6. Die Zellen werden mit 1 ml Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ resuspendiert und bei 300 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
   7. Der Überstand wird aspiriert und mit dem PE-Streptavidin-Sekundärantikörper (1:200) für weitere 60 Minuten bei 4 °C gefärbt.
   8. Die Zellen werden mit 1 mL HBSS (ohne Ca²⁺, Mg²⁺) resuspendiert und bei 300 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
   9. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 300 μl HBSS (kein Ca²⁺, Mg²⁺).
   10. Vortex die Lösung, um weitere durchflusszytometrische Analysen durchzuführen. Analysieren Sie die erhaltenen Daten mit Hilfe von Durchflusszytometrie-Software, um quantitative Daten über HSPCs zu erhalten.
       HINWEIS: Die Datenerfassung und -analyse der Durchflusszytometrie bezieht sich auf unsere vorherigen Artikel und unterstützenden Materialien (Ergänzende Abbildung S1) für die typischen Gating-Strategien, die zur Identifizierung von HSPCs^{verwendet werden 10}.
   11. Erstellen Sie ein Punktdiagramm für seitliche Streufläche (SSC-A) vs. Vorwärtsstreufläche (FSC-A) und begrenzen Sie die umgebende Region der interessierenden Zellpopulation (P1) im Punktdiagramm SSC-A vs. FSC-A während der Datenerfassung auf einem Durchflusszytometer. Doppelklicken Sie auf das P1-Gate; Wählen Sie die Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H) für die X-Achse und die Vorwärtsstreubreite (FSC-W) für die Y-Achse , um die erste Zelladhäsionsbehandlung durchzuführen. Doppelklicken Sie auf das Einzelzellen-Gate; Wählen Sie die seitliche Streuhöhe (SSC-H) für die X-Achse und die seitliche Streubreite (SSC-W) für die Y-Achse , um die zweite Zelladhäsionsbehandlung durchzuführen. Verwenden Sie das rechteckige Anschnittwerkzeug, um die einzelnen Zellen auszuwählen.
   12. Tote Zellen ausschließen. Unterscheidung von lebenden Zellen von toten Zellen durch Nachweis von Viabilitätsmarkern. Erstellen Sie ein Punktdiagramm von SSC-A vs. Live/Dead und koppeln Sie die Region, die lebenden Zellen entspricht, und nennen Sie sie "lebende Zellen".
   13. Screenen Sie die mit spezifischen Antikörpern markierten Zellen in "lebenden Zellen". Die Zellpopulation, die von der positiven Expression von linienspezifischen Antikörpern in der myeloischen hämatopoetischen Stamm-/Vorläuferzelllinie betroffen sein könnte, ist durch Verwendung von Lineage-negativem (lin^-) Gating auszuschließen. Gate ^{die Linzellen} .
   14. Screening auf verschiedene Subpopulationen von Zellen innerhalb ^{der Linzellen}. Doppelklicken Sie auf das ^{Lin-Cells-Gate}; Wählen Sie Sca-1-AF700 für die X-Achse und c-kit-PE-Cy5 für die Y-Achse. Gate die c-kit⁺Sca-1-Zellen als ^LKS-Zellen, die c-kit⁺Sca-1⁺-Zellen als LKS⁺-Zellen und die Zellen mit geringer Expression von c-kit und Sca-1 als LK^loS^lo-Zellen. Doppelklicken Sie auf das ^LKS-Gatter und wählen Sie CD34-PE für die X-Achse und FCγR-BV711 für die Y-Achse. Doppelklicken Sie auf das LKS⁺-Gatter; Wählen Sie FIt3-PE-CF594 für die X-Achse und IL7Rα-BV421 für die Y-Achse und wählen Sie CD150-PE-Cy7 für die X-Achse und CD48-BV510 für die Y-Achse.
   15. Identifizieren Sie basierend auf der Spezifität der Antikörper positive oder negative Gates zur Unterscheidung von Zellsubpopulationen: hämatopoetische Stammzellen (^Lin-c-kit+Sca-1⁺CD48-CD150⁺) und differenzierte hämatopoetische Vorläuferzellen: multipotente Vorläuferzellen (^Lin-c-kit+Sca-1⁺CD48-CD150^-��), gemeinsame lymphatische Vorläuferzellen (^{Lin-c-kit-Sca-1-Flt3+}IL7Rα⁺), gemeinsame myeloische Vorläuferzellen (^Lin-c-kit+Sca-1-CD34⁺FCγR^-), Granulozyten-Monozyten-Vorläuferzellen (^Lin-c-kit+Sca-1-CD34⁺FCγR⁺) und erythroide Megakaryozyten-Vorläuferzellen (Lin-c-kit⁺Sca-1-CD34-FCγR⁻).

4. Modell der Mausbestrahlung

HINWEIS: C57BL/6-Mäuse wurden mit Röntgenstrahlen unter Verwendung eines Röntgenstrahlers bestrahlt.

1. Um eine subletale Beeinträchtigung des hämatopoetischen/Immunsystems zu erreichen, setzen Sie Wildtyp-Mäuse (WT) in der mit 5 Gray (Gy) phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) behandelten Gruppe, der mit 5 Gy nativem Knochenmark (BM) behandelten Gruppe und der mit 5 Gy Osteoorganoiden behandelten Gruppe 24 Stunden vor der Transplantation einer 5-Gy-Bestrahlung (1,25 Gy/min) aus.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass WT-Mäuse in der mit 0 Gy PBS behandelten Gruppe mit PBS behandelt und nicht bestrahlt werden.

5. Ablauf der Zelltherapie

HINWEIS: Alle Eingriffe sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

1. Gewinnung von in vivo aus Osteo-Organoiden und nativen Knochenmarkzellen
   1. Implantieren Sie zwei bioaktive Gerüste in den Muskelbeutel von C57BL/6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (CD45.1) Mäusen und inkubieren Sie sie 12 Wochen lang, um die in vivo Osteo-Organoide zu bilden. Ernte von zwei in vivo Osteo-Organoiden und zwei Femuren von einer der oben erwähnten CD45.1-Mäuse. Befreien Sie anschließend das Weichgewebe auf der Oberfläche der Osteoorganoide und Femure mit einer Pinzette und Gaze.
   2. Legen Sie die Osteoorganoide und Femure separat in einen Mörser und fügen Sie 1 ml HBSS (kein Ca²⁺, Mg²⁺) hinzu.
      HINWEIS: HBSS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ kann die Zellaggregation reduzieren. Die für die Transplantation verwendete Lösung darf keine Serumbestandteile enthalten, um mögliche Abstoßungsreaktionen zu vermeiden.
   3. Schneiden Sie die Proben mit einer chirurgischen Schere auseinander und zerkleinern Sie sie vorsichtig in einem Mörser und Stößel.
   4. Die Zellsuspension wird durch ein 40 μm Zellsieb filtriert und bei 300 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
   5. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets mit 300 μl HBSS (kein Ca²⁺, Mg²⁺). Gründlich mischen, um eine Suspension aus Osteo-Organoid-Zellen oder ganzen Knochenmarkzellen zu erhalten.
      HINWEIS: Um die aus dem in vivo Osteo-Organoid gewonnenen Zellcocktails voll auszuschöpfen, haben wir uns für die Therapie entschieden, ganze Knochenmarkzellen zu verwenden. Die typische Anzahl der Gesamtzellen in einem 30 μg BMP-2-induzierten in vivo Osteoorganoid beträgt 30.000.000 bis 40.000.000.
2. Injektion der orbitalen venösen Sinus
   HINWEIS: CD45.1⁺ -Ganzknochenmarkzellen, die aus in vivo Osteoorganoiden oder Femuren entnommen wurden, wurden durch den Orbitalvenensinus in den subletal bestrahlten C57BL/6 (CD45.2)-Empfänger injiziert. Die Injektion der orbitalen venösen Sinus und der Schwanzveneninjektion sind häufig eingesetzte Methoden im Tierversuch. Die Injektion der orbitalen venösen Sinus wurde aufgrund ihrer Einfachheit und der geringen Ausfallrate für Anfänger gewählt. Während des Prozesses der orbitalen Injektion müssen bestimmte Schutzmaßnahmen ergriffen werden, wie z. B. die Vorbetäubung der Mäuse, die Verwendung einer beheizten Platte, um das Risiko einer Unterkühlung zu verringern, und die mechanische Fixierung der Mäuse, um Bewegungen zu verhindern.
   1. Legen Sie die CD45.2-Mäuse in eine Präanästhesiekammer und leiten Sie die Anästhesie mit Isofluran ein. Tragen Sie eine gleitfähige Tiersalbe um die Augen von Mäusen auf, um Trockenheit zu verhindern und den durch Isofluran verursachten Augenreizungen entgegenzuwirken.
      HINWEIS: Um den Schaden für die Tiere zu minimieren, wird den Mäusen vor der Injektion der orbitalen venösen Sinus eine Isofluran-Anästhesie verabreicht.
   2. Übertragen Sie die Mäuse zur weiteren Anästhesie auf den Anästhesietisch.
   3. Um die Wahrscheinlichkeit einer Unterkühlung bei Mäusen zu verringern, legen Sie die bestrahlte, betäubte Maus auf ein thermostatisches Heizkissen, das auf 37 °C eingestellt ist.
   4. Legen Sie die Maus nach der vollständigen Betäubung mit dem Kopf nach rechts in die linke Seitenlage.
   5. Um das Auge hervorzustehen, lege einen Finger auf die Oberseite des Kopfes und entlang der Kieferlinie. Ziehen Sie die Haut sanft nach hinten und unten.
   6. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 25-g-Nadel, um 200 μl der in vivo Osteo-Organoid-abgeleiteten Zellsuspension oder der nativen Knochenmark-Zellsuspension von CD45.1⁺ -Mäusen, die in Schritt 5.1.5 erhalten wurden, zu aspirieren.
   7. Führen Sie die Nadel vorsichtig mit einer Abschrägung nach unten in einem Winkel von ca. 30° in den medialen Canthus ein.
      HINWEIS: Injektionen werden in der Regel mit der Nadelabschrägung nach oben verabreicht, aber bei retroorbitalen Injektionen ist es besser, die Nadelschräge nach unten zu positionieren, um das Risiko einer Augenschädigung zu verringern.
   8. Folgen Sie mit der Nadel dem Rand des Augapfels nach unten, bis sich die Nadelspitze an der Basis des Auges befindet.
   9. Injizieren Sie das Injektat langsam und sanft.
   10. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist, setzen Sie die Maus zur Wiederherstellung wieder in ihren Käfig ein.

6. Bewertung der Behandlungseffekte

1. Hämatologische Analyse
   HINWEIS: Um die Hämatologie von Empfängern in Rekonstitutionstests des Immunsystems zu analysieren, sammelten wir periphere Blutproben von Empfängern, die verschiedenen Behandlungen unterzogen wurden: 0 Gy PBS-Behandlung, 5 Gy PBS-Behandlung, 5 Gy native BM-Behandlung und 5 Gy osteoorganoide Behandlung. Die Blutproben wurden 2 Tage vor und 2, 4, 8, 12 und 16 Wochen nach der Transplantation durch retroorbitale Punktion entnommen. Ein Teil der Blutprobe derselben Gruppe wurde für die hämatologische Analyse verwendet, während der andere Teil für die Chimärismusanalyse verwendet wurde. Es gibt verschiedene Methoden der Blutentnahme, wie z.B. durch die Vena submandibuläris oder die Vene tail. Die retroorbitale Punktion ist eine der gängigen Methoden zur Blutentnahme bei Mäusen und unter ethischen Bedingungen erlaubt.
   1. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.1-5.2.5, um die Mäuse zu betäuben und die Augen der Mäuse hervortreten zu lassen.
      HINWEIS: Um den Schaden für die Tiere zu verringern, wird den Mäusen vor der retroorbitalen Punktionsblutentnahme eine Isofluran-Anästhesie verabreicht.
   2. Positionieren Sie das Kapillarrohr mit einem Durchmesser von 0,5 mm im medialen Canthus des Auges und richten Sie es in einem Winkel von 30°-45° zur Nasenebene nach kaudal.
   3. Drehen Sie das Kapillarrohr vorsichtig und üben Sie Druck aus, so dass es durch die Bindehautmembranen eindringen kann. Lassen Sie das Blut durch Kapillarwirkung in das Kapillarrohr fließen.
   4. Üben Sie kontinuierlichen Druck aus, nachdem das Blut zu fließen beginnt, um den Blutfluss aufrechtzuerhalten.
   5. Nachdem Sie 100 μl Blut entnommen haben, lassen Sie den Druck auf den Hals sofort los. Entfernen Sie gleichzeitig den Kapillarschlauch, damit das Auge in die normale Position zurückkehren kann, um postoperative Blutungen an der Einstichstelle zu vermeiden.
   6. Leiten Sie das Blut unverzüglich in ein Zentrifugenröhrchen aus, das mit 1,5 % (w/v) Ethylendiamin-Tetraessigsäure-Dikaliumsalz-Dihydrat (EDTA-K2)-Lösung gewaschen und dann mit 10 μl 1,5 % (w/v) EDTA-K2-Lösung versetzt wurde. Schütteln Sie das Zentrifugenröhrchen vorsichtig, um eine gründliche Vermischung der EDTA-K2-Lösung und des Blutes zu gewährleisten und eine Gerinnung zu verhindern.
   7. Nachdem Sie die Wunde mit steriler Watte abgewischt und leichten Druck ausgeübt haben, um die Blutung zu stoppen, beobachten Sie die Mäuse 1-2 Minuten nach der Blutstillung, um sicherzustellen, dass keine Anomalien vorhanden sind, und bringen Sie sie dann in ihre Käfige zurück.
   8. Führen Sie mit einem Hämatologie-Analysator eine hämatologische Analyse eines Teils der Blutproben jeder Gruppe durch, einschließlich der Anzahl der weißen Blutkörperchen (WBC), der roten Blutkörperchen (RBC) und der Blutplättchen (PLT).
      HINWEIS: Analysieren Sie alle Blutproben innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme.
2. Analyse des Chimärismus des peripheren Blutes
   HINWEIS: Ähnlich wie bei der hämatologischen Analyse wurden periphere Blutproben von 5 Gy nativen BM-behandelten und 5 Gy osteo-organoiden Gruppen durch retroorbitale Punktion 2, 4, 8, 12 und 16 Wochen nach der Transplantation entnommen.
   1. Verwenden Sie den anderen Teil der peripheren Blutprobe aus Schritt 6.1 zur Analyse des Chimärismus des peripheren Blutes.
   2. Geben Sie 1 ml Erythrozyten-Lysepuffer in die Probe und lysieren Sie sie 3-5 Minuten lang. Drehen Sie die Probe vorsichtig auf den Kopf, um eine bessere Lyse der roten Blutkörperchen zu ermöglichen.
   3. Bei 300 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
   4. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml HBSS (ohne Ca²⁺, Mg²⁺) hinzu, um das Pellet wieder zu suspendieren.
   5. Bei 300 × g 5 min bei 4 ΰC zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Die restlichen ca. 100 μl Zellen am Boden des Zentrifugenröhrchens werden 30 Minuten lang bei 4 °C mit Antikörpern gefärbt, einschließlich eines Lebend-/Totfärbekits, PE-anti-CD45.1 (1:200), Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-anti-CD45.2 (1:200), PE-Cy7-anti-B220 (1:200), AF700-anti-CD11b (1:200), PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (1:200), PE-Dazzle594-anti-CD4 (1:200) und Allophycocyanin (APC)-anti-CD3e (1:200).
   6. Die Zellen werden mit 1 mL HBSS (ohne Ca²⁺, Mg²⁺) resuspendiert und bei 300 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
   7. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 300 μl HBSS (kein Ca²⁺, Mg²⁺).
   8. Wirbeln Sie die Suspension vor, um eine weitere durchflusszytometrische Analyse durchzuführen.
   9. Analysieren Sie die erhaltenen Daten weiter mit Hilfe von Durchflusszytometrie-Software, um Informationen über die Chimärismusrate von HSPCs im peripheren Blut von Empfängermäusen sowohl in der 5-Gy-nativen BM-behandelten Gruppe als auch in der 5-Gy-Osteo-Organoid-behandelten Gruppe zu erhalten.
      HINWEIS: Für die Analyse durchflusszytometrischer Daten finden Sie in der ergänzenden Abbildung S2 die typischen Gating-Strategien, die zur Identifizierung von von Spendern stammenden CD45.1⁺ -Zellen im peripheren Blut von CD45.2-Empfängern verwendet werden.
   10. Wiederholen Sie die Schritte 3.4.11 bis 3.4.12, um den Bereich, der den lebenden Zellen entspricht, zu begrenzen.
   11. Analysieren Sie den Chimärismus des peripheren Blutes, indem Sie zunächst Zellpopulationen identifizieren und anschließend Spender- und Empfängerzellen unterscheiden.
       1. Screening spezifischer Antikörper-markierter Zellen in lebenden Zellen. Wählen Sie CD11b-AF700 für die X-Achse und B220-PE-Cy7 für die Y-Achse. Gate die B220⁺CD11b-Zellen als B-Zellen, die B220-CD11b⁺ Zellen als myeloische Zellen und die B220-CD11b-Zellen als doppel-negative (DN) Zellen.
       2. Doppelklicken Sie auf das Gatter der DN-Zellen, indem Sie CD3-APC für die X-Achse und SSC-A für die Y-Achse verwenden. Gate die CD3⁺ Zellen als T-Zellen.
       3. Doppelklicken Sie auf das CD3⁺-Zellgatter und wählen Sie CD4-PE-Dazzle594 für die X-Achse und CD8-PerCp-Cy5.5 für die Y-Achse. Gate die CD8^+CD4-Zellen als zytotoxische T-Zellen (CTL) und die ^CD8-CD4+ Zellen als regulatorische T-Zellen (Treg).
   12. Schließlich wird eine Chimärismusanalyse des peripheren Blutes an den Spender- und Empfängerzellen durchgeführt. Wählen Sie innerhalb der angegebenen Zellpopulationen mit einem Doppelklick CD45.1-PE für die X-Achse und CD45.2-FITC für die Y-Achse aus. Gate der CD45.1⁺ -Zellen und Durchführung einer Zellzählung, um den Anteil der CD45.1⁺ -Zellen innerhalb der Zellpopulation zu bestimmen und so die Chimärismusrate widerzuspiegeln.
3. Analyse des Chimärismus fester Organe
   HINWEIS: 16 Wochen nach der Transplantation wurden BM-, Milz- und Thymuschimären in der mit 5 Gy BM behandelten Gruppe und der mit 5 Gy Osteoorganoiden behandelten Gruppe analysiert.
   1. Wiederholen Sie die Schritte 5.1.1 bis 5.1.4, um die aus dem BM gewonnenen Zellpellets zu erhalten.
   2. Platzieren Sie einen 300-Mesh-Nylonfilter über einer Zellkulturschale (6 cm), die 1 ml HBSS (kein Ca²⁺, Mg²⁺) enthält.
   3. Legen Sie die präparierte Milz oder den Thymus auf den Nylonfilter.
   4. Mahlen Sie die genannten Organe mit dem vorderen Gummistopfen einer 5-ml-Spritze, bis keine offensichtliche Gewebestruktur mehr übrig bleibt, sondern nur noch Restgewebe aus faserigem Gewebe. Behandeln Sie die Zellen schonend, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten.
   5. Das Filtrat auffangen und bei 300 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
   6. Entfernen Sie den Überstand, um die Zellausfällungen zu erhalten, die aus der Milz oder dem Thymus stammen.
   7. Geben Sie 1 ml Puffer für die Lyse roter Blutkörperchen zu den in den Schritten 6.3.1 und 6.3.6 erhaltenen Zellpellets und lysieren Sie sie 3-5 Minuten lang.
   8. Die Schritte 6.2.3 bis 6.2.8 für die Färbe- und Durchflusszytometrie-Analyse wiederholen.
   9. Analysieren Sie die erhaltenen Daten weiter mit Hilfe von Durchflusszytometrie-Software, um Informationen über die Chimärismusrate von HSPCs in den soliden Organen (BM, Milz und Thymus) von Empfängermäusen sowohl in der mit 5 Gy nativen BM behandelten Gruppe als auch in der mit 5 Gy Osteo-Organoiden behandelten Gruppe zu erhalten.
      HINWEIS: Für die Analyse durchflusszytometrischer Daten wird auf die ergänzende Abbildung S2 verwiesen, in der die typischen Gating-Strategien aufgeführt sind, die zur Identifizierung von von Spendern stammenden CD45.1⁺ -Zellen in BM, Milz und Thymus von CD45.2-Empfängern verwendet werden.
   10. Ersetzen Sie peripheres Blut in den Schritten 6.2.10-6.2.12 durch BM, Milz und Thymus, um die Chimärismusrate fester Organe zu erhalten.

Ergebnisse

Gemäß dem Protokoll haben wir ein bioaktives Gerüst hergestellt, indem wir BMP-2 unter sterilen Bedingungen in einen abbaubaren Gelatineschwamm getropft haben. Das Gerüst wurde dann in die Muskeln der unteren Gliedmaßen von Mäusen implantiert, um in vivo Osteo-Organoide zu etablieren. Nach einer Inkubationszeit von 12 Wochen führten wir makroskopische Fotografien, histologische Analysen und durchflusszytometrische Analysen an den Osteoorganoiden durch (

Diskussion

In diesem Protokoll stellen wir einen Ansatz vor, um in vivo Osteo-Organoide mit knochenmarkähnlichen Strukturen zu etablieren, indem mit BMP-2 beladene Gelatine-Schwammgerüste implantiert werden. Wir zeigen, dass diese in vivo Osteo-Organoide über einen langen Zeitraum (mehr als 12 Wochen) stabil therapeutische HSPCs produzieren können. Im Vergleich zu bestehenden In-vitro-Expansions - oder Inkubationsmethoden , bei denen Zellen geladen werden, ka...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AF700-anti-CD11b (M1/70)	eBioscience	56-0112-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
AF700-anti-Sca-1 (D7)	BioLegend	108141	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
APC-anti-CD3e (145-2C11)	Tonbo	20-0031-U100	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
bio-anti-CD34 (RAM34)	eBioscience	13-0341-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV421-anti-CD127 (IL-7Rα)	BioLegend	135023	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV510-anti-CD48 (HM48-1)	BioLegend	103443	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV711-anti-CD16/32 (93)	BioLegend	101337	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Capillary tube	Shanghai Huake Labware Co.	DC616297403604-100mm/0.5mm
Cell strainer	CORNING	352340
Ethanol	GENERAL-REAGENT	01158566
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) solution	Servicebio	G1105
Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt dihydrate (EDTA-K2)	Solarbio	E8651
FITC-anti-CD45.2 (104)	BioLegend	109806	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Flowjo	Becton, Dickinson & Company		A flow cytometry.
Gelatin sponge	Jiangxi Xiangen Co.		Use under sterile conditions.
HBSS without Ca2+ and Mg2+	Gibco	14170112	HBSS without Ca2+ and Mg2+ can prevent cell aggregation.
Hematology analyzer	Sysmex	pocH-100i Diff
iodine swabs	Xiangtan Mulan Biological Technology Co., Ltd.	01011	To prevent the infection after operation.
Isoflurane	RWD	R510-22-10	To avoid adverse effects of anesthesia waste gases on the environment and laboratory personnel, a gas recovery system should be used in conjunction.
Kraft paper			absorbent paper
LIVE/DEAD Fixable Near IR Dead Cell Staining Kit(used in 3.4.5)	Thermo Fisher Scientific	L34962	A live/dead staining kit. Store at -20 °C. Dissolve in 50 μL of DMSO for working solution.
lubricating vet ointment	Pfizer		To prevent dryness and counteract the ocular irritations caused by isoflurane.
Neutral balsam	Solarbio	G8590
nylon filter	Shanghai Shangshai Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd.		Used for cell filtration.
Paraffin liquid	Macklin	P815706
Paraformaldehyde (PFA) solution	Servicebio	G1101	Immersion fixation is used for routine animal tissues. The volume of fixative used is generally 10-20 times the tissue volume, and fixation at room temperature for 24 hours is sufficient.
PE-anti-CD45.1 (A20)	BioLegend	110708	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-CF594-anti-CD135 (A2F10.1)	BD Biosciences	562537	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy5-anti-c-kit (2B8)	BD Biosciences	105809	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-B220 (RA3-6B2)	BioLegend	103222	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-CD150 (TC15-12F12.2)	BioLegend	115914	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Dazzle594-anti-CD4 (GK1.5)	BioLegend	100456	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Pentobarbital sodium salt	Sigma-Aldrich	57-33-0	Prepare for use at a concentration of 1% (w/v).
PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (53-6.7)	BioLegend	100734	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PerCp-Cy5.5-anti-lineage cocktail	BD Biosciences	561317	Store at 4 °C. Dilute 1:10  for staining.
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702	Store at 4 °C. Use in clean bench.
rhBMP-2	Shanghai Rebone Biomaterials Co.		The concentration of rhBMP-2 in the stock solution is 1.0 mg/mL.
Staining buffer	BioLegend	420201	Store at 4 °C.
Xylene	GENERAL-REAGENT	01018114
Zombie UV Fixable Viability Kit (used in 6.2.5)	BioLegend	423108	A live/dead staining kit. For reconstitution, bring the kit to room temperature; add 100 µL of DMSO to one vial of Zombie UV dye until fully dissolved.