Hidroponik Durumdaki Arabidopsis thaliana Köklerinde Bakteri Kolonizasyonunun Ölçülmesi

Özet

Rizosferde bitki büyümesini teşvik eden rizobakterilerin (PGPR) kolonizasyonu, büyümeyi teşvik edici etkisi için gereklidir. Bakteriyel rizosfer kolonizasyonunun tespit yöntemini standartlaştırmak gerekir. Burada, kök yüzeyindeki bakteri kolonizasyonunu ölçmek için tekrarlanabilir bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

Arabidopsis thaliana kökü üzerinde bakteri kolonizasyonunun ölçülmesi, bitki-mikrop etkileşimi çalışmalarında en sık yapılan deneylerden biridir. Tekrarlanabilirliği artırmak için rizosferdeki bakteri kolonizasyonunu ölçmek için standartlaştırılmış bir yöntem gereklidir. Önce steril A.thaliana'yı hidroponik koşullarda kültürledik ve daha sonra rizosferdeki bakteri hücrelerini 0.01'lik bir OD₆₀₀ nihai konsantrasyonunda aşıladık. Aşılamadan 2 gün sonra, kök dokusu toplandı ve kolonize olmayan bakteri hücrelerini çıkarmak için steril suda üç kez yıkandı. Kökler daha sonra tartıldı ve kök üzerinde kolonize olan bakteri hücreleri girdap ile toplandı. Hücre süspansiyonu, bir fosfat tamponlu salin (PBS) tamponu ile bir gradyan içinde seyreltildi, ardından bir Luria-Bertani (LB) agar ortamı üzerine kaplandı. Plakalar 37 ° C'de 10 saat inkübe edildi ve daha sonra, LB plakaları üzerindeki tek koloniler sayıldı ve kökler üzerinde kolonize olan bakteri hücrelerini belirtmek için normalize edildi. Bu yöntem, iyi tekrarlanabilirlik ile mono etkileşim koşullarında rizosferdeki bakteri kolonizasyonunu tespit etmek için kullanılır.

Giriş

Tek bir bakteri suşu ile rizosfer kolonizasyonunu tespit etmek için kantitatif ve kalitatif yöntemler vardır. Kalitatif yöntem için, floresansı yapısal olarak ifade eden bir suş kullanılmalı ve floresan dağılımı ve yoğunluğu floresan mikroskobu veya lazer konfokal aletler ^1,2 altında incelenmelidir. Bu stratejiler, in situ 3'te bakteri kolonizasyonunu iyi bir şekilde yansıtabilir, ancak miktar belirlemede geleneksel plaka sayma yöntemleri kadar doğru değildir. Ayrıca, mikroskop altında sadece kısmi kök bölgelerinin gösterilmesinin sınırlılığı nedeniyle, bazen subjektif önyargıdan etkilenebilir.

Burada, kolonize bakteri hücrelerinin toplanmasını ve bakteriyel CFU'ların bir plaka üzerinde sayılmasını içeren kantitatif bir yöntemi tarif ediyoruz. Bu yöntem, bitki köklerinden sıyrılan kolonize suşların sayılabildiği seyreltme ve kaplamaya dayanır ve kök üzerindeki toplam kolonize bakteri sayısı ^4,5 olarak hesaplanabilir.

İlk olarak, A. thaliana hidroponik koşullarda kültürlendi ve daha sonra bakteri hücreleri rizosferde 0.01 OD_600'lük bir nihai konsantrasyonda aşılandı. Enfekte kök dokuları aşılamadan 2 gün sonra toplandı ve kolonize olmayan bakteri hücrelerini uzaklaştırmak için steril suda yıkandı. Ayrıca, kök üzerinde kolonize olan bakteri hücreleri toplandı, fosfat tamponlu salin (PBS) tamponunda seyreltildi ve bir Luria-Bertani (LB) agar ortamı üzerine kaplandı. 37 ° C'de 10 saat inkübasyondan sonra, LB plakaları üzerindeki tek koloniler sayıldı ve köklerde kolonize olan bakteri hücrelerini belirlemek için normalize edildi.

Bu yöntem son derece uygulanabilirdir, iyi tekrarlanabilirliğe sahiptir ve doğru rizosfer bakteri kolonizasyonu tayini için daha uygundur.

Protokol

1. Steril hidroponik A. thaliana yetiştiriciliği

1. A. thaliana fidelerini hazırlayın.
   1. % 2 (ağırlıkça / hacim) sükroz ve% 0.9 (ağırlıkça / hacim) agar ile 1/2 MS ortamdan (Murashige ve Skoog) oluşan kültür A. thaliana fidanları ortamını hazırlayın.
   2. Hazırlanan sterilizasyon ortamını katılaşmadan önce steril kare Petri kaplarına (13 cm x 13 cm) dökün. Nemi korumak için havayla kurutmaktan kaçının.
   3. A. thaliana tohumlarını 1 mL steril su ile doldurulmuş 2 mL mikrosantrifüj tüpüne 4 ° C'de 12 saatten fazla daldırın ve ardından tohumları 1 mL% 2 (hacim / hacim) NaClO ile 2 dakika sterilize edin.
   4. NaClO çözeltisini çıkarmak için tohumları altı kez steril suyla iyice yıkayın. Tohumları, steril 1 mL uçlu MS agar ortamı ile Petri kaplarına ekin.
   5. Petri kaplarını nefes alabilen tıbbi bantla kapatın ve 1 hafta boyunca büyümeleri için hafif bir inkübatöre dikey olarak yerleştirin. Işık inkübatörünün gündüz/gece oranını 16 saat/8 saate ayarlayın, sıcaklığı 23 °C'de ve nemi %40-%60'ta tutun.
2. Nakil A. thaliana.
   1. 40 μm gözenek büyüklüğünde hücre boyayıcı üzerine 5 mm'lik delikler açın ve steril hale getirin.
   2. 7 günlük üç A. thaliana bitkisini bir hücre süzgecinin deliklerinden nakledin ve bunları% 0.5 sükroz içeren 3 mL steril sıvı 1/2 MS ortamı içeren 6 oyuklu bir plakaya koyun.
   3. 6 oyuklu plakaları hafif bir inkübatöre yerleştirin (Şekil 1A) ve 10 gün boyunca inkübe edin.

2. Bakteri yetiştirme ve aşılama

1. Aşılama için bakteri süspansiyonu hazırlayın.
   1. Bacillus velezensis için, bakteri hücrelerini steril LB ortamına aşılayın ve 37 ° C'de, 0.8-1.2 OD_600'e ulaşana kadar 170 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
   2. Bakteri hücrelerini 2 dakika boyunca 6000 x g'da santrifüjleme ile toplayın ve hücreleri PBS tamponunda (2 mM KH₂PO₄, 8 mM Na₂HPO₄, 136 mM NaCl, 2.6 mM KCl) yeniden süspanse edin. LB ortamını ve bakteriyel metabolitleri çıkarmak için santrifüjleme ve yeniden süspanse etme adımlarını 3 kez tekrarlayın.
   3. Bakteri hücrelerini, OD₆₀₀ 0.01'in nihai konsantrasyonunda taze 1/2 MS ortamında askıya alın. Bakteri süspansiyonlarını A. thaliana fidelerini yetiştiren 6 oyuklu plakalara aşılayın, 6 oyuklu plakaları ışık inkübatöre yerleştirin ve 2 gün boyunca yetiştirin.

3. Köklerde kolonize olan bakterilerin ölçülmesi

1. Kök dokusunu toplayın ve kolonize hücreleri plakalayın.
   NOT: Tüm adımlar gnotobiyotik koşullar altında yapılmalıdır
   1. 2 mL'lik tüpleri tartın ve ağırlığı W₀ olarak kaydedin.
   2. Birlikte kültürlenmiş A. thaliana kök dokularını hasat edin ve 3 kez steril suda yıkayın. Fazla suyu çıkarmak için kökü filtre kağıdına yerleştirin.
   3. Kökü tartılmış mikrosantrifüj tüpüne koyun, kökleri tüp ile birlikte tartın ve W₁ olarak kaydedin.
   4. Her tüpe 1 mL PBS ekleyin ve tüpleri maksimum hızda 8 dakika boyunca girdaplayın.
   5. Süspansiyonları toplanan kök kolonize bakteri hücreleri ile 1 x ^10-1-1 x ^10-4'e seyreltin (bakteri kolonizasyon kabiliyetine göre). Seyreltilmiş bakteri süspansiyonlarını LB agar ortamı içeren plakalara yayın ve 37 ° C'de 10 saat inkübe edin.
2. Kolonileri sayın ve verileri normalleştirin.
   1. LB plakalarındaki bakteri kolonilerini sayın.
   2. CFU'ları karşılık gelen seyreltmeye göre hesaplayın ve verileri kök taze ağırlığı (W_{1-W 0}) ile normalleştirin. Nihai sonuçlar, aşılamadan 2 gün sonra bir gram kök başına kolonize edilen bakteri hücrelerinin sayısını göstermektedir (Şekil 1B).

Sonuçlar

A. thaliana rizosferinde bu yöntemle tespit edilen bakteri kolonizasyon yeteneğinin doğruluğunu test etmek için, Bacillus velezensis SQR9 WT ve türetilmiş bir mutant Δ8mcp'yi A. thaliana rhizosphere'e ayrı ayrı aşıladık. Δ8mcp, tüm kemoreseptör kodlayan genlerden yoksun bir mutanttır ve önemli ölçüde azalmış bir kolonizasyona^{sahiptir 6}. Kolonizasyonlarını mevcut kök kolonizasyon testi ile aşılamadan 2 gün sonra ölçtük. So...

Tartışmalar

İyi bir tekrarlanabilirlik elde etmek için, bu protokolün kolonizasyon tespit süreci için dört kritik adım vardır. İlk olarak, aşılanan bakteri hücrelerinin sayısının her deneyde tam olarak aynı olduğundan emin olmak gerekir. İkincisi, kolonize olmayan bakteri temizleme yoğunluğunu steril su ile kontrol etmek de gereklidir. Üçüncüsü, mikrosantrifüj tüpüne batması kolay olan bakterilerin özelliklerinden dolayı absorpsiyon hatalarını önlemek için numunenin tam bir karıştırma durumunda ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E