Messung der bakteriellen Besiedlung von Arabidopsis thaliana-Wurzeln im hydroponischen Zustand

Zusammenfassung

Die Besiedlung mit pflanzenwachstumsfördernden Rhizobakterien (PGPR) in der Rhizosphäre ist essentiell für ihre wachstumsfördernde Wirkung. Es ist notwendig, die Methode zum Nachweis der bakteriellen Rhizosphärenbesiedlung zu standardisieren. Hier beschreiben wir eine reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der bakteriellen Besiedlung auf der Wurzeloberfläche.

Zusammenfassung

Die Messung der bakteriellen Besiedlung der Arabidopsis thaliana-Wurzel ist eines der häufigsten Experimente in Studien zur Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben. Um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, ist eine standardisierte Methode zur Messung der bakteriellen Besiedlung in der Rhizosphäre notwendig. Wir kultivierten zunächst steriles A.thaliana unter hydroponischen Bedingungen und inokulierten dann die Bakterienzellen in der Rhizosphäre mit einer Endkonzentration von OD₆₀₀ von 0,01. 2 Tage nach der Inokulation wurde das Wurzelgewebe entnommen und dreimal in sterilem Wasser gewaschen, um die unbesiedelten Bakterienzellen zu entfernen. Anschließend wurden die Wurzeln gewogen und die an der Wurzel besiedelten Bakterienzellen durch einen Wirbel gesammelt. Die Zellsuspension wurde in einem Gradienten mit einem phosphatgepufferten Kochsalzpuffer (PBS) verdünnt und anschließend auf ein Luria-Bertani (LB)-Agarmedium aufgebracht. Die Platten wurden 10 h lang bei 37 °C inkubiert, und dann wurden die einzelnen Kolonien auf LB-Platten gezählt und normalisiert, um die Bakterienzellen anzuzeigen, die auf den Wurzeln besiedelt waren. Diese Methode wird verwendet, um bakterielle Besiedlung in der Rhizosphäre unter Monointeraktionsbedingungen mit guter Reproduzierbarkeit nachzuweisen.

Einleitung

Es gibt quantitative und qualitative Methoden, um die Rhizosphärenbesiedlung durch einen einzelnen Bakterienstamm nachzuweisen. Für die qualitative Methode sollte ein Stamm verwendet werden, der konstitutiv Fluoreszenz exprimiert, und die Fluoreszenzverteilung und -intensität sollte unter Fluoreszenzmikroskopie oder konfokalen Laserinstrumenten untersucht werden ^1,2. Diese Strategien können die bakterielle Besiedlung in situ³ gut widerspiegeln, aber sie sind bei der Quantifizierung nicht so genau wie herkömmliche Plattenzählmethoden. Aufgrund der Einschränkung, nur partielle Wurzelzonen unter dem Mikroskop anzuzeigen, kann dies manchmal durch subjektive Verzerrungen beeinflusst werden.

Hier beschreiben wir eine quantitative Methode, die das Sammeln der besiedelten Bakterienzellen und das Zählen der bakteriellen KBE auf einer Platte beinhaltet. Dieses Verfahren basiert auf einer Verdünnung und Plattierung, bei der die besiedelten Stämme, die von den Pflanzenwurzeln abgestreift wurden, gezählt und die Gesamtzahl der besiedelten Bakterien auf der Wurzel berechnet werden^{kann 4,5}.

Zuerst wurde A. thaliana unter hydroponischen Bedingungen kultiviert, und dann wurden Bakterienzellen in der Rhizosphäre mit einer Endkonzentration von 0,01 OD₆₀₀ inokuliert. Das infizierte Wurzelgewebe wurde 2 Tage nach der Inokulation entnommen und in sterilem Wasser gewaschen, um die unbesiedelten Bakterienzellen zu entfernen. Des Weiteren wurden Bakterienzellen, die an der Wurzel besiedelt waren, gesammelt, in phosphatgepuffertem Kochsalzpuffer (PBS) verdünnt und auf ein Luria-Bertani (LB) Agarmedium aufgebracht. Nach einer Inkubation bei 37 °C für 10 h wurden einzelne Kolonien auf LB-Platten gezählt und normalisiert, um die auf den Wurzeln besiedelten Bakterienzellen zu bestimmen.

Diese Methode ist sehr gut anwendbar, hat eine gute Wiederholbarkeit und eignet sich besser für die genaue Bestimmung der bakteriellen Besiedlung der Rhizosphäre.

Protokoll

1. Steriler hydroponischer Anbau von A. thaliana

1. Bereiten Sie A . thaliana-Sämlinge vor.
   1. Bereiten Sie Kulturmedium für A. thaliana vor, das aus 1/2 MS-Medium (Murashige und Skoog) mit 2 % (wt/vol) Saccharose und 0,9 % (wt/vol) Agar besteht.
   2. Gießen Sie das vorbereitete Sterilisationsmedium vor dem Erstarren in sterile quadratische Petrischalen (13 cm x 13 cm). Vermeiden Sie das Austrocknen an der Luft, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
   3. Tauchen Sie die Samen von A. thaliana für mehr als 12 Stunden in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit 1 mL sterilem Wasser bei 4 °C gefüllt ist, und sterilisieren Sie die Samen dann 2 Minuten lang mit 1 mL 2 % (vol/vol) NaClO.
   4. Waschen Sie die Samen sechsmal gründlich mit sterilem Wasser, um die NaClO-Lösung zu entfernen. Säen Sie die Samen auf Petrischalen mit MS-Agar-Medium mit einer sterilen 1-ml-Spitze.
   5. Verschließen Sie die Petrischalen mit atmungsaktivem medizinischem Klebeband und legen Sie sie vertikal in einen leichten Inkubator, um sie 1 Woche lang zu züchten. Stellen Sie das Tag-/Nachtverhältnis des Lichtinkubators auf 16 h/8 h ein, halten Sie die Temperatur auf 23 °C und die Luftfeuchtigkeit auf 40%-60%.
2. Transplantation von A. thaliana.
   1. Schneiden Sie 5 mm Löcher in einen 40 μm porengroßen Zellfärber und sterilisieren Sie sie.
   2. Transplantieren Sie drei 7 Tage alte A. thaliana-Pflanzen durch die Löcher eines Zellsiebs und geben Sie sie in eine 6-Well-Platte mit 3 ml sterilem flüssigem 1/2 MS-Medium mit 0,5 % Saccharose.
   3. Legen Sie die 6-Well-Platten in einen Lichtinkubator (Abbildung 1A) und inkubieren Sie sie 10 Tage lang.

2. Bakterienkultivierung und Inokulation

1. Bereiten Sie die Bakteriensuspension für die Inokulation vor.
   1. Bei Bacillus velezensis werden die Bakterienzellen in steriles LB-Medium inokuliert und bei 37 °C unter Schütteln bei 170 U/min inkubiert, bis es einen OD₆₀₀ von 0,8-1,2 erreicht.
   2. Sammeln Sie die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 6000 x g für 2 min und resuspendieren Sie die Zellen in PBS-Puffer (2 mM KH₂PO₄, 8 mM Na₂HPO₄, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Wiederholen Sie die Zentrifugations- und Resuspendierungsschritte 3 Mal, um das LB-Medium und die bakteriellen Metaboliten zu entfernen.
   3. Die Bakterienzellen werden in einem frischen 1/2 MS-Medium bei einer Endkonzentration von OD₆₀₀ 0,01 suspendiert. Impfen Sie die Bakteriensuspensionen auf die 6-Well-Platten, auf denen A . thaliana-Sämlinge wachsen, legen Sie die 6-Well-Platten in den Lichtinkubator und kultivieren Sie sie 2 Tage lang.

3. Messung von Bakterien, die sich auf Wurzeln ansiedeln

1. Ernten Sie das Wurzelgewebe und plattieren Sie die besiedelten Zellen.
   HINWEIS: Alle Schritte sollten unter gnotobiotischen Bedingungen durchgeführt werden
   1. Wiegen Sie die 2 mL Röhrchen und notieren Sie das Gewicht mit W₀.
   2. Ernten Sie die co-kultivierten A. thaliana-Wurzelgewebe und waschen Sie sie 3 Mal in sterilem Wasser. Legen Sie die Wurzel auf Filterpapier, um das überschüssige Wasser zu entfernen.
   3. Geben Sie die Wurzel in das gewogene Mikrozentrifugenröhrchen, wiegen Sie die Wurzeln zusammen mit dem Röhrchen und notieren Sie es als W₁.
   4. Geben Sie 1 mL PBS in jedes Röhrchen und wirbeln Sie die Röhrchen 8 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit durch.
   5. Verdünnen Sie die Suspensionen mit den gesammelten wurzelbesiedelten Bakterienzellen auf 1 x ^10-1-1 x ^10-4 (je nach Besiedlungsfähigkeit der Bakterien). Die verdünnten Bakteriensuspensionen auf Platten mit LB-Agarmedium verteilen und 10 h bei 37 °C inkubieren.
2. Zählen Sie die Kolonien und normalisieren Sie die Daten.
   1. Zählen Sie die Bakterienkolonien auf LB-Platten.
   2. Berechnen Sie die KBE entsprechend der entsprechenden Verdünnung und normalisieren Sie die Daten mit dem Wurzelfrischgewicht (W_{1-W 0}). Die Endergebnisse zeigen die Anzahl der besiedelten Bakterienzellen pro Gramm Wurzel 2 Tage nach der Inokulation (Abbildung 1B).

Ergebnisse

Um die Genauigkeit der mit dieser Methode nachgewiesenen Besiedlungsfähigkeit der Bakterien in der Rhizosphäre von A. thaliana zu testen, inokulierten wir Bacillus velezensis SQR9 WT und eine abgeleitete Mutante Δ8mcp separat in die Rhizosphäre von A. thaliana . Das Δ8mcp ist eine Mutante, der alle Chemorezeptor-kodierenden Gene fehlen und die eine signifikant verringerte Besiedlung aufweist⁶. Wir haben ihre Besiedlung 2 Tage nach der Inokulation m...

Diskussion

Um eine gute Reproduzierbarkeit zu erreichen, gibt es vier kritische Schritte für den Besiedlungsnachweis dieses Protokolls. Zunächst muss sichergestellt werden, dass die Anzahl der geimpften Bakterienzellen in jedem Experiment genau gleich ist. Zweitens ist es auch notwendig, die Reinigungsintensität der unbesiedelten Bakterien mit sterilem Wasser zu kontrollieren. Drittens muss jeder Probenverdünnungsprozess vor der Durchführung vortexiert werden, damit sich die Probe in einem vollständigen Mischzustand befindet,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E