Измерение бактериальной колонизации корнями Arabidopsis thaliana в гидропонном состоянии

Резюме

Колонизация ризобактерий, способствующих росту растений (PGPR) в ризосфере, имеет важное значение для ее стимулирующего рост эффекта. Необходимо стандартизировать метод выявления бактериальной ризосферной колонизации. Здесь мы описываем воспроизводимый метод количественной оценки бактериальной колонизации на поверхности корня.

Аннотация

Измерение бактериальной колонизации корня Arabidopsis thaliana является одним из наиболее частых экспериментов в исследованиях взаимодействия растений и микробов. Стандартизированный метод измерения бактериальной колонизации в ризосфере необходим для улучшения воспроизводимости. Сначала мы культивировали стерильную A.thaliana в гидропонных условиях, а затем инокулировали бактериальные клетки в ризосфере при конечной концентрации OD₆₀₀ 0,01. Через 2 дня после инокуляции ткань корня собирали и трижды промывали в стерильной воде для удаления неколонизированных бактериальных клеток. Затем корни взвешивали, и бактериальные клетки, колонизированные на корню, собирали вихрем. Клеточную суспензию разбавляли градиентом с фосфатно-солевым буфером (PBS) с последующим нанесением на агаровую среду Лурии-Бертани (LB). Планшеты инкубировали при 37 °C в течение 10 часов, а затем подсчитывали и нормализовали единичные колонии на LB-планшетах, чтобы указать на бактериальные клетки, колонизированные на корнях. Этот метод используется для обнаружения бактериальной колонизации в ризосфере в условиях моновзаимодействия, с хорошей воспроизводимостью.

Введение

Существуют количественные и качественные методы выявления колонизации ризосферы одним штаммом бактерий. Для качественного метода следует использовать штамм, который конститутивно экспрессирует флуоресценцию, а распределение и интенсивность флуоресценции следует исследовать с помощью флуоресцентной микроскопии или лазерных конфокальных инструментов ^1,2. Эти стратегии могут хорошо отражать бактериальную колонизацию in situ³, но они не так точны, как традиционные методы подсчета планшетов при количественной оценке. Кроме того, из-за ограничения отображения под микроскопом только частичных корневых зон, иногда на него может влиять субъективная систематическая ошибка.

Здесь мы опишем количественный метод, который включает в себя сбор колонизированных бактериальных клеток и подсчет бактериальных КОЕ на планшете. Этот метод основан на разбавлении и покрытии, с помощью которых можно подсчитать колонизированные штаммы, которые были удалены из корней растений, и можно вычислить общее количество колонизированных бактерий на корне ^4,5.

Сначала A. thaliana культивировали в гидропонных условиях, а затем бактериальные клетки инокулировали в ризосферу в конечной концентрации 0,01 OD₆₀₀. Инфицированные корневые ткани собирали через 2 дня после инокуляции и промывали в стерильной воде для удаления неколонизированных бактериальных клеток. Далее бактериальные клетки, колонизированные на корню, собирали, разбавляли в буфере с фосфатно-солевым буфером (PBS) и помещали на агаровую среду Лурии-Бертани (LB). После инкубации при 37 °С в течение 10 ч подсчитывали и нормализовали единичные колонии на ЛБ-планшетах для определения бактериальных клеток, колонизированных на корнях.

Этот метод очень применим, имеет хорошую повторяемость и больше подходит для точного определения ризосферной колонизации бактерий.

протокол

1. Стерильное гидропонное выращивание A. thaliana

1. Подготовьте рассаду A. thaliana .
   1. Приготовьте проросток культуры A. thaliana в среде, которая состоит из 1/2 среды МС (Мурасиге и Скуг) с 2% (масс./об.) сахарозы и 0,9% (масс./об.) агара.
   2. Подготовленную стерилизационную среду вылить в стерильные квадратные чашки Петри (13 см х 13 см) до застывания. Избегайте сушки воздуха для поддержания влажности.
   3. Погрузите семена A. thaliana в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, заполненную 1 мл стерильной воды при температуре 4 °C, на более чем 12 ч, а затем стерилизуйте семена 1 мл 2% (об/об.) NaClO в течение 2 мин.
   4. Тщательно промойте семена стерильной водой шесть раз, чтобы удалить раствор NaClO. Высевают семена на чашки Петри средой МС агар со стерильным кончиком 1 мл.
   5. Заклейте чашки Петри дышащим медицинским скотчем и поместите их вертикально в легкий инкубатор для выращивания в течение 1 недели. Установите соотношение светового дня и ночи в инкубаторе на 16 ч/8 ч, поддерживайте температуру 23 °C и влажность 40%-60%.
2. Пересадка A. thaliana.
   1. Вырежьте отверстия 5 мм на 40 μм для окрашивания клеток размером поры и стерилизуйте их.
   2. Пересадите три 7-дневных растения A. thaliana через отверстия клеточного ситечка и поместите их в 6-луночный планшет, содержащий 3 мл стерильной жидкой среды 1/2 MS с 0,5% сахарозой.
   3. Поместите 6-луночные планшеты в легкий инкубатор (рисунок 1A) и инкубируйте в течение 10 дней.

2. Культивирование и инокуляция бактерий

1. Приготовьте бактериальную суспензию для посева.
   1. Для Bacillus velezensis инокулируют бактериальные клетки в стерильную среду LB и инкубируют при 37 °C с встряхиванием при 170 об/мин до достижения наружного диаметра₆₀₀ 0,8-1,2.
   2. Соберите бактериальные клетки центрифугированием при 6000 x g в течение 2 мин и ресуспендируйте клетки в PBS-буфере (2 мМ KH₂PO₄, 8 мМ Na₂HPO₄, 136 мМ NaCl, 2,6 мМ KCl). Повторите этапы центрифугирования и ресуспендирования 3 раза, чтобы удалить среду LB и бактериальные метаболиты.
   3. Суспендировать клетки бактерий в свежей среде с 1/2 МС при конечной концентрации наружного диаметра₆₀₀ 0,01. Инокулируйте бактериальные суспензии в 6-луночные планшеты, на которых растут саженцы A. thaliana , поместите 6-луночные планшеты в легкий инкубатор и культивируйте их в течение 2 дней.

3. Измерение бактерий, колонизированных на корнях

1. Соберите корневую ткань и наложите колонизированные клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны проводиться в условиях гнотобиотиков
   1. Взвесьте 2 мл пробирок и запишите вес как W₀.
   2. Соберите ткани корня A. thaliana и промойте их в стерильной воде 3 раза. Поместите корень на фильтровальную бумагу, чтобы удалить лишнюю воду.
   3. Поместите корень в взвешенную микроцентрифужную пробирку, взвесьте корни вместе с пробиркой и запишите как W₁.
   4. Добавьте 1 мл PBS в каждую пробирку и закрутите пробирки в течение 8 мин на максимальной скорости.
   5. Разбавляют суспензии собранными колонизированными корнями бактериальными клетками до 1 х ^10-1-1 х ^10-4 (в зависимости от способности бактерий к колонизации). Разбавленные бактериальные суспензии распределить по планшетам, содержащим среду LB-агара, и инкубировать при 37 °С в течение 10 ч.
2. Подсчитайте колонии и нормализуйте данные.
   1. Подсчитайте колонии бактерий на LB-планшетах.
   2. Рассчитайте КОЕ в соответствии с соответствующим разбавлением и нормализуйте данные по сырой массе корня (W_{1-W 0}). Окончательные результаты показывают количество колонизированных бактериальных клеток на грамм корня через 2 дня после инокуляции (рис. 1B).

Результаты

Чтобы проверить точность способности бактерий к колонизации, обнаруженной этим методом в ризосфере A. thaliana, мы инокулировали Bacillus velezensis SQR9 WT и полученный мутантный Δ8mcp в ризосферу A. thaliana отдельно. Δ8mcp является мутантом, в котором отсутствуют все гены, кодирующие ...

Обсуждение

Для достижения хорошей воспроизводимости существует четыре критических шага для процесса обнаружения колонизации этого протокола. Во-первых, необходимо убедиться, что количество инокулированных клеток бактерий в каждом эксперименте одинаково. Во-вторых, также необходим контроль ин?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E