Medindo a colonização bacteriana em raízes de Arabidopsis thaliana em condição hidropônica

Resumo

A colonização de rizobactérias promotoras de crescimento vegetal (PGPR) na rizosfera é essencial para seu efeito promotor de crescimento. É necessário padronizar o método de detecção da colonização da rizosfera bacteriana. Aqui, descrevemos um método reprodutível para quantificar a colonização bacteriana na superfície da raiz.

Resumo

A medição da colonização bacteriana na raiz de Arabidopsis thaliana é um dos experimentos mais frequentes em estudos de interação planta-micróbio. Um método padronizado para medir a colonização bacteriana na rizosfera é necessário para melhorar a reprodutibilidade. Primeiro cultivamos A.thaliana estéril em condições hidropônicas e, em seguida, inoculamos as células bacterianas na rizosfera a uma concentração final de OD₆₀₀ de 0,01. Aos 2 dias após a inoculação, o tecido radicular foi colhido e lavado três vezes em água estéril para remover as células bacterianas não colonizadas. As raízes foram então pesadas e as células bacterianas colonizadas na raiz foram coletadas por vórtice. A suspensão celular foi diluída em um gradiente com tampão tampão salino tampão fosfato (PBS), seguido de plaqueamento em meio de ágar Luria-Bertani (LB). As placas foram incubadas a 37 °C por 10 h e, em seguida, as colônias únicas nas placas LB foram contadas e normalizadas para indicar as células bacterianas colonizadas nas raízes. Este método é usado para detectar colonização bacteriana na rizosfera em condições de monointeração, com boa reprodutibilidade.

Introdução

Existem métodos quantitativos e qualitativos para detectar a colonização da rizosfera por uma única cepa bacteriana. Para o método qualitativo, deve-se utilizar uma cepa que expresse constitutivamente a fluorescência, e a distribuição e intensidade da fluorescência devem ser examinadas em microscopia de fluorescência ou instrumentos confocais a laser ^1,2. Essas estratégias podem refletir bem a colonização bacteriana in situ³, mas não são tão precisas quanto os métodos tradicionais de contagem de placas na quantificação. Além disso, devido à limitação de exibir apenas zonas radiculares parciais ao microscópio, às vezes pode ser influenciado por viés subjetivo.

Aqui, descrevemos um método quantitativo, que inclui a coleta das células bacterianas colonizadas e a contagem das UFCs bacterianas em uma placa. Este método é baseado na diluição e plaqueamento pelo qual as cepas colonizadas que foram retiradas das raízes das plantas podem ser contadas, e o número total de bactérias colonizadas na raiz pode ser calculado ^4,5.

Primeiro, A. thaliana foi cultivada em condições hidropônicas e, em seguida, as células bacterianas foram inoculadas na rizosfera a uma concentração final de 0,01 OD₆₀₀. Os tecidos radiculares infectados foram colhidos 2 dias após a inoculação e lavados em água estéril para remover as células bacterianas não colonizadas. Além disso, as células bacterianas colonizadas na raiz foram coletadas, diluídas em tampão salino tampão tampolado com fosfato (PBS) e semeadas em meio de ágar Luria-Bertani (LB). Após incubação a 37 °C por 10 h, colônias únicas em placas LB foram contadas e normalizadas para determinar as células bacterianas colonizadas nas raízes.

Este método é altamente aplicável, tem boa repetibilidade e é mais adequado para a determinação precisa da colonização bacteriana da rizosfera.

Protocolo

1. Cultivo hidropônico estéril de A. thaliana

1. Prepare mudas de A. thaliana .
   1. Prepare o meio de mudas de cultura A. thaliana , que consiste em meio 1/2 MS (Murashige e Skoog) com 2% (peso / vol) de sacarose e 0,9% (peso / vol) de ágar.
   2. Despeje o meio de esterilização preparado em placas de Petri quadradas estéreis (13 cm x 13 cm) antes da solidificação. Evite secar ao ar para manter a umidade.
   3. Mergulhe as sementes de A. thaliana em um tubo de microcentrífuga de 2 mL cheio de 1 mL de água estéril a 4 ° C por mais de 12 h e, em seguida, esterilize as sementes com 1 mL de NaClO a 2% (vol / vol) por 2 min.
   4. Lave bem as sementes com água estéril seis vezes para remover a solução de NaClO. Semeie as sementes em placas de Petri com meio de ágar MS com uma ponta estéril de 1 mL.
   5. Sele as placas de Petri com fita médica respirável e coloque-as verticalmente em uma incubadora leve para crescer por 1 semana. Defina a relação dia/noite da incubadora de luz para 16 h/8 h, mantenha a temperatura em 23 °C e a umidade em 40%-60%.
2. Transplante A. thaliana.
   1. Corte orifícios de 5 mm no corante de células de tamanho de poro de 40 μm e esterilize-os.
   2. Transplante três plantas de A. thaliana de 7 dias através dos orifícios de um filtro de células e coloque-as em uma placa de 6 poços contendo 3 mL de meio líquido estéril 1/2 MS com 0,5% de sacarose.
   3. Coloque as placas de 6 poços em uma incubadora leve (Figura 1A) e incube por 10 dias.

2. Cultivo e inoculação de bactérias

1. Prepare a suspensão bacteriana para inoculação.
   1. Para Bacillus velezensis, inocular células bacterianas em meio LB estéril e incubar a 37 °C com agitação a 170 rpm até atingir OD₆₀₀ de 0,8-1,2.
   2. Colete as células bacterianas por centrifugação a 6000 x g por 2 min e ressuspenda as células em tampão PBS (2 mM KH₂PO₄, 8 mM Na₂HPO₄, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Repita as etapas de centrifugação e ressuspensão 3 vezes para remover o meio LB e os metabólitos bacterianos.
   3. Suspender as células bacterianas num meio fresco de 1/2 MS a uma concentração final de OD₆₀₀ 0,01. Inocule as suspensões de bactérias nas placas de 6 poços que cultivam mudas de A. thaliana , coloque as placas de 6 poços na incubadora leve e cultive-as por 2 dias.

3. Medição de bactérias colonizadas nas raízes

1. Colha o tecido radicular e coloque as células colonizadas em placas.
   NOTA: Todas as etapas devem ser conduzidas em condições gnotobióticas
   1. Pese os tubos de 2 mL e registre o peso como W₀.
   2. Colha os tecidos radiculares de A. thaliana co-cultivados e lave-os em água estéril 3 vezes. Coloque a raiz em papel de filtro para remover o excesso de água.
   3. Coloque a raiz no tubo de microcentrífuga pesado, pese as raízes junto com o tubo e registre-o como W₁.
   4. Adicione 1 mL de PBS a cada tubo e vortex os tubos por 8 min na velocidade máxima.
   5. Dilua as suspensões com as células bacterianas colonizadas por raízes coletadas para 1 x ^10-1-1 x ^10-4 (de acordo com a capacidade de colonização da bactéria). Espalhar as suspensões bacterianas diluídas em placas contendo meio de ágar-LB e incubar a 37 °C durante 10 h.
2. Conte as colônias e normalize os dados.
   1. Conte as colônias bacterianas em placas LB.
   2. Calcular as UFC de acordo com a diluição correspondente e normalizar os dados com a massa fresca das raízes (W_{1-W 0}). Os resultados finais indicam a contagem de células bacterianas colonizadas por grama de raiz aos 2 dias pós-inoculação (Figura 1B).

Resultados

Para testar a precisão da capacidade de colonização de bactérias detectada por este método na rizosfera de A. thaliana, inoculamos Bacillus velezensis SQR9 WT e um mutante derivado Δ8mcp na rizosfera de A. thaliana separadamente. O Δ8mcp é um mutante que não possui todos os genes codificadores de quimiorreceptores e tem uma colonização significativamente diminuída⁶. Medimos sua colonização 2 dias após a inoculação pelo presente ensaio d...

Discussão

Para obter uma boa reprodutibilidade, existem quatro etapas críticas para o processo de detecção de colonização deste protocolo. Primeiro, é necessário garantir que o número de células bacterianas inoculadas seja exatamente o mesmo em cada experimento. Em segundo lugar, também é necessário controlar a intensidade da limpeza de bactérias não colonizadas com água estéril. Terceiro, cada processo de diluição da amostra precisa ser submetido a vórtice antes de ser realizado para permitir que a amostra este...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E