Misurazione della colonizzazione batterica sulle radici di Arabidopsis thaliana in condizioni idroponiche

Riepilogo

La colonizzazione dei rizobatteri che promuovono la crescita delle piante (PGPR) nella rizosfera è essenziale per il suo effetto di promozione della crescita. È necessario standardizzare il metodo di rilevamento della colonizzazione batterica della rizosfera. Qui descriviamo un metodo riproducibile per quantificare la colonizzazione batterica sulla superficie della radice.

Abstract

La misurazione della colonizzazione batterica sulla radice di Arabidopsis thaliana è uno degli esperimenti più frequenti negli studi di interazione pianta-microbi. Un metodo standardizzato per misurare la colonizzazione batterica nella rizosfera è necessario per migliorare la riproducibilità. Abbiamo prima coltivato A.thaliana sterile in condizioni idroponiche e poi abbiamo inoculato le cellule batteriche nella rizosfera a una concentrazione finale di OD₆₀₀ di 0,01. A 2 giorni dall'inoculazione, il tessuto radicale è stato raccolto e lavato tre volte in acqua sterile per rimuovere le cellule batteriche non colonizzate. Le radici sono state quindi pesate e le cellule batteriche colonizzate sulla radice sono state raccolte a vortice. La sospensione cellulare è stata diluita in un gradiente con un tampone salino tamponato con fosfato (PBS), seguito da una placcatura su un terreno di agar Luria-Bertani (LB). Le piastre sono state incubate a 37 °C per 10 ore, quindi le singole colonie su piastre LB sono state contate e normalizzate per indicare le cellule batteriche colonizzate sulle radici. Questo metodo viene utilizzato per rilevare la colonizzazione batterica nella rizosfera in condizioni di mono-interazione, con una buona riproducibilità.

Introduzione

Esistono metodi quantitativi e qualitativi per rilevare la colonizzazione della rizosfera da parte di un singolo ceppo batterico. Per il metodo qualitativo, dovrebbe essere utilizzato un ceppo che esprime costitutivamente la fluorescenza e la distribuzione e l'intensità della fluorescenza dovrebbero essere esaminate al microscopio a fluorescenza o con strumenti confocali laser ^1,2. Queste strategie possono riflettere bene la colonizzazione batterica in situ³, ma non sono accurate come i metodi tradizionali di conteggio su piastra nella quantificazione. Inoltre, a causa della limitazione di visualizzare solo zone radicali parziali al microscopio, a volte può essere influenzato da pregiudizi soggettivi.

Qui descriviamo un metodo quantitativo, che include la raccolta delle cellule batteriche colonizzate e il conteggio delle CFU batteriche su una piastra. Questo metodo si basa sulla diluizione e sulla placcatura mediante la quale è possibile contare i ceppi colonizzati che sono stati strappati dalle radici delle piante e calcolare il numero totale di batteri colonizzati sulla radice ^4,5.

In primo luogo, A. thaliana è stata coltivata in condizioni idroponiche, quindi le cellule batteriche sono state inoculate nella rizosfera a una concentrazione finale di 0,01 OD₆₀₀. I tessuti radicali infetti sono stati raccolti 2 giorni dopo l'inoculazione e lavati in acqua sterile per rimuovere le cellule batteriche non colonizzate. Inoltre, le cellule batteriche colonizzate sulla radice sono state raccolte, diluite in tampone salino tamponato con fosfato (PBS) e piastrate su un terreno di agar Luria-Bertani (LB). Dopo l'incubazione a 37 °C per 10 ore, le singole colonie su piastre LB sono state contate e normalizzate per determinare le cellule batteriche colonizzate sulle radici.

Questo metodo è altamente applicabile, ha una buona ripetibilità ed è più adatto per un'accurata determinazione della colonizzazione batterica della rizosfera.

Protocollo

1. Coltivazione idroponica sterile di A. thaliana

1. Prepara le piantine di A. thaliana .
   1. Preparare il terreno di coltura delle piantine di A. thaliana , che consiste in 1/2 terreno MS (Murashige e Skoog) con il 2% (wt/vol) di saccarosio e lo 0,9% (wt/vol) di agar.
   2. Versare il terreno di sterilizzazione preparato in piastre di Petri quadrate sterili (13 cm x 13 cm) prima della solidificazione. Evitare l'asciugatura all'aria per mantenere l'umidità.
   3. Immergere i semi di A. thaliana in una provetta da microcentrifuga da 2 ml riempita con 1 ml di acqua sterile a 4 °C per oltre 12 ore, quindi sterilizzare i semi con 1 ml di NaClO al 2% (vol/vol) per 2 minuti.
   4. Lavare accuratamente i semi con acqua sterile sei volte per rimuovere la soluzione di NaClO. Semina i semi su piastre di Petri con terreno di coltura MS agar con punta sterile da 1 ml.
   5. Sigilla le piastre di Petri con nastro medico traspirante e mettile verticalmente in un'incubatrice leggera per crescere per 1 settimana. Impostare il rapporto giorno/notte dell'incubatrice luminosa a 16 h/8 h, mantenere la temperatura a 23 °C e l'umidità al 40%-60%.
2. Trapiantare A. thaliana.
   1. Tagliare fori da 5 mm su un coloratore per cellule con pori da 40 μm e sterilizzarli.
   2. Trapiantare tre piante di A. thaliana di 7 giorni attraverso i fori di un colino cellulare e metterle in una piastra a 6 pozzetti contenente 3 ml di terreno liquido sterile 1/2 MS con saccarosio allo 0,5%.
   3. Posizionare le piastre a 6 pozzetti in un'incubatrice leggera (Figura 1A) e incubare per 10 giorni.

2. Coltivazione e inoculazione di batteri

1. Preparare la sospensione batterica per l'inoculazione.
   1. Per il Bacillus velezensis, inoculare le cellule batteriche in terreno LB sterile e incubare a 37 °C agitando a 170 giri/min fino a raggiungere OD₆₀₀ di 0,8-1,2.
   2. Raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione a 6000 x g per 2 min e risospendere le cellule in tampone PBS (2 mM KH₂PO₄, 8 mM Na₂HPO₄, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Ripetere le fasi di centrifugazione e risospensione 3 volte per rimuovere il terreno LB e i metaboliti batterici.
   3. Sospendere le cellule batteriche in un terreno fresco di 1/2 MS ad una concentrazione finale di OD₆₀₀ 0,01. Inoculare le sospensioni batteriche nelle piastre a 6 pozzetti che coltivano piantine di A. thaliana , posizionare le piastre a 6 pozzetti nell'incubatrice leggera e coltivarle per 2 giorni.

3. Misurazione dei batteri colonizzati sulle radici

1. Raccogliere il tessuto radicale e placcare le cellule colonizzate.
   NOTA: Tutti i passaggi devono essere condotti in condizioni gnotobiotiche
   1. Pesare le provette da 2 ml e registrare il peso come W₀.
   2. Raccogliere i tessuti radicali di A. thaliana co-coltivati e lavarli in acqua sterile 3 volte. Metti la radice su carta da filtro per rimuovere l'acqua in eccesso.
   3. Mettere la radice nella provetta da microcentrifuga pesata, pesare le radici insieme alla provetta e registrarla come W₁.
   4. Aggiungere 1 mL di PBS a ciascuna provetta e far vorticare le provette per 8 minuti alla massima velocità.
   5. Diluire le sospensioni con le cellule batteriche colonizzate dalle radici raccolte a 1 x ^10-1-1 x ^10-4 (in base alla capacità di colonizzazione batterica). Stendere le sospensioni batteriche diluite su piastre contenenti terreno di agar LB e incubare a 37 °C per 10 ore.
2. Contare le colonie e normalizzare i dati.
   1. Contare le colonie batteriche sulle piastre LB.
   2. Calcolare i CFU in base alla diluizione corrispondente e normalizzare i dati con peso fresco radicale (W_{1-W 0}). I risultati finali indicano il conteggio delle cellule batteriche colonizzate per grammo di radice a 2 giorni dall'inoculazione (Figura 1B).

Risultati

Per testare l'accuratezza della capacità di colonizzazione batterica rilevata con questo metodo nella rizosfera di A. thaliana, abbiamo inoculato separatamente Bacillus velezensis SQR9 WT e un mutante derivato Δ8mcp nella rizosfera di A. thaliana . Il Δ8mcp è un mutante che manca di tutti i geni codificanti i chemocettori e ha una colonizzazione significativamente ridotta⁶. Abbiamo misurato la loro colonizzazione a 2 giorni dopo l'inoculazione con l...

Discussione

Per ottenere una buona riproducibilità, ci sono quattro passaggi critici per il processo di rilevamento della colonizzazione di questo protocollo. In primo luogo, è necessario assicurarsi che il numero di cellule batteriche inoculate sia esattamente lo stesso in ogni esperimento. In secondo luogo, è necessario anche controllare l'intensità di pulizia dei batteri non colonizzati con acqua sterile. In terzo luogo, ogni processo di diluizione del campione deve essere agitato prima di essere eseguito per lasciare che il ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E