MCF-7 Hücrelerinde Oksidatif DNA Hasarını Değerlendirmek için ELISA Testi Kullanılarak 8-okso-dG Seviyesinin Ölçülmesi

Özet

Bu protokol, ELISA teknolojisi ile MCF-7 hücrelerinde DNA oksidatif hasarını kantitatif olarak tespit etmek için etkili bir yöntemi tanımlar.

Özet

8-Okso-7,8-dihidro-2'-deoksiguanozin (8-okso-dG) bazı, yaygın olarak gözlenen DNA oksidatif hasarının baskın şeklidir. DNA bozukluğu, gen ekspresyonunu derinden etkiler ve nörodejeneratif bozuklukları, kanseri ve yaşlanmayı uyarmada çok önemli bir faktör olarak hizmet eder. Bu nedenle, 8-oksoG'nin kesin miktar tayini, DNA hasar tespit metodolojilerinin araştırılmasında klinik öneme sahiptir. Bununla birlikte, şu anda, 8-oxoG tespiti için mevcut yaklaşımlar, kolaylık, uygunluk, satın alınabilirlik ve yüksek hassasiyet açısından zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Farklı konsantrasyonlarda hidrojen peroksit₍H2O2) ile uyarılan MCF-7 hücre örneklerinde 8-okso-dG içeriğindeki varyasyonları tespit etmek için oldukça verimli ve hızlı bir kolorimetrik yöntem olan sandviç enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) tekniğini kullandık. MCF-7 hücrelerinde oksidatif hasara neden olan_H2O2 konsantrasyonunu, MCF-7 hücrelerinde IC₅₀ değerini tespit ederek belirledik. Daha sonra, MCF-7 hücrelerini 12 saat boyunca 0, 0.25 ve 0.75 mM H₂O₂ ile tedavi ettik ve hücrelerden 8-okso-dG çıkardık. Son olarak numuneler ELISA'ya tabi tutulmuştur. Plaka yayma, yıkama, inkübasyon, renk geliştirme, reaksiyonun sonlandırılması ve veri toplama dahil olmak üzere bir dizi adımın ardından,_H2O2tarafından indüklenen MCF-7 hücrelerindeki 8-okso-dG içeriğindeki değişiklikleri başarıyla tespit ettik. Bu tür çabalar sayesinde, hücre örneklerinde DNA oksidatif hasarının derecesini değerlendirmek için bir yöntem oluşturmayı ve bunu yaparken DNA hasarının tespiti için daha uygun ve uygun yaklaşımların geliştirilmesini ilerletmeyi amaçlıyoruz. Bu çaba, DNA oksidatif hasarı ile hastalıklar üzerine klinik araştırmalar ve toksik maddelerin tespiti de dahil olmak üzere çeşitli alanlar arasındaki ilişkisel analizlerin araştırılmasına anlamlı bir katkı sağlamaya hazırdır.

Giriş

DNA oksidatif hasarı, reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumu ile hücresel antioksidan savunma sistemi arasındaki dengesizliğin bir sonucudur¹. Esas olarak DNA pürin ve pirimidin bazlarının^{oksidasyonunu} içerir ^2,3. DNA bazlarının bu oksidatif modifikasyonu sadece genomun bütünlüğünü tehlikeye atmakla kalmaz, aynı zamanda kanser, nörodejeneratif hastalıklar ve kardiyovasküler hastalıklar dahil olmak üzere çok çeşitli patolojik sorunları da kapsar ^4,5. DNA'daki guanin bazı en düşük indirgeme potansiyeline sahiptir ve oksidasyona ....

Protokol

1.MCF-7 hücrelerinde_H2O2ile indüklenen DNA oksidatif hasar modelinin oluşturulması

1. MCF-7 hücre geri kazanımı
   1. 3.5 x 10⁶ MCF-7 hücresi içeren ve -80°C buzdolabında saklanan hücre kültürü kriyojenik tüpünü hızlı bir şekilde sıvı azot içeren köpük kutuya aktarın. Tüpü forseps ile alın ve korunan hücreleri çözmek için yaklaşık 1 dakika boyunca 37 °C sabit sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirin.
      NOT: Bir su banyosunda çözdürme işlemi sırasında, kriyoviyalin eşit şekilde ısınmasını sağlamak için hücreleri aralıklı olarak sallayın.
   2. Kriyoviali bir santrifüje yerleştirin ve oda ....

Tartışmalar

ELISA yöntemlerinin geliştirilmesi hem mevcut hem de yeni DNA hasar tespit metodolojileri için büyük önem taşımaktadır. Geleneksel HPLC ve kütle spektrometresi teknikleriyle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım yalnızca kullanıcı dostu olmakla kalmaz, aynı zamanda yüksek hassasiyet sergiler ve yüksek verimli taramanın^{taleplerini karşılar 30}. Bu, büyük ölçekli hastalık tarama çalışmalarında 8-okso-dG'nin izlenmesini sağlayarak, bu biyobelirteç ile çeşitli hast.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA(1x)	Gibco	25200-072
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Cell Counting Plate	QiuJing	XB-K-25
CO2 incubator	Thermo	51032872
DMEM basic(1X)	Gibco	C11995500BT
FBS	PAN	ST30-3302
GraphPad Prism X9	GraphPad Software		statistical analysis software
H2O2(3%)	Jiangxi Caoshanhu Disinfection Co.,Ltd.	1028348
high-speed centrifuge	Thermo	9AQ2861
Human 8-oxo-dG ELISA Kit	Zcibio	ZC-55410
L-1000XLS+ Pipettes	Rainin	17014382
L-20XLS+ Pipettes	Rainin	17014392
liquid nitrogen tank	Mvecryoge	YDS-175-216
MCF-7 CELL	BNCC	BNCC100137
Multiskan FC microplate photometer	Thermo	1410101
PBS	Solarbio	P1020
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Beyotime	C0222
Trinocular live cell microscope	Motic	1.1001E+12
Ultra-low temperature freezer	Haire	V118574