Quantifizierung des 8-Oxo-dG-Gehalts mittels ELISA-Assay zur Bewertung oxidativer DNA-Schäden in MCF-7-Zellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zum quantitativen Nachweis oxidativer DNA-Schäden in MCF-7-Zellen mittels ELISA-Technologie.

Zusammenfassung

Die 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-desoxyguanosin-Base (8-oxo-dG) ist die vorherrschende Form der häufig beobachteten oxidativen DNA-Schädigung. DNA-Beeinträchtigungen wirken sich tiefgreifend auf die Genexpression aus und sind ein entscheidender Faktor bei der Stimulierung neurodegenerativer Erkrankungen, Krebs und Alterung. Daher ist die präzise Quantifizierung von 8-OxoG von klinischer Bedeutung bei der Untersuchung von Methoden zum Nachweis von DNA-Schäden. Gegenwärtig stellen die bestehenden Ansätze zum 8-OxoG-Nachweis jedoch Herausforderungen in Bezug auf Komfort, Zweckmäßigkeit, Erschwinglichkeit und erhöhte Empfindlichkeit dar. Wir verwendeten die ELISA-Technik (Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent Assay), eine hocheffiziente und schnelle kolorimetrische Methode, um Variationen des 8-Oxo-dG-Gehalts in MCF-7-Zellproben zu erkennen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid (H₂O₂) stimuliert wurden. Wir bestimmten die Konzentration von H₂O₂ , die oxidative Schäden in MCF-7-Zellen induzierte, indem wir ihren IC_50-Wert in MCF-7-Zellen detektierten. Anschließend behandelten wir MCF-7-Zellen 12 h lang mit 0, 0,25 und 0,75 mM H₂O₂ und extrahierten 8-Oxo-dG aus den Zellen. Abschließend wurden die Proben einem ELISA unterzogen. Nach einer Reihe von Schritten, einschließlich Plattenspreizung, Waschen, Inkubation, Farbentwicklung, Beendigung der Reaktion und Datenerfassung, konnten wir erfolgreich Veränderungen des 8-Oxo-dG-Gehalts in MCF-7-Zellen nachweisen, die durch H₂O₂ induziert wurden. Durch diese Bestrebungen wollen wir eine Methode zur Bewertung des Ausmaßes oxidativer DNA-Schäden in Zellproben etablieren und damit die Entwicklung von zweckmäßigeren und bequemeren Ansätzen zur Detektion von DNA-Schäden vorantreiben. Dieses Unterfangen ist bereit, einen bedeutenden Beitrag zur Erforschung assoziativer Analysen zwischen oxidativen DNA-Schäden und verschiedenen Bereichen zu leisten, einschließlich der klinischen Forschung zu Krankheiten und dem Nachweis toxischer Substanzen.

Einleitung

Die oxidative Schädigung der DNA ist die Folge eines Ungleichgewichts zwischen der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und dem zellulären antioxidativen Abwehrsystem¹. Es handelt sich hauptsächlich um die Oxidation von DNA, Purin und Pyrimidinbasen, ^2,3. Diese oxidative Modifikation der DNA-Basen beeinträchtigt nicht nur die Integrität des Genoms, sondern umfasst auch ein breites Spektrum pathologischer Probleme, darunter Krebs, neurodegenerative Erkrankungen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen ^4,5. Die Guaninbase in der DNA h....

Protokoll

1. Aufbau eines H₂O₂ -induzierten DNA-oxidativen Schadensmodells in MCF-7-Zellen

1. Rückgewinnung von MCF-7-Zellen
   1. Das Kryoröhrchen für die Zellkultur, das 3,5 x 10⁶ MCF-7-Zellen enthält und in einem -80 °C-Kühlschrank gelagert wird, wird schnell in eine Schaumstoffbox mit flüssigem Stickstoff umgefüllt. Nehmen Sie den Schlauch mit einer Pinzette heraus und legen Sie ihn für ca. 1 min in ein Wasserbad mit konstanter Temperatur bei 37 °C, um die konservierten Zellen aufzutauen.
      HINWEIS: Schütteln Sie die Zellen während des Auftauvorgangs in einem Wasserbad intermittierend, um eine gleic....

Diskussion

Die Entwicklung von ELISA-Methoden ist sowohl für bestehende als auch für neue Methoden zum Nachweis von DNA-Schäden von großer Bedeutung. Im Vergleich zu herkömmlichen HPLC- und Massenspektrometrie-Techniken ist dieser Ansatz nicht nur benutzerfreundlich, sondern weist auch eine hohe Sensitivität auf und erfüllt die Anforderungen des Hochdurchsatz-Screenings³⁰. Dies ermöglicht das Monitoring von 8-Oxo-dG in groß angelegten Krankheitsscreening-Studien und ermöglicht ein tieferes Verstän.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA(1x)	Gibco	25200-072
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Cell Counting Plate	QiuJing	XB-K-25
CO2 incubator	Thermo	51032872
DMEM basic(1X)	Gibco	C11995500BT
FBS	PAN	ST30-3302
GraphPad Prism X9	GraphPad Software		statistical analysis software
H2O2(3%)	Jiangxi Caoshanhu Disinfection Co.,Ltd.	1028348
high-speed centrifuge	Thermo	9AQ2861
Human 8-oxo-dG ELISA Kit	Zcibio	ZC-55410
L-1000XLS+ Pipettes	Rainin	17014382
L-20XLS+ Pipettes	Rainin	17014392
liquid nitrogen tank	Mvecryoge	YDS-175-216
MCF-7 CELL	BNCC	BNCC100137
Multiskan FC microplate photometer	Thermo	1410101
PBS	Solarbio	P1020
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Beyotime	C0222
Trinocular live cell microscope	Motic	1.1001E+12
Ultra-low temperature freezer	Haire	V118574