MCF-7 세포의 산화 DNA 손상을 평가하기 위해 ELISA 분석을 사용하여 8-oxo-dG 수준 정량화

요약

이 프로토콜은 ELISA 기술을 통해 MCF-7 세포의 DNA 산화 손상을 정량적으로 검출하는 효율적인 방법을 설명합니다.

초록

8-Oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG) 염기는 일반적으로 관찰되는 DNA 산화 손상의 주요한 형태입니다. DNA 손상은 유전자 발현에 지대한 영향을 미치며 신경 퇴행성 질환, 암 및 노화를 자극하는 중추적인 요인으로 작용합니다. 따라서 8-oxoG의 정확한 정량화는 DNA 손상 검출 방법론 연구에서 임상적 중요성을 갖습니다. 그러나 현재 8-oxoG 검출을 위한 기존 접근 방식은 편의성, 편의성, 경제성 및 높은 감도 측면에서 문제를 제기합니다. 우리는 매우 효율적이고 신속한 비색 방법인 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 기술을 사용하여 다양한 농도의 과산화수소(H₂O₂)로 자극된 MCF-7 세포 샘플에서 8-oxo-dG 함량의 변화를 감지했습니다. MCF-7 세포에서 IC₅₀ 값을 검출하여 MCF-7 세포에서 산화 손상을 유도하는_H2O2의 농도를 측정하였다. 그 후, MCF-7 세포를 0, 0.25 및 0.75 mM H₂O₂로 12 시간 동안 처리하고 세포에서 8-oxo-dG를 추출했습니다. 최종적으로, 샘플은 ELISA를 실시하였다. 플레이트 확산, 세척, 배양, 색상 개발, 반응 종료 및 데이터 수집을 포함한 일련의 단계에 따라 H₂O₂ 에 의해 유도 된 MCF-7 세포의 8-oxo-dG 함량 변화를 성공적으로 감지했습니다. 이러한 노력을 통해 세포 샘플 내 DNA 산화 손상 정도를 평가하는 방법을 확립하고, 이를 통해 DNA 손상 검출을 위한 보다 편리하고 편리한 접근 방식의 개발을 추진하는 것을 목표로 합니다. 이러한 노력은 DNA 산화 손상과 질병에 대한 임상 연구 및 독성 물질 검출을 포함한 다양한 영역 간의 연관성 분석을 탐구하는 데 의미 있는 기여를 할 준비가 되어 있습니다.

서문

DNA 산화 손상은 활성산소종(ROS)의 생성과 세포의 항산화 방어 체계 사이의 불균형의 결과이다¹. 그것은 주로 DNA 퓨린과 피리미딘 염기 ^2,3의 산화를 포함합니다. DNA 염기의 이러한 산화적 변형은 게놈의 무결성을 손상시킬 뿐만 아니라 암, 신경 퇴행성 질환 및 심혈관 질환을 포함한 광범위한 병리학적 문제를 포함합니다 ^4,5. DNA의 구아닌 염기는 환원 전위가 가장 낮고 산화에 가장 취약하다⁶. 따라서 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine(8-oxo-dG)은 DNA 산화 손상 ^7,8의 정도를 평가하기 위한 주요 마커 역할을 합니다. 8-oxo-dG의 정확한 정량화는 질병 발생, 진행 및 다인자 산화 부담 평가의 다양한 측면을 다루는 데 있어 중요한 문제가 되었다⁹.

전....

프로토콜

1.MCF-7 세포에서 H₂O₂ 유도 DNA 산화 손상 모델 구축

1. MCF-7 세포 회수
   1. 3.5 x 10⁶ MCF-7 세포가 들어 있고 -80°C 냉장고에 보관된 세포 배양 극저온 튜브를 액체 질소가 들어 있는 폼 상자로 빠르게 옮깁니다. 겸자로 튜브를 회수하고 37°C의 일정한 온도의 수조에 약 1분 동안 넣어 보존된 세포를 해동합니다.
      알림: 수조에서 해동하는 동안 극저온의 균일한 가열을 보장하기 위해 셀을 간헐적으로 흔듭니다.
   2. 극저온을 원심분리기에 넣고 실온에서 150 x g 으로 5분 동안 원심분리합니다.
   3. 피펫을 사용하여 극저온 저장 튜브에서 상층액을 버리고 1mL의 완전한 배양 배지를 추가합니다. 잘 섞어 10mm 배양 접시에 옮기고 7mL의 완전 배양 배지를 추가로 보충합니다.
   4. 균일한 혼합을 보장하기 위해 배양 접시를 십자형 모양으로 흔들고 37°C의 CO₂ 인큐베이터에서 5% CO₂ 로 배양합니다.
      참고: 완전 배양 배지는 소 태아 혈청 10%, 페니실린 1%, 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배양 배지로 구성....

토론

ELISA 분석법의 개발은 기존 및 새로운 DNA 손상 검출 방법론 모두에 매우 중요합니다. 기존의 HPLC 및 질량 분석 기법과 비교하여, 이 접근법은 사용자 친화적일 뿐만 아니라 높은 감도를 나타내며 고처리량 스크리닝(³⁰)의 요구를 충족시킨다. 이를 통해 대규모 질병 스크리닝 연구에서 8-oxo-dG를 모니터링할 수 있어 이 바이오마커와 다양한 질병 간의 상관 관계를 더 깊이 이해할 수 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA(1x)	Gibco	25200-072
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Cell Counting Plate	QiuJing	XB-K-25
CO2 incubator	Thermo	51032872
DMEM basic(1X)	Gibco	C11995500BT
FBS	PAN	ST30-3302
GraphPad Prism X9	GraphPad Software		statistical analysis software
H2O2(3%)	Jiangxi Caoshanhu Disinfection Co.,Ltd.	1028348
high-speed centrifuge	Thermo	9AQ2861
Human 8-oxo-dG ELISA Kit	Zcibio	ZC-55410
L-1000XLS+ Pipettes	Rainin	17014382
L-20XLS+ Pipettes	Rainin	17014392
liquid nitrogen tank	Mvecryoge	YDS-175-216
MCF-7 CELL	BNCC	BNCC100137
Multiskan FC microplate photometer	Thermo	1410101
PBS	Solarbio	P1020
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Beyotime	C0222
Trinocular live cell microscope	Motic	1.1001E+12
Ultra-low temperature freezer	Haire	V118574