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Neste Artigo

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Resumo

Este protocolo descreve um método eficiente para detectar quantitativamente o dano oxidativo do DNA em células MCF-7 pela tecnologia ELISA.

Resumo

A base de 8-Oxo-7,8-dihidro-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dG) é a forma predominante de dano oxidativo do DNA comumente observado. O comprometimento do DNA afeta profundamente a expressão gênica e serve como um fator fundamental na estimulação de distúrbios neurodegenerativos, câncer e envelhecimento. Portanto, a quantificação precisa de 8-oxoG tem significado clínico na investigação de metodologias de detecção de danos ao DNA. No entanto, atualmente, as abordagens existentes para detecção de 8-oxoG apresentam desafios em termos de conveniência, conveniência, acessibilidade e maior sensibilidade. Empregamos a técnica de ensaio imunoenzimático sanduíche (ELISA), um método colorimétrico altamente eficiente e rápido, para detectar variações no conteúdo de 8-oxo-dG em amostras de células MCF-7 estimuladas com diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio (H2O2). Determinamos a concentração de H2O2 que induziu dano oxidativo em células MCF-7 detectando seu valor de IC50 em células MCF-7. Posteriormente, tratamos as células MCF-7 com 0, 0,25 e 0,75 mM H2O2 por 12 h e extraímos 8-oxo-dG das células. Por fim, as amostras foram submetidas a ELISA. Após uma série de etapas, incluindo espalhamento da placa, lavagem, incubação, desenvolvimento de cor, término da reação e coleta de dados, detectamos com sucesso alterações no conteúdo de 8-oxo-dG em células MCF-7 induzidas por H2O2. Por meio de tais esforços, pretendemos estabelecer um método para avaliar o grau de dano oxidativo do DNA em amostras de células e, ao fazê-lo, avançar no desenvolvimento de abordagens mais convenientes e convenientes para a detecção de danos ao DNA. Este esforço está pronto para fazer uma contribuição significativa para a exploração de análises associativas entre o dano oxidativo do DNA e vários domínios, incluindo pesquisa clínica sobre doenças e detecção de substâncias tóxicas.

Introdução

O dano oxidativo do DNA é consequência de um desequilíbrio entre a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) e o sistema de defesa antioxidante celular1. Envolve principalmente a oxidação de bases de DNA purina e pirimidina 2,3. Essa modificação oxidativa das bases do DNA não apenas compromete a integridade do genoma, mas também abrange uma ampla gama de problemas patológicos, incluindo câncer, doenças neurodegenerativas e doenças cardiovasculares 4,5. A base guanina no DNA tem o menor potencial de redução e é a mais suscetível à oxidação6. Portanto, a 8-oxo-7,8-dihidro-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dG) serve como um marcador primário para avaliar a extensão do dano oxidativo do DNA 7,8. A quantificação precisa de 8-oxo-dG tornou-se uma questão crítica na abordagem de vários aspectos da ocorrência da doença, progressão e avaliação da carga oxidativa multifatorial9.

Os métodos tradicionais de detecção de 8-oxo-dG, como cromatografia líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica (HPLC-ECD), espectrometria de massa e técnicas hifenizadas relacionadas, exibem alta sensibilidade e especificidade 10,11,12. No entanto, essas técnicas geralmente têm requisitos operacionais complexos e altos custos, o que dificulta sua ampla aplicabilidade e praticidade na análise de amostras de alto rendimento. Com o avanço contínuo da ciência e da tecnologia, surgiu uma variedade de métodos novos, eficientes e precisos. A aplicação dessas novas tecnologias nos permite quantificar o nível de 8-oxo-dG com mais precisão e fornece ferramentas mais poderosas para um estudo aprofundado da associação entre estresse oxidativo e doença. Por exemplo, os pesquisadores aplicaram a tecnologia de nanoporos para detectar e sequenciar quantitativamente o DNA13, identificar tipos de danos ao DNA usando uma estratégia de sequenciamento de código com um único clique14, desenvolver métodos de sequenciamento de alto rendimento e criar biossensores baseados em 8-oxoG integrando biotina-estreptavidina com ELISA15. Entre eles, o ELISA, com suas vantagens reconhecidas em termos de especificidade, triagem de alto rendimento e custo, é uma das soluções ideais para a detecção de 8-oxo-dG. Portanto, é crucial desenvolver um método de alto rendimento, altamente sensível, conveniente e rápido para detectar 8-oxo-dG.

A técnica de ensaio imunoenzimático (ELISA), desenvolvida em 197116, avançou rapidamente nos últimos 50 anos e tornou-se um dos métodos de detecção mais comumente usados nas áreas de biologia e medicina 17,18,19. A tecnologia ELISA exibe alta sensibilidade e especificidade, possui um tempo de reação curto e é fácil de usar, tornando-a uma escolha amplamente reconhecida para testes de amostras em larga escala e análise de alto rendimento20. Como resultado, o ELISA tem sido amplamente utilizado para análise quantitativa ou semiquantitativa de compostos, proteínas, anticorpos ou moléculas dentro das células 21,22,23. Por exemplo, tem sido utilizado na detecção de biomarcadores associados a várias doenças, resíduos de drogas e biomoléculas24. Os ELISAs podem ser categorizados em quatro tipos principais com base no desenho experimental e nos princípios25. Esses métodos incluem ELISA direto, ELISA indireto, ELISA sanduíche e ELISA competitivo26,27. Dentre estes, o ELISA sanduíche, que utiliza dois anticorpos específicos, um para capturar a molécula alvo e outro para detecção, foi escolhido para o estudo neste artigo. O princípio experimental do ELISA sanduíche é o seguinte: Primeiro, um anticorpo específico é imobilizado nos poços de uma microplaca para capturar o analito de interesse. Depois que o padrão ou amostra é adicionado, o analito alvo se liga ao anticorpo imobilizado. Posteriormente, um anticorpo marcado que reconhece um epítopo diferente no antígeno é adicionado, formando uma estrutura sanduíche. Após a remoção de anticorpos não ligados, um substrato é adicionado. Sob a ação catalítica do anticorpo secundário, ocorre uma reação de cor e a intensidade da cor é positivamente correlacionada com a concentração do analito alvo na amostra. Por fim, a densidade óptica (DO) foi medida para determinar a concentração da amostra. O ELISA sanduíche tem as vantagens de aumentar a sensibilidade e especificidade para amostras-alvo, o que o torna adequado para detectar baixas concentrações de analitos alvo e amostras complexas28. Além disso, os resultados obtidos podem ser quantificados para análise posterior. Esses fatores tornam o ELISA sanduíche um método de detecção comumente usado tanto em pesquisas científicas quanto em laboratórios clínicos29.

Este estudo teve como objetivo detectar quantitativamente 8-oxo-dG em células MCF-7 para determinar o grau de dano oxidativo do DNA nas células. Este estudo consiste em duas partes principais: construir um modelo de dano oxidativo do DNA da célula MCF-7 e detectar 8-oxo-dG usando ELISA. Primeiramente, as células MCF-7 foram cultivadas in vitro e tratadas com diferentes concentrações de H2O2 por diferentes durações. A viabilidade celular foi avaliada usando um ensaio CCK-8 para determinar a concentração inibitória semimáxima (IC50) de H2O2 em células MCF-7. Com base nos valores de IC50 , um tempo de tratamento H2O2 adequado e concentração de indução foram escolhidos. Para extrair amostras de células MCF-7 danificadas por oxidação, amostras de células e sobrenadantes foram obtidos e adicionados a poços ligados a enzimas previamente revestidos com anticorpos 8-oxo-dG. O 8-oxo-dG presente na amostra se ligará aos anticorpos ligados ao transportador de fase sólida. Em seguida, foram adicionados anticorpos 8-oxo-dG marcados com peroxidase de rábano. A mistura de reação foi incubada a uma temperatura constante para garantir a ligação completa da amostra e do anticorpo. A enzima não ligada foi removida por lavagem e, em seguida, o substrato colorimétrico foi adicionado, o que produziu uma cor azul. Sob a ação do ácido, a solução ficou amarela. Finalmente, o valor de DO das amostras de poço de reação foi medido a 450 nm, e a concentração de 8-oxo-dG na amostra foi proporcional ao valor de DO. Ao gerar uma curva padrão, a concentração de 8-oxo-dG na amostra pode ser calculada.

Protocolo

1. Construção de um modelo dedano oxidativo do DNA induzido por H2O2 em células MCF-7

  1. Recuperação de células MCF-7
    1. Transfira rapidamente o tubo criogênico de cultura de células, que contém 3,5 x 106 células MCF-7 e é armazenado em uma geladeira a -80 ° C, para uma caixa de espuma contendo nitrogênio líquido. Recupere o tubo com uma pinça e coloque-o em banho-maria a 37 °C em temperatura constante por aproximadamente 1 min para descongelar as células preservadas.
      NOTA: Durante o processo de descongelamento em banho-maria, agite as células intermitentemente para garantir o aquecimento uniforme do criogenial.
    2. Coloque o criovial em uma centrífuga e centrifugue em temperatura ambiente a 150 x g por 5 min.
    3. Use uma pipeta para descartar o sobrenadante do tubo de armazenamento criogênico e adicione 1 mL de meio de cultura completo. Misture bem e transfira para uma placa de cultura de 10 mm, complemente mais 7 mL de meio de cultura completo.
    4. Agitar a placa de cultura num padrão cruzado para garantir uma mistura uniforme e cultivar numa incubadora de CO2 a 37 °C com 5% de CO2.
      NOTA: O meio de cultura completo consiste em meio de cultura DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina e estreptomicina.
  2. Avaliação da viabilidade celular
    1. Selecione células MCF-7 na fase de crescimento logarítmico com bom status celular para o experimento. Durante a fase de crescimento logarítmico, as células normalmente exibem um ciclo de divisão mais curto e uma alta frequência de divisão celular.
      1. Observe a morfologia e a taxa de crescimento das células MCF usando um microscópio eletrônico. Quando as células apresentam uma morfologia de monocamada uniforme e densamente compactada, e a proliferação celular é evidente, pode-se determinar que as células estão essencialmente na fase de crescimento logarítmico.
    2. Lavagem celular: Use uma pipeta para remover o meio de cultura da placa de cultura, adicione 1 mL de tampão PBS para lavar as células e, em seguida, descarte o PBS.
    3. Descolamento celular: Adicione 1 mL de tripsina para lavar as células, aguarde cerca de 1 min para que a tripsina se desprenda completamente das células da placa de cultura. Bata suavemente no prato de cultura; Observação do movimento celular
      nas folhas indica descolamento celular completo.
    4. Término do descolamento celular e contagem de células: Adicione 8 mL de meio de cultura completo para encerrar o descolamento, pipete suavemente as células e determine a concentração de suspensão celular usando um dispositivo de contagem de células.
      NOTA: Certifique-se de que a suspensão celular esteja homogênea antes de contar, pipetando suavemente para cima e para baixo.
    5. Semeadura celular: Ajuste a suspensão celular diluída para atingir uma densidade celular de 5.000 células por 100 μL. Inocule a suspensão celular em 21 poços de uma placa de 96 poços usando uma pipeta, dispensando 100 μL em cada poço. Adicione 100 μL de tampão PBS aos poços circundantes dos poços semeados para evitar a evaporação excessiva do meio de cultura.
    6. Preparação de meio contendo H2O2: Escolha 9 poços na placa de cultura de células de 12 poços e atribua rótulos com base no gradiente das concentrações de H2O2 (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0 mM). Adicione 720 μL de meio completo aos poços rotulados como 2,0 mM e 1,5 mM e adicione 360 μL de meio completo aos poços restantes.
      1. Usando uma pipeta, dispense 1,63 μL e 1,22 μL de reagente a 3% de H2O2 nos poços rotulados como 2,0 mM e 1,5 mM, respectivamente. Misture bem a solução. Usando uma pipeta, transfira 360 μL de 2,0 mM H2O2 para o poço marcado com 1,0 mM e misture; em seguida, transferir 360 μL de 1,0 mM H2O2 para o poço marcado 0,5 mM e misturar; e, finalmente, transferir 360 μL de 0,5 mM H2O2 para o poço marcado 0,25 mM. Pipete 360 μL de 1,5 mM H2O2 no poço marcado com 0,75 mM para diluir e atingir a concentração desejada. (Figura 1).
        NOTA: Certifique-se de que a solução estoque H2O2 na pipeta seja completamente transferida para os poços para evitar qualquer solução residual. Assegurar uma mistura completa das soluções antes de proceder à diluição.
    7. Incubação: Após aproximadamente 24 h de semeadura celular, use uma pipeta para remover o meio de cultura da placa de 96 poços assim que as células aderirem às superfícies. De acordo com o gradiente de concentração, adicione o respectivo meio contendo H2O2 a cada poço. Retorne a placa à incubadora por 12 h.
    8. Adição do reagente CCK-8: Após o período de tratamento designado de 12 h, use uma pipeta para remover o meio de cultura da placa de 96 poços, adicione 100 μL de meio de cultura completo e 10 μL de reagente CCK-8 a cada poço e inclua três poços de controle em branco. Incubar a placa a 37 °C durante 2 h.
      NOTA: Durante o processo de adição de amostras, evite a formação de bolhas para evitar qualquer interferência na leitura do valor OD.
    9. Medição de absorbância: Retire a placa de 96 poços da incubadora, meça a absorbância em um comprimento de onda de 450 nm usando um leitor de microplacas e registre os resultados.
    10. De acordo com a fórmula de cálculo IC50 ,
      taxa de inibição (%) = (DO do grupo experimental de drogas-DO médio do buraco de controle de drogas)/ (DO médio do buraco de controle celular-DO médio do buraco de controle de drogas) x 100%
      Calcular os resultados em percentagem de absorvância nas culturas de controlo.
    11. Importe os dados experimentais processados para um software de análise estatística, selecione o tipo de análise Regressão não linear, construa o modelo logístico de quatro parâmetros e clique no botão Ajustar curva para ajuste de curva. Após o processo de adaptação, o software calculará automaticamente o valor IC50 .
  3. Experimento de oxidação de células MCF-7 induzido por H2O2
    1. Recupere células MCF-7 na fase de crescimento logarítmico com bom estado celular para experimentação.
    2. Lave, execute o descolamento celular, termine o descolamento e conte as células (consulte a etapa 1.2 para métodos específicos).
    3. Semeadura celular: Ajuste a densidade da suspensão celular para 1 x 106 células por placa, com 4 mL da suspensão por placa de 6 cm de diâmetro.
    4. Rotule dois tubos de microcentrífuga de 5 mL como 0.25 mM e 0.75 mM 3% H2O2. Adicione 4 mL de meio completo a cada tubo e, em seguida, adicione 1,13 μL e 3,40 μL de 3% H2O2, respectivamente. Agite suavemente os tubos para garantir uma mistura completa. Substituir o meio de cultura nas três placas por um meio completo contendo concentrações de H2O2 de 0, 0,25 e 0,75 mM.
    5. Incubar as culturas: Devolva os pratos à incubadora por 12 h.

2. Preparação de amostras celulares e preparação de reagentes ELISA

  1. Coleta de amostras de extrato celular
    1. Coleta de amostras: Descarte o sobrenadante de cultura de células MCF-7, enxágue, execute o descolamento celular, encerre o descolamento e colete as células. Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrífuga de 15 mL.
    2. Centrifugação: Centrifugue a 800 x g por 5 min para coletar o pellet da célula. Adicione 200 μL de PBS para ressuspender cada amostra de célula e interromper as células por ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Centrifugue o lisado celular a 1.500 x g por 10 min e use uma pipeta para coletar o sobrenadante para análise.
      NOTA: Quando a quantidade de células for baixa, reduza o volume de PBS usado para ressuspensão. As amostras podem ser armazenadas a 4 °C por até 1 semana se a análise imediata não for possível. Para armazenamento a longo prazo, alíquota das amostras com base em quantidades de uso único e armazene-as a -80 °C para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
  2. Preparação de reagentes ELISA
    1. Descongelamento de reagentes: Permita que os reagentes ELISA, incluindo filmes de vedação, placas pré-revestidas, padrões, diluente de amostra, anticorpo de detecção-HRP, substrato cromógeno, solução de parada, tampão de lavagem concentrado (20x) e as amostras de teste atinjam a temperatura ambiente (18-25 °C) por 20 min antes de iniciar o ensaio. Pré-abra o leitor ELISA 15 minutos antes de usar.
    2. Preparação do tampão de lavagem: Calcule o volume necessário de tampão de lavagem diluído e, em seguida, dilua 20x tampão de lavagem concentrado com água destilada ou deionizada em 1x solução de trabalho. Devolva qualquer tampão de lavagem concentrado não utilizado ao refrigerador a 4 °C.
      NOTA: O tampão de lavagem deve ser preparado fresco antes do uso. Se houver cristais no tampão de lavagem concentrado armazenado na geladeira, deixe-o atingir a temperatura ambiente e agite-o suavemente até que os cristais se dissolvam completamente antes da utilização.
    3. Preparação do padrão
      1. Preparar soluções de trabalho de amostras padrão com concentrações de 1,25, 2,5, 5, 10, 20 e 40 ng/mL, respectivamente. Para garantir a precisão dos resultados experimentais, misture cuidadosamente as amostras padrão para cima e para baixo antes de usar para evitar a formação de bolhas durante o processo de dissolução.

3. Experiência ELISA

  1. Revestimento de placas: Projete o número total de poços para padrões, amostras e blanks/controles com antecedência e retire as tiras de placas necessárias. Adicione 50 μL de solução de trabalho padrão e amostras de detecção com diferentes concentrações aos poços de reação. Execute padrões em triplicados e evite adicionar quaisquer amostras aos poços em branco/controle25.
    NOTA: As etapas experimentais do ensaio ELISA são mostradas esquematicamente na Figura 2. Se a concentração da amostra exceder a faixa de detecção, a amostra deve ser diluída com diluente de amostra antes da amostragem. Ao adicionar amostras, adicione-as ao fundo da placa, evitando tocar nas paredes do poço, agite suavemente para misturar e evite a formação de bolhas. Para garantir a precisão do experimento, cada adição de amostra deve ser concluída em 10 minutos.
  2. Incubação: Exceto para os poços em branco, adicione 100 μL de anticorpo de detecção conjugado com peroxidase de rábano (HRP) a cada poço de reação, sele os poços com um selo de placa e incube a 37 ° C por 60 min em uma incubadora de temperatura constante.
  3. Lavagem: Descarte o líquido, sacuda o líquido nos poços da placa, seque em papel absorvente, adicione 350 μL de tampão de lavagem a cada poço de reação, deixe repousar por 1-2 min e, em seguida, descarte o tampão de lavagem. Repita o processo de lavagem 5x.
    NOTA: A lavagem completa é crucial porque afeta diretamente a precisão dos resultados experimentais. Certifique-se de que o tampão de lavagem seja completamente sacudido após cada lavagem. Limpe cuidadosamente qualquer resíduo no fundo da placa após a lavagem para evitar afetar a medição da absorbância.
  4. Reação de cor: Adicione 50 μL de substrato A e 50 μL de substrato B a cada poço de reação, feche a placa e incube a 37 °C no escuro por 15 min.
    NOTA: Depois de adicionar o reagente de cor, observe a mudança de cor nos poços de reação imediatamente. Se a cor estiver muito escura, adicione a solução de parada para encerrar a reação mais cedo.
  5. Termine a reação e meça a absorbância: Adicione 50 μL de solução de parada a cada poço de reação e meça imediatamente o valor de OD no comprimento de onda de 450 nm com um leitor ELISA (dentro de 15 min).
  6. Análise de dados: Importe os dados experimentais processados para o software de análise estatística, selecione o tipo de análise Regressão Linear. Construa uma curva de calibração traçando a concentração dos padrões no eixo X em relação aos valores de densidade óptica (OD) no eixo Y. Utilize a curva de calibração estabelecida para determinar a concentração de 8-oxo-dG presente nas amostras. Construa um modelo matemático Logístico e clique no botão Ajustar curva para ajuste de curva. Após o processo de ajuste, o software calcula automaticamente a curva padrão e o valor P.
    NOTA: A curva padrão não pode ser reutilizada e precisa ser determinada novamente para cada experimento.

Resultados

Conforme ilustrado na Figura 3, o eixo X denota a concentração de H2O2 aplicada às células MCF-7, enquanto o eixo Y indica a viabilidade celular. O tratamento com 0,75 mM por 12 h reduziu a viabilidade das células MCF-7 para 67%. Concomitante ao aumento da concentração, houve uma diminuição significativa na viabilidade das células MCF-7, particularmente na concentração de 1,5 mM, onde a viabilidade diminuiu para menos de 3% (Tabela 1). Os re...

Discussão

O desenvolvimento de métodos ELISA é de grande importância para as metodologias de detecção de danos ao DNA existentes e novas. Em comparação com as técnicas tradicionais de HPLC e espectrometria de massa, essa abordagem não é apenas fácil de usar, mas também exibe alta sensibilidade e atende às demandas de triagem de alto rendimento30. Isso permite o monitoramento do 8-oxo-dG em estudos de rastreamento de doenças em larga escala, facilitando uma compreensão mais profunda da correla...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Equipe de Pesquisa Inovadora para Ciência e Tecnologia da Instituição de Ensino Superior de Jiangsu (2021), Programa do Centro de Pesquisa de Tecnologia de Engenharia da Faculdade Vocacional de Jiangsu (2023), Programa de Tecnologia-Chave dos Projetos de Tecnologia de Subsistência do Povo de Suzhou (SKY2021029), Projeto Aberto do Biobanco de Recursos Clínicos de Jiangsu (TC2021B009), Projeto do Laboratório Estadual de Medicina e Proteção de Radiação, Universidade de Soochow (GZK12023013), Programas da Faculdade de Saúde Vocacional de Suzhou (SZWZYTD202201) e Projeto Qing-Lan da Província de Jiangsu na China (2021, 2022).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA(1x)Gibco25200-072
Cell Counting Kit-8DojindoCK04
Cell Counting PlateQiuJingXB-K-25
CO2 incubatorThermo51032872
DMEM basic(1X)GibcoC11995500BT
FBSPANST30-3302
GraphPad Prism X9GraphPad Softwarestatistical analysis software
H2O2(3%)Jiangxi Caoshanhu Disinfection Co.,Ltd.1028348
high-speed centrifugeThermo 9AQ2861
Human 8-oxo-dG ELISA KitZcibioZC-55410
L-1000XLS+ PipettesRainin17014382
L-20XLS+ PipettesRainin17014392
liquid nitrogen tankMvecryogeYDS-175-216
MCF-7 CELLBNCCBNCC100137
Multiskan FC microplate photometerThermo1410101
PBSSolarbioP1020
Penicillin-Streptomycin Solution, 100XBeyotimeC0222
Trinocular live cell microscopeMotic1.1001E+12
Ultra-low temperature freezerHaireV118574

Referências

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