Kümülüs-Oosit Komplekslerinin Hemen Kısmi Uzaklaştırılması: İn Vitro Fertilizasyonun Hızlı Gözlemi İçin Rafine Bir Yaklaşım

Özet

Burada, IVF gözlem sürecini hızlandırmak, granüloza hücresinin çıkarılması için gereken süreyi azaltmak, dış elementlere oosit maruziyetini en aza indirmek ve embriyo gelişimini engellememek için yumurta alımını takiben kümülüs-oosit komplekslerinin bir kısmının derhal çıkarılması için optimize edilmiş bir yöntem sunuyoruz.

Özet

İn vitro fertilizasyon (IVF) için klinik ve laboratuvar teknolojilerindeki hızlı gelişmelere rağmen, hastaların önemli bir kısmı (%10-15) döllenme bozuklukları yaşamaya devam etmekte, bu da düşük döllenme oranlarına ve cansız embriyoların üretimine yol açmaktadır. Kısa süreli döllenme, ikinci polar cismin ekstrüzyonunu gözlemlemek için granüloza hücrelerinin erken uzaklaştırılmasını içerir, bu da düşük döllenme oranlarını ve tam döllenme başarısızlığını ele almak için döllenmenin değerlendirilmesini ve erken iyileştirici önlemleri mümkün kılar. Bununla birlikte, IVF'de kısa süreli döllenmenin gözlemlenmesi, aşırı büyük işlenmemiş kümülüs-oosit kompleksleri kümeleri ve yumurtalar arasında yapışma, granüloza hücresinin çıkarılması için karmaşık dış prosedürler gerektirme ve uzun gözlem süresi gibi zorluklar tarafından engellenmektedir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, bu çalışma, yumurta alımından sonra granüloza hücrelerinin derhal kısmi olarak çıkarılması için bir yöntem önermektedir. Bu yaklaşım, kısa süreli döllenme ve geleneksel döllenme izlemenin sonraki aşamalarını kolaylaştırır, oosit ekstrüzyonu için gereken süreyi azaltır, oositler üzerinde dış çevresel etki olasılığını en aza indirir ve kritik döllenme gözlem penceresini kaçırma riskini azaltır. Sonuç olarak, çalışma, IVF'de embriyonik laboratuvarların operasyonel verimliliğini artırmayı amaçlayan yeni klinik kanıtlar sunmaktadır.

Giriş

İn vitro fertilizasyon-embriyo transferi (IVF-ET) alanında, tipik döllenme oranı %60 ila %80 ^{aralığındadır1}. Bununla birlikte, vakaların yaklaşık %4 ila %16'sı ya tam gübreleme başarısızlığı ya da düşük gübreleme oranlarıyla karşılaşır ve bu da tahminde zorluklar yaratır ^2,3. Klinik gebelik sonuçlarını iyileştirmek ve tam döllenmeme ve düşük döllenme oluşumlarını azaltmak için, IVF prosedürlerinde kısa süreli döllenmenin kullanımı artmaktadır⁴. Bu yaklaşım, ikinci polar cismin ekstrüzyonunu izlemek, döllenme durumunu değerlendirmek ve potansiyel olarak iyileştirici intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) yapmak için granüloza hücrelerinin derhal çıkarılmasını gerektirir. Oosit kümülüs hücre kompleksi (OCCC) ile oosit arasındaki bağ, kısa süreli döllenme sırasında geleneksel gece döllenmesine kıyasla daha güçlüdür, bu nedenle OCCC'nin uzaklaştırılmasının zorluğunu artırır⁵. Oosit sayısının fazlalığı, büyük OCCC kompleksleri veya oositler arası yapışıklıklar gibi faktörler, kısa süreli döllenme sırasında granüloza hücresi çıkarma sürelerinin uzamasına ve böylece yumurtaların kuluçka makinesinin dışında kalma süresinin uzamasına neden olabilir⁴. Döllenme gözlem periyodunu optimize etmek için, önemli OCCC komplekslerine sahip oositlerden granüloza hücrelerinin kısmi eksizyonunu içeren, yumurta toplama sonrası modifiye bir yaklaşım tasarlanmıştır. Bu teknik, oositleri çevreleyen granüloza hücrelerinin tutulmasına, erken oosit yapısının⁶ bütünlüğünün korunmasına ve bu hücrelerin oosit olgunlaşması ve müteakip döllenme-embriyo bağlanması⁷ için hayati faktörleri sağlamaya devam etmesine izin verilmesine yardımcı olur.

Sonuç olarak, bu çalışma, bir üreme tıbbı merkezinde IVF-ET tedavisi gören hastalara araştırma katılımcıları olarak odaklanmakta olup, acil parsiyel granüloza hücreli mekanik eksizyon yönteminin hem kısa süreli döllenme hem de gece döllenme izlemesi için prosedürlerin süresi üzerindeki etkisini araştırmayı ve aynı zamanda normal döllenme ve geç evre gelişimin sonuçlarını değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Bu araştırma, IVF'de embriyo laboratuvar prosedürlerini geliştirmek için değerli bilgiler sunmayı amaçlamaktadır.

Protokol

Tüm prosedürler, Meizhou Halk Hastanesi Üreme Tıbbı Bölümü'nün standart çalışma prosedürlerine uygun olarak yürütüldü ve aynı bölümün Etik Kurulu tarafından incelemeye tabi tutuldu. Katılan her çiftten yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Çalışma, bölünme veya blastosist aşaması embriyo transferi ile ilk IVF döngüsünden geçen katılımcıların yanı sıra 20 ila 45 yaş arasındaki kadınları da içeriyordu. Dışlama kriterleri, donör yumurta / sperm kullanımını ve konjenital veya ikincil uterus anormallikleri gibi spesifik durumları içeriyordu (ör., septat uterus, unicornuate uterus, uterus didelfiz), adenomyozis, uterus submukozal fibroidler veya embriyo transferi gününde 7 mm'nin altındaki endometriyal kalınlık. Aralık 2023 ile Şubat 2024 arasında kaydedilen toplam 115 hasta, OCCC'nin hemen kısmi çıkarılmasının yapılıp yapılmadığına bağlı olarak iki gruba ayrıldı.

1. Oosit alımından önce hazırlık

1. Oosit toplama kaplarını (Malzeme Tablosu) gece boyunca 37 °C'deki inkübatöre yerleştirin.
2. 12 mL folikül manipüle edici ortamı (Malzeme Tablosu) 14 mL yuvarlak tabanlı test tüplerinde gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Oosit alımından 30 dakika önce tüpleri önceden ısıtılmış test tüpü rafına aktarın.
3. Folikül manipüle edici ortamı hazırlayın: 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir test tüpüne (Malzeme Tablosu) 9 mL folikül manipüle ortamı ekleyin ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Oosit toplama gününde, ortamın 4.5 mL'sini 2 mL %100 parafin yağı ile kaplanmış önceden inkübe edilmiş bir oosit toplama kabına (Malzeme Tablosu) aktarın.
4. OCCC yıkama solüsyonunu hazırlayın: Bir oosit toplama kabına 4,5 mL gübreleme ortamı (Malzeme Tablosu) ekleyin ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
5. Gübreleme ortamını hazırlayın: %100 parafin yağı ile kaplı 6 cm'lik bir tabağa 1 mL gübreleme ortamı ekleyin (Malzeme Tablosu) ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
6. Cam Pasteur pipetlerini hazırlayın (Malzeme Tablosu): Uçları bir alkol lambasında yaklaşık 5 saniye yakarak nazikçe köreltin ve yuvarlayın (Şekil 1). Pasteur pipetlerinin ucuna bir emme başlığı takın ve çizilmeden tabağın dibine temas edebildiğinden emin olun. Cam Pasteur pipetlerini ve 10 cm'lik tabakları bir folikül manipülasyon ortamı ile durulayın.

2. Oosit alımı ve OCCC'nin hemen kısmen çıkarılması

NOT: Oosit izolasyonu ve OCCC çıkarma işlemleri sırasında stereomikroskop kullanın. En iyi sonuçlar için, tüm prosedürler sıcaklık kontrollü (37 °C) bir ısıtma masasında yapılmalı ve tüm ekipman oosit alımından 30 dakika önce önceden ısıtılmalıdır.

1. Oosit alımı sırasında yumurtlama öncesi foliküler sıvıyı ESHRE tavsiyelerine göre^{toplayın 8}.
   1. Kısaca, transvajinal ultrason rehberliğinde oositleri almak için 17 G'lik bir iğne kullanın. Uygun negatif basınç 120-140 mmHg arasında değişir.
   2. 14 mL yuvarlak tabanlı test tüpünde toplanan foliküler sıvıyı, sıvı derinliğini 0,5 cm'den daha az koruyarak 10 cm'lik bir tabağa (Malzeme Tablosu) dökün. Çanağı sabit sıcaklıktaki bir platforma (37 °C) yerleştirin.
2. Oositlerin varlığını doğrulamak ve olgunluklarını değerlendirmek için OCCC'yi stereomikroskop altında gözlemleyin.
   NOT: OOOC'nin olgunluğu, kümülüs hücrelerinin morfolojisine ve belirli oosit yapılarının^{görünürlüğüne göre değerlendirilir 9}.
3. OCCC'yi künt uçlu bir Pasteur pipeti kullanarak aspire edin. 10 cm'lik tabağı yaklaşık 15 derece eğin ve tüm büyük OCCC'yi yayın. Oosit ve çevresindeki granüloza hücrelerini 2500 μm'lik bir yarıçap içinde aspire etmekten kaçının. Fazla granüloza hücrelerini Pasteur pipeti ile uzunlamasına eksen boyunca kesin (Şekil 2). Ayrıntılı adımlar aşağıdaki gibidir:
   1. Foliküler sıvıda grimsi yarı saydam bir mukoid kitle olup olmadığını görmek için çıplak gözle gözlemleyin. Bulunamazsa, bir stereomikroskop olan OCCC altında dışarıdan içeriye saat yönünde döndürerek grimsi yarı saydam mukoid kütlesini hızlı bir şekilde arayın.
   2. OCCC'de oosit olup olmadığını onaylayın ve oosit olgunluğunun ön değerlendirmesini yapın.
   3. Ardından, yuvarlak alevle parlatılmış bir Pasteur pipeti ile bir silikon aspirasyon pipetini önceden hazırlayın, OCCC'yi aspire edin ve aynı zamanda, kültür kabını 10 cm'lik çanağı tutan elin sol yüzük parmağı ile saat 9-10 konumunda nazikçe kaldırın, kültür kabını hafifçe yaklaşık 15° sola eğin (yüzük parmağını tabağın altına yerleştirmek yaklaşık olarak gereken açıdır).
   4. Tabağın saat 11 konumunda aspire edilmiş OCCC'yi tükürürken, yavaşça yatay olarak sağa doğru uzatın. Ardından, genişlemiş OCCC'nin etrafındaki granüloza hücrelerinin boyutunu gözlemleyin. Daha sonra, yatay olarak uzatılmış OCCC'nin uygun konumunda, fazla granüloza hücreleri üzerinde yukarıdan aşağıya hızlı ve yumuşak bir inen kesim yapmak için Pasteur pipetini kullanın.
4. Kesilen OCCC'yi OCCC yıkama solüsyonu içeren bir toplama kabına aktarın. Kalan foliküler sıvıyı steril bir numune kabına dökün (Malzeme Tablosu). Tüm kompleksler toplanana kadar bu adımları tekrarlayın.

3. Sperma hazırlama ve in vitro tohumlama

1. Oosit alımı sabahı boşalma yoluyla meni örneklerini toplayın. Dünya Sağlık Örgütü (WHO, 2010) kriterlerine göre ışık mikroskobu altında sperm konsantrasyonunu, hareketliliğini ve morfolojisini değerlendirin¹⁰. Ardından, sperm peletini yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve döllenme ortamında¹¹ iki kez yıkayın. İhtiyaç duyulana kadar %6_CO2 ve 37 °C'de inkübe edin.
2. Döllenme kabına alındıktan yaklaşık 2-3 saat sonra tek bir damlacık içinde mililitre başına 1 x 10⁵ ila 3 x 10⁵ hareketli spermatozoa ile tohumlama OCCC'leri (Malzeme Tablosu). Döllenme kabına 6-8 OCCC ve 1 mL gübreleme ortamı ekleyin.
   NOT: Yapışkan OCCC'yi yıkadıktan sonra, bir Pasteur pipeti kullanılarak gübreleme kabına aktarılırlar. Her seferinde bir OCCC'yi serbest bırakın, bir sonrakini serbest bırakmadan önce pipeti sıvı yüzeyinden nazikçe kaldırın ve kümelenmeyi önlemek için her OCCC'nin tabağa ayrı ayrı yerleştirildiğinden emin olun.

4. Kümülüs hücrelerinin çıkarılması

1. Kısa süreli gübreleme için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
   1. OCCC'leri spermatozoa ile birlikte 4-6 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, oositleri çevreleyen kümülüs hücrelerini mekanik olarak çıkarın.
   2. Kümülüs hücrelerinin tamamen çıkarılmasını sağlamak için oositlerden biraz daha küçük bir iç çapa sahip bir pipet kullanarak oositleri aspire edin.
   3. İki polar cismin varlığını gözlemleyerek döllenmeyi onaylayın. İkinci bir polar cisim gösteren oositler döllenmiş olarak kabul edilir.
   4. İkinci polar gövdeyi döllenme hataları olarak göstermeyen ve kurtarma ICSI'sini gerektiren vakaları tanımlayın.
2. Düzenli gübreleme için, 18-20 saatlik birlikte inkübasyondan sonra, döllenme değerlendirmesi için pipetleri kullanarak kümülüs hücrelerini çıkarın.

5. Embriyo kültürü

1. Oosit alımını takiben 3-5 gün boyunca döllenmiş oositleri kültürleyin ve izleyin. Pronükleus sayısını belirlemek için tohumlamadan 20 saat sonra döllenmeyi değerlendirin. Daha sonra, her bir zigotu orta boy bir damlacık içinde ayrı ayrı kültürleyin ve döllenme sonrası embriyoları bir bölünme ortamına aktarın.
   NOT: Üçüncü güne kadar ideal bir embriyo, altı veya daha fazla eşit büyüklükte blastomerden oluşmalı ve %10'a eşit veya daha az bir parçalanma oranı ^{sergilemelidir12}.
2. Blastosist kültürüne devam etme kararı, hastanın tercihlerine ve 3. günde elde edilen embriyoların miktarı ve kalitesi gibi özel koşullara bağlıdır. 3. gün embriyolarını blastosist ortamına aktarın ve 5. günde değerlendirin. Blastosistleri değerlendirmek için Gardner'ın puanlama sistemini kullanın, yüksek kaliteli blastosistler ≥ 4 BB¹³ puana sahiptir.

6. Sonuç ölçümleri ve istatistiksel analiz

1. Sürekli verileri ortalama ± standart sapma olarak raporlayın ve sıralı verileri oran olarak ifade edin. Uygun bir veri analizi yazılımında (burada, IBM SPSS Statistics) Student'ın t-testini veya ki-kare testini kullanarak istatistiksel analiz yapın. P < 0.05 anlamlılık düzeyini istatistiksel olarak anlamlı kabul edin.

Sonuçlar

Kısa süreli ko-inkübasyon prosedürleri uygulanan grupta, kurtarılan hastalar çalışma dışı bırakıldı. Kısa süreli inseminasyon yapılan 47 hastadan hastaların yaşı ve elde edilen oosit sayısı açısından anlamlı bir fark gözlenmedi (Tablo 1). OCCC'nin hemen kısmi olarak çıkarılması, oositlerin etrafında kalan OCCC'nin gevşemesine neden oldu (Şekil 3), bu da ikinci bir polar cismin saptanmasını kolaylaştırd?...

Tartışmalar

Granüloza hücrelerinin hemen kısmi olarak çıkarılması, kısa süreli döllenmenin erken parçalanma sürecini hızlandırabilir, hem kısa süreli döllenmede hem de konvansiyonel IVF'de ikinci polar cisim için gözlem süresini azaltabilir ve sonraki embriyo gelişimini tehlikeye atmaz. Şu anda, laboratuvarlar küresel olarak döllenme bozukluklarını ve düşük başarı oranlarını azaltmak için çeşitli stratejiler kullanmaktadır. Tercih edilen yöntem, kısa süreli d?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
G-IVFT PLUS	Vitrolife	10136
OVOIL	Vitrolife	10029
G-MOPS PLUS	Vitrolife	10130
Falcon 3003 dish	Corning	353003
Falcon 3001 dish	Corning	353001
Falcon 2001 tube	Corning	352001
Falcon 4013 cup	Corning	354013
Falcon 3037 dish	Corning	351058
Pasteur pipette	Darwin	D1150-5P