Die sofortige partielle Entfernung von Kumulus-Eizell-Komplexen: Ein verfeinerter Ansatz für die schnelle Beobachtung der In-vitro-Fertilisation

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine optimierte Methode zur sofortigen Entfernung eines Teils der Kumulus-Eizell-Komplexe nach der Eizellentnahme vor, um den IVF-Beobachtungsprozess zu beschleunigen, die für die Entnahme von Granulosazellen erforderliche Zeit zu reduzieren, die Exposition der Eizellen gegenüber externen Elementen zu minimieren und die Embryonenentwicklung nicht zu behindern, was letztendlich die Effizienz der IVF-Laborverfahren verbessert.

Zusammenfassung

Trotz der rasanten Fortschritte in der klinischen und Labortechnologie für die In-vitro-Fertilisation (IVF) leidet ein erheblicher Teil (10%-15%) der Patienten weiterhin unter Befruchtungsstörungen, die zu niedrigen Befruchtungsraten und der Produktion nicht lebensfähiger Embryonen führen. Die Kurzzeitbefruchtung beinhaltet die frühzeitige Entnahme von Granulosazellen, um die Extrusion des zweiten Polkörpers zu beobachten, was die Beurteilung der Befruchtung und frühzeitige Abhilfemaßnahmen ermöglicht, um niedrige Befruchtungsraten und ein vollständiges Befruchtungsversagen zu beheben. Die Beobachtung einer kurzfristigen Befruchtung bei der IVF wird jedoch durch Herausforderungen wie zu große unverarbeitete Cluster von Kumulus-Eizell-Komplexen und Adhäsionen zwischen den Eizellen behindert, die komplexe externe Verfahren zur Entfernung von Granulosazellen und eine verlängerte Beobachtungsdauer erforderlich machen. Um dieses Problem anzugehen, schlägt diese Studie eine Methode zur sofortigen teilweisen Entfernung von Granulosazellen nach der Eizellentnahme vor. Dieser Ansatz rationalisiert die nachfolgenden Phasen der Kurzzeitbefruchtung und der traditionellen Befruchtungsüberwachung, reduziert die für die Eizellextrusion benötigte Zeit, minimiert die Wahrscheinlichkeit externer Umwelteinflüsse auf die Eizellen und verringert das Risiko, das kritische Beobachtungsfenster für die Befruchtung zu verpassen. Folglich liefert die Studie neue klinische Evidenz, die darauf abzielt, die betriebliche Effizienz von embryonalen Laboratorien bei der IVF zu verbessern.

Einleitung

Im Bereich der In-vitro-Fertilisation-Embryotransfer (IVF-ET) liegt die typische Befruchtungsrate im Bereich von 60 % bis 80 %¹. In etwa 4 % bis 16 % der Fälle kommt es jedoch entweder zu einem vollständigen Befruchtungsversagen oder zu niedrigen Befruchtungsraten, was eine Herausforderung für die Vorhersage^{darstellt 2,3}. Um die klinischen Schwangerschaftsergebnisse zu verbessern und das Auftreten von vollständiger Nichtbefruchtung und geringer Befruchtung zu verringern, ist die Nutzung der Kurzzeitbefruchtung bei IVF-Verfahren auf dem Vormarsch⁴. Dieser Ansatz beinhaltet die sofortige Entnahme von Granulosazellen, um die Extrusion des zweiten Polkörpers zu überwachen, den Befruchtungsstatus zu beurteilen und möglicherweise eine intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) durchzuführen. Die Bindung zwischen dem Eizell-Kumuluszell-Komplex (OCCC) und der Eizelle ist bei der Kurzzeitbefruchtung stärker als bei der traditionellen Befruchtung über Nacht, wodurch die Herausforderung der OCCC-Entnahme erhöht^{wird 5}. Faktoren wie ein Überschuss an Eizellzahlen, große OCCC-Komplexe oder Adhäsionen zwischen den Eizellen können zu längeren Entnahmezeiten der Granulosazellen während der Kurzzeitbefruchtung führen, wodurch sich die Zeit, in der die Eizellen außerhalb des Inkubators verbleiben, verlängert⁴. Um den Beobachtungszeitraum der Befruchtung zu optimieren, wurde ein modifizierter Ansatz nach der Eizellentnahme entwickelt, der eine teilweise Exzision von Granulosazellen aus Eizellen mit signifikanten OCCC-Komplexen beinhaltet. Diese Technik hilft dabei, die Granulosazellen, die die Eizellen umgeben, zu erhalten, die Integrität der frühen Eizellstruktur^{zu bewahren 6} und es diesen Zellen zu ermöglichen, weiterhin lebenswichtige Faktoren für die Eizellreifung und die anschließende Befruchtung und Embryobindung zu liefern⁷.

Folglich konzentriert sich diese Studie auf Patienten, die sich als Forschungsteilnehmer einer IVF-ET-Behandlung in einem Zentrum für Reproduktionsmedizin unterziehen, mit dem Ziel, den Einfluss einer sofortigen mechanischen Exzisionsmethode mit Granulosazellen auf die Dauer von Eingriffen sowohl für die Kurzzeitbefruchtung als auch für die Überwachung der Befruchtung über Nacht zu untersuchen und gleichzeitig die Ergebnisse der normalen Befruchtung und der späten Entwicklung zu bewerten. Diese Forschung soll wertvolle Erkenntnisse zur Verbesserung der Laborverfahren bei Embryonen in der IVF liefern.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Standardarbeitsanweisungen der Abteilung für Reproduktionsmedizin am Volkskrankenhaus Meizhou durchgeführt und unterlagen der Überprüfung durch die Ethikkommission derselben Abteilung. Von jedem teilnehmenden Paar wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Die Studie umfasste Teilnehmerinnen, die sich ihrem ersten IVF-Zyklus mit Spaltung oder Embryotransfer im Blastozystenstadium unterzogen, sowie Frauen im Alter zwischen 20 und 45 Jahren. Zu den Ausschlusskriterien gehörten die Verwendung von gespendeten Eizellen/Spermien und spezifische Erkrankungen wie angeborene oder sekundäre Anomalien der Gebärmutter (z. B. septatus uterus, unicornuate uterus, uterine didelphys), Adenomyose, submuköse Myome der Gebärmutter oder eine Endometriumdicke unter 7 mm am Tag des Embryotransfers. Insgesamt 115 Patienten, die zwischen Dezember 2023 und Februar 2024 aufgenommen wurden, wurden in zwei Gruppen eingeteilt, je nachdem, ob eine sofortige teilweise Entfernung des OCCC durchgeführt wurde.

1. Vorbereitung vor der Eizellentnahme

1. Stellen Sie die Eizellaufnahmeschalen (Table of Materials) über Nacht bei 37 °C in den Inkubator.
2. 12 ml Follikelmanipulationsmedium (Materialtabelle) in 14 ml-Reagenzgläsern mit rundem Boden bei 37 °C über Nacht inkubieren. Übertragen Sie die Röhrchen 30 Minuten vor der Eizellentnahme in das vorgewärmte Reagenzglasgestell.
3. Bereiten Sie das Follikelmanipulationsmedium vor: Geben Sie 9 ml Follikelmanipulationsmedium in ein 14-ml-Reagenzglas mit rundem Boden (Materialtabelle) und inkubieren Sie es über Nacht bei 37 °C. Am Tag der Eizellentnahme werden 4,5 ml des Mediums in eine vorinkubierte Eizellaufnahmeschale (Materialtabelle) gegeben, die mit 2 ml 100%igem Paraffinöl bedeckt ist.
4. Bereiten Sie die OCCC-Spüllösung vor: Geben Sie 4,5 ml Befruchtungsmedium (Materialtabelle) in eine Eizellaufnahmeschale und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
5. Bereiten Sie das Düngemedium vor: Geben Sie 1 ml Düngemedium in eine 6 cm große Schale, die mit 100 % Paraffinöl bedeckt ist (Tabelle der Materialien) und inkubieren Sie es über Nacht bei 37 °C.
6. Pasteur-Pipetten aus Glas vorbereiten (Materialtabelle): Die Spitzen vorsichtig abstumpfen und abrunden, indem Sie sie auf einer Alkohollampe ca. 5 s lang brennen lassen (Abbildung 1). Befestigen Sie einen Saugkopf an der Spitze der Pasteur-Pipetten und stellen Sie sicher, dass er den Boden der Schale berühren kann, ohne zu zerkratzen. Spülen Sie die Pasteurpipetten und die 10-cm-Schalen mit einem Follikelmanipulationsmedium aus.

2. Eizellentnahme und sofortige teilweise Entfernung von OCCC

HINWEIS: Verwenden Sie ein Stereomikroskop während der Eizellisolierung und der OCCC-Entfernung. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten alle Eingriffe auf einem Heiztisch mit Temperaturkontrolle (37 °C) durchgeführt werden, und alle Geräte sollten 30 Minuten vor der Eizellentnahme vorgeheizt werden.

1. Entnahme von präovulatorischer Follikelflüssigkeit während der Eizellentnahme gemäß den ESHRE-Empfehlungen⁸.
   1. Kurz gesagt, verwenden Sie eine 17-G-Nadel, um die Eizellen unter transvaginaler Ultraschallkontrolle zu entnehmen. Der entsprechende Unterdruck reicht von 120-140 mmHg.
   2. Gießen Sie die im 14-ml-Reagenzglas mit rundem Boden gesammelte Follikelflüssigkeit in eine 10-cm-Schale (Materialtabelle) und halten Sie dabei eine Flüssigkeitstiefe von weniger als 0,5 cm aufrecht. Stellen Sie das Gericht auf eine Plattform mit konstanter Temperatur (37 °C).
2. Beobachten Sie das OCCC unter einem Stereomikroskop, um das Vorhandensein von Eizellen zu bestätigen und ihre Reife zu beurteilen.
   HINWEIS: Die Reife des OOOC wird anhand der Morphologie der Kumuluszellen und der Sichtbarkeit bestimmter Eizellstrukturen beurteilt⁹.
3. Aspirieren Sie den OCCC mit einer Pasteur-Pipette mit stumpfem Ende. Kippen Sie die 10 cm Schale um ca. 15 Grad und breiten Sie alle großen OCCC aus. Vermeiden Sie es, die Eizelle und die umgebenden Granulosazellen in einem Radius von 2500 μm zu aspirieren. Schneiden Sie überschüssige Granulosazellen mit der Pasteur-Pipette entlang der Längsachse (Abbildung 2). Die detaillierten Schritte lauten wie folgt:
   1. Beobachten Sie mit bloßem Auge, ob sich in der Follikelflüssigkeit eine gräuliche, durchscheinende Schleimhautmasse befindet. Wenn sie nicht gefunden wird, suchen Sie schnell nach der gräulichen, durchscheinenden mukoiden Masse, indem Sie sie unter einem Stereomikroskop, dem OCCC, im Uhrzeigersinn von außen nach innen drehen.
   2. Bestätigen Sie, ob sich Eizellen im OCCC befinden, und nehmen Sie eine vorläufige Beurteilung der Eizellreife vor.
   3. Bereiten Sie dann eine Silikon-Aspirationspipette mit einer runden, flammpolierten Pasteurpipette vor, aspirieren Sie das OCCC und heben Sie gleichzeitig die Kulturschale vorsichtig in der 9-10-Uhr-Position an, wobei Sie den linken Ringfinger der Hand halten, der die 10-cm-Schale hält, und kippen Sie die Kulturschale leicht um etwa 15° nach links (wenn Sie den Ringfinger unter die Schale legen, entspricht dies ungefähr dem gewünschten Winkel).
   4. Während Sie das aspirierte OCCC an der 11-Uhr-Position der Schale ausspucken, dehnen Sie es vorsichtig horizontal nach rechts. Beobachten Sie dann die Größe der Granulosazellen um das expandierte OCCC. Anschließend führen Sie an der geeigneten Position des horizontal länglichen OCCC mit der Pasteur-Pipette einen schnellen und sanften absteigenden Schnitt auf die überschüssigen Granulosazellen von oben nach unten durch.
4. Den geschnittenen OCCC in eine Auffangschale mit OCCC-Spüllösung geben. Gießen Sie die restliche Follikelflüssigkeit in einen sterilen Probenbehälter (Materialtabelle). Wiederholen Sie diese Schritte, bis alle Komplexe gesammelt sind.

3. Samenaufbereitung und In-vitro-Besamung

1. Entnehmen Sie die Samenproben per Ejakulation am Morgen der Eizellentnahme. Bewerten Sie die Konzentration, Beweglichkeit und Morphologie der Spermien unter einem Lichtmikroskop gemäß den Kriterien der Weltgesundheitsorganisation (WHO, 2010)¹⁰. Füllen Sie dann das Samenpellet in ein neues Zentrifugenröhrchen und waschen Sie es zweimal in Befruchtungsmedium¹¹. Bis zur Verwendung bei 6 % CO_{2 und} 37 °C inkubieren.
2. Befruchten Sie OCCCs mit 1 x 10⁵ bis 3 x 10⁵ beweglichen Spermien pro Milliliter in einem einzigen Tröpfchen etwa 2-3 h nach der Entnahme in der Befruchtungsschale (Tabelle der Materialien). Geben Sie 6-8 OCCC und 1 ml des Düngemediums in die Düngeschale.
   HINWEIS: Nach dem Waschen der klebrigen OCCC werden sie mit einer Pasteur-Pipette in die Düngeschale übertragen. Lassen Sie jeweils einen OCCC los, heben Sie die Pipette vorsichtig von der Flüssigkeitsoberfläche ab, bevor Sie die nächste loslassen, und stellen Sie sicher, dass jeder OCCC einzeln in der Schale platziert wird, um eine Clusterbildung zu vermeiden.

4. Entfernung von Kumuluszellen

1. Für eine kurzfristige Befruchtung befolgen Sie die unten beschriebenen Schritte.
   1. Inkubieren Sie OCCCs mit Spermien für 4-6 Stunden. Nach der Inkubation werden die Kumuluszellen, die die Eizellen umgeben, mechanisch entfernt.
   2. Aspirieren Sie die Eizellen mit einer Pipette mit einem Innendurchmesser, der etwas kleiner ist als der der Eizellen, um eine vollständige Entfernung der Kumuluszellen zu gewährleisten.
   3. Bestätigen Sie die Befruchtung, indem Sie das Vorhandensein von zwei Polkörpern beobachten. Eizellen, die einen zweiten Polkörper aufweisen, gelten als befruchtet.
   4. Identifizieren Sie die Fälle, in denen der zweite Polkörper nicht als Befruchtungsfehler angezeigt wird, die eine Rettungs-ICSI erforderlich machen.
2. Für eine regelmäßige Befruchtung nach 18-20 Stunden Co-Inkubation die Kumuluszellen mit den Pipetten zur Befruchtungsbeurteilung entfernen.

5. Kultur des Embryos

1. Kultivieren und überwachen Sie die befruchteten Eizellen für 3-5 Tage nach der Eizellentnahme. Beurteilen Sie die Befruchtung 20 Stunden nach der Besamung, um die Anzahl der Vorkerne zu bestimmen. Anschließend kultivieren Sie jede Zygote einzeln in einem Mediumtröpfchen und übertragen die Embryonen nach der Befruchtung auf ein Spaltmedium.
   HINWEIS: Ein idealer Embryo sollte am dritten Tag aus sechs oder mehr gleich großen Blastoeren bestehen und eine Fragmentierungsrate von mindestens 10 % ^aufweisen12.
2. Die Entscheidung, mit der Blastozystenkultur fortzufahren, hängt von den Vorlieben der Patientin und den spezifischen Umständen ab, wie z. B. der Menge und Qualität der Embryonen, die am Tag 3 entnommen werden. Übertragen Sie die Embryonen am Tag 3 in das Blastozystenmedium und beurteilen Sie sie am Tag 5. Verwenden Sie das Gardner-Bewertungssystem, um Blastozysten zu bewerten, wobei hochwertige Blastozysten Werte von ≥ 4 BB¹³ aufweisen.

6. Ergebnismessungen und statistische Analysen

1. Geben Sie kontinuierliche Daten als Mittelwert ± Standardabweichung an, und drücken Sie ordinale Daten als Anteile aus. Führen Sie statistische Analysen mit dem Student's t-Test oder dem Chi-Quadrat-Test in einer geeigneten Datenanalysesoftware (hier IBM SPSS Statistics) durch. Betrachten Sie ein Signifikanzniveau von P < 0,05 als statistisch signifikant.

Ergebnisse

In der Gruppe, die sich kurzen Co-Inkubationsverfahren unterzog, wurden Patienten, die gerettet wurden, ausgeschlossen. Von 47 Patientinnen, die eine Kurzzeitinsemination erhielten, wurden keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf das Alter der Patientinnen und die Anzahl der entnommenen Eizellen beobachtet (Tabelle 1). Die sofortige partielle Entfernung von OCCC führte zu einer Lockerung des verbleibenden OCCC um die Eizellen (Abbildung 3

Diskussion

Die sofortige partielle Entnahme von Granulosazellen kann den frühen Zerfallsprozess der Kurzzeitbefruchtung beschleunigen, die Beobachtungszeit für den zweiten Polkörper sowohl bei der Kurzzeitbefruchtung als auch bei der konventionellen IVF verkürzen und die spätere Embryonalentwicklung nicht beeinträchtigen. Derzeit wenden Labore weltweit verschiedene Strategien an, um Befruchtungsstörungen und niedrige Erfolgsraten zu mildern. Die bevorzugte Methode besteht in der Entnahme von...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
G-IVFT PLUS	Vitrolife	10136
OVOIL	Vitrolife	10029
G-MOPS PLUS	Vitrolife	10130
Falcon 3003 dish	Corning	353003
Falcon 3001 dish	Corning	353001
Falcon 2001 tube	Corning	352001
Falcon 4013 cup	Corning	354013
Falcon 3037 dish	Corning	351058
Pasteur pipette	Darwin	D1150-5P