The Immediate Partial Removal of Cumulus-Oocyte Complexes: A Refined Approach for Rapid Observation of In Vitro Fertilization(적운-난모 세포 복합체의 즉각적인 부분 제거: 체외 수정의 신속한 관찰을 위한 정제된 접근 방식)

요약

여기에서는 난자 채취 후 적운-난모세포 복합체의 일부를 신속하게 제거하여 IVF 관찰 과정을 촉진하고, 과립층 세포 제거에 필요한 시간을 단축하고, 외부 요소에 대한 난모세포 노출을 최소화하고, 배아 발달을 방해하지 않으며, 궁극적으로 IVF 실험실 절차의 효율성을 향상시키는 최적화된 방법을 제시합니다.

초록

체외 수정(IVF)을 위한 임상 및 실험실 기술의 급속한 발전에도 불구하고 상당수(10%-15%)의 환자가 계속해서 수정 장애를 겪고 있으며, 이로 인해 수정률이 낮아지고 생존 불가능한 배아가 생성되고 있습니다. 단기 수정은 제2 극체의 압출을 관찰하기 위해 과립층 세포를 조기에 제거하는 것을 포함하며, 이를 통해 낮은 수정률과 완전한 수정 실패를 해결하기 위한 수정 평가 및 조기 개선 조치를 취할 수 있습니다. 그러나 IVF에서 단기 수정의 관찰은 과도하게 큰 처리되지 않은 적운-난모세포 복합체 클러스터 및 난자 간 접착, 과립층 세포 제거를 위한 복잡한 외부 절차 필요 및 장시간의 관찰 기간과 같은 문제로 인해 방해를 받습니다. 이 문제를 해결하기 위해 본 연구에서는 난자 채취 후 과립층 세포를 즉시 부분적으로 제거하는 방법을 제안합니다. 이 접근 방식은 단기 수정 및 기존 수정 모니터링의 후속 단계를 간소화하고, 난모세포 압출에 필요한 시간을 줄이고, 난모세포에 대한 외부 환경 영향의 가능성을 최소화하고, 중요한 수정 관찰 창을 놓칠 위험을 줄입니다. 결과적으로, 이 연구는 IVF에서 배아 실험실의 운영 효율성을 향상시키는 것을 목표로 하는 새로운 임상 증거를 산출합니다.

서문

체외 수정-배아 이식(IVF-ET) 분야에서 일반적인 수정률은 60%에서 80%¹ 사이입니다. 그러나 약 4%에서 16%의 사례가 완전 수정 실패 또는 낮은 수정률을 경험하여 예측 ^2,3에서 어려움을 겪고 있습니다. 임상적 임신 결과를 개선하고 완전 비수정 및 저수정의 발생을 줄이기 위해 체외수정(IVF) 시술에서 단기 수정의 활용이 증가하고 있다⁴. 이 접근법은 제2극체의 압출을 모니터링하고, 수정 상태를 평가하고, 잠재적으로 세포질 내 정자 주입(ICSI)을 수행하기 위해 과립층 세포를 즉시 제거하는 것을 수반합니다. 난모세포 적운세포 복합체(OCCC)와 난모세포 사이의 결합은 기존의 야간 수정에 비해 단기 수정 중에 더 강하기 때문에 OCCC 제거의 어려움이 증가합니다⁵. 과도한 난모세포 수, 큰 OCCC 복합체 또는 난모세포 간 유착과 같은 요인으로 인해 단기 수정 중 과립층 세포 제거 시간이 길어질 수 있으며, 이로 인해 난자가 인큐베이터 외부에 남아 있는 기간이 연장될 수 있습니다⁴. 수정 관찰 기간을 최적화하기 위해 상당한 OCCC 복합체를 가진 난모세포에서 과립층 세포를 부분적으로 절제하는 수정된 접근 방식이 고안되었습니다. 이 기술은 난모세포를 둘러싼 과립층 세포를 유지하고, 초기 난모세포 구조⁶의 무결성을 보존하며, 이러한 세포가 난모세포 성숙 및 후속 수정-배아 결합⁷에 중요한 요소를 계속 공급할 수 있도록 합니다.

따라서 본 연구는 생식의학센터에서 IVF-ET 치료를 받는 환자를 연구 참가자로 대상으로 하며, 단기 수정 및 야간 수정 모니터링 시 시술에 대한 즉각적인 부분 과립층 세포 기계적 절제법의 영향을 조사하는 동시에 정상 수정 및 후기 발달의 결과를 평가하는 것을 목표로 합니다. 이 연구는 IVF에서 배아 실험실 절차를 향상시키기 위한 귀중한 통찰력을 제공하고자 합니다.

프로토콜

모든 절차는 메이저우 인민병원 생식의학과의 표준 운영 절차에 따라 수행되었으며 같은 부서의 윤리 위원회의 검토를 받았습니다. 참여하는 각 부부로부터 서면 동의서를 받았습니다. 이 연구에는 20세에서 45세 사이의 여성뿐만 아니라 분열 또는 배반포 단계 배아 이식으로 첫 번째 IVF 주기를 받는 참가자가 포함되었습니다. 제외 기준에는 기증자 난자/정자의 사용 및 선천적 또는 이차적 자궁 기형(예: 자궁중격, 단각자궁, 자궁 이완증), 자궁선근증, 자궁 점막하 섬유종 또는 배아 이식 당일 자궁내막 두께가 7mm 미만인 것과 같은 특정 상태가 포함되었습니다. 2023년 12월부터 2024년 2월 사이에 등록된 총 115명의 환자를 대상으로 OCCC의 즉각적인 부분 제거 여부에 따라 두 그룹으로 계층화되었습니다.

1. 난모세포 채취 전 준비

1. 난모세포 픽업 접시(Table of Materials)를 37°C의 인큐베이터에 밤새 놓습니다.
2. 12mL의 여포 조작 배지(Table of Materials)를 14mL 둥근 바닥 시험관에 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 난모세포 채취 30분 전에 튜브를 예열된 시험관 랙으로 옮깁니다.
3. 여포 조작 배지 준비: 14mL 둥근 바닥 시험관(재료 표)에 9mL의 여포 조작 배지를 추가하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 난모세포 채취 당일, 배지 4.5mL를 100% 파라핀 오일 2mL로 덮인 사전 배양된 난모세포 픽업 접시(Table of Materials)로 옮깁니다.
4. OCCC 플러싱 용액 준비: 난모세포 픽업 접시에 4.5mL의 수정 배지(Table of Materials)를 추가하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
5. 수정 배지 준비: 100% 파라핀 오일로 덮인 6cm 접시(재료 표)에 1mL의 수정 배지를 추가하고 37°C에서 밤새 배양합니다.
6. 유리 파스퇴르 피펫 준비(재료 표): 팁을 알코올 램프에서 약 5초 동안 태워 팁을 부드럽게 무디게 하고 둥글게 만듭니다(그림 1). 파스퇴르 피펫 끝에 흡입 헤드를 부착하여 긁힘 없이 접시 바닥에 닿을 수 있도록 합니다. 유리 파스퇴르 피펫과 10cm 접시를 난포 조작 매체로 헹굽니다.

2. 난모세포 채취 및 OCCC의 즉각적인 부분 제거

알림: 난모세포 분리 및 OCCC 제거 절차 중에 실체현미경을 사용하십시오. 최적의 결과를 얻으려면 모든 절차는 온도 제어(37°C)가 가능한 가열 테이블에서 수행해야 하며 모든 장비는 난모세포 채취 30분 전에 예열되어야 합니다.

1. ESHRE 권고에 따라 난모세포 채취 중 배란 전 여포액을 수집한다⁸.
   1. 간단히 17G 바늘을 사용하여 경질 초음파 안내에 따라 난모세포를 채취합니다. 적절한 음압 범위는 120-140mmHg입니다.
   2. 14mL 둥근 바닥 시험관에 모인 여포액을 유체 깊이를 0.5cm 미만으로 유지하면서 10cm 접시(재료 표)에 붓습니다. 접시를 일정한 온도 플랫폼(37°C)에 놓습니다.
2. 실체현미경으로 OCCC를 관찰하여 난모세포의 존재를 확인하고 성숙도를 평가합니다.
   참고: OOOC의 성숙도는 적운 세포의 형태와 특정 난모세포 구조의 가시성에 기초하여 평가됩니다⁹.
3. 끝이 뭉툭한 파스퇴르 피펫을 사용하여 OCCC를 흡인합니다. 10cm 접시를 약 15도 기울이고 큰 OCCC를 모두 펼칩니다. 반경 2500μm 이내의 난모세포와 주변 과립층 세포를 흡인하지 마십시오. 파스퇴르 피펫으로 세로축을 따라 과도한 과립층 세포를 절단합니다(그림 2). 자세한 단계는 다음과 같습니다.
   1. 여포액에 회색을 띤 반투명 점액 덩어리가 있는지 육안으로 관찰합니다. 발견되지 않으면 실체 현미경인 OCCC에서 외부에서 내부로 시계 방향으로 회전하여 회색을 띤 반투명 점액 덩어리를 빠르게 검색합니다.
   2. OCCC에 난모세포가 있는지 확인하고 난모세포 성숙도에 대한 예비 평가를 수행합니다.
   3. 그런 다음 원형 화염 광택 파스퇴르 피펫으로 실리콘 흡인 피펫을 미리 준비하고 OCCC를 흡인하는 동시에 9cm 접시를 잡은 손의 왼쪽 약지로 9-10시 위치에서 배양 접시를 부드럽게 올리고 배양 접시를 왼쪽으로 약 15° 약간 기울입니다(접시 아래에 약지를 놓는 것이 대략 필요한 각도입니다).
   4. 접시의 11시 위치에서 흡인된 OCCC를 뱉어내면서 오른쪽으로 수평으로 부드럽게 늘립니다. 그런 다음 확장된 OCCC 주변의 과립층 세포의 크기를 관찰합니다. 그 후, 수평으로 길쭉한 OCCC의 적절한 위치에서 파스퇴르 피펫을 사용하여 과도한 과립층 세포를 위에서 아래로 빠르고 부드럽게 하강합니다.
4. 자른 OCCC를 OCCC 세척 용액이 들어 있는 수집 접시에 옮깁니다. 남은 여포액을 멸균 샘플 용기에 붓습니다(재료 표). 모든 복합체가 수집될 때까지 이 단계를 반복합니다.

3. 정액 준비 및 체외 수정

1. 난모세포 채취 당일 아침에 사정을 통해 정액 샘플을 수집합니다. 세계보건기구(WHO, 2010) 기준¹⁰에 따라 광학 현미경으로 정자 농도, 운동성 및 형태를 평가합니다. 그런 다음 정자 펠릿을 새 원심분리기 튜브로 옮기고 수정 배지¹¹에서 두 번 세척합니다. 필요할 때까지 6% CO₂ 및 37 °C에서 배양합니다.
2. 수정 접시에서 회수한 후 약 2-3시간 후에 단일 방울에 1 x 10⁵ to 3 x 10⁵ motile spermatozoa를 1 x 10 5 x 10 5 motile spermatozoa로 수정하십시오(재료 표). 6-8 OCCC와 1mL의 시비 배지를 시비 접시에 추가합니다.
   참고 : 끈적 끈적한 OCCC를 세척 한 후 파스퇴르 피펫을 사용하여 수정 접시로 옮깁니다. 한 번에 하나의 OCCC를 해제하고, 다음 OCCC를 해제하기 전에 액체 표면에서 피펫을 부드럽게 들어 올리고, 각 OCCC가 뭉침을 방지하기 위해 접시에 개별적으로 배치되도록 합니다.

4. 적란 세포 제거

1. 단기 비료를 위해서는 아래에 설명된 단계를 따르십시오.
   1. OCCC를 정자와 함께 4-6시간 동안 함께 배양합니다. 배양 후, 난모세포를 둘러싼 적운 세포를 기계적으로 제거합니다.
   2. 난모세포보다 약간 작은 내경을 가진 피펫을 사용하여 난모세포를 흡인하여 적운 세포를 완전히 제거합니다.
   3. 두 개의 극체의 존재를 관찰하여 수정을 확인하십시오. 두 번째 극체를 보여주는 난모세포는 수정된 것으로 간주됩니다.
   4. 제2의 극체가 수정 실패로 나타나지 않는 경우를 식별하여 구조 ICSI가 필요합니다.
2. 정기적인 수정을 위해 공동 배양 18-20시간 후 수정 평가를 위해 피펫을 사용하여 적운 세포를 제거합니다.

5. 배아 배양

1. 난모세포 채취 후 3-5일 동안 수정된 난모세포를 배양하고 모니터링합니다. 전핵의 수를 결정하기 위해 수정 후 20시간에 수정을 평가합니다. 그 후, 각 접합자를 배지 액적에서 개별적으로 배양하고 수정 후 배아를 절단 배지로 옮깁니다.
   참고: 3일째까지 이상적인 배아는 6개 이상의 동일한 크기의 할구로 구성되어야 하며 10% 이하의 단편화 속도를 보여야 합니다¹².
2. 배반포 배양을 진행하기로 한 결정은 환자의 선호도와 3일차에 얻은 배아의 양과 질과 같은 특정 상황에 따라 달라집니다. 3일차 배아를 배반포 배지로 이식하고 5일차에 평가합니다. Gardner의 채점 시스템을 사용하여 배반포를 평가하며, 고품질 배반포는 ≥ 4 BB¹³의 점수를 갖습니다.

6. 결과 측정 및 통계 분석

1. 연속형 데이터를 표준 편차± 평균으로 보고하고 순서형 데이터를 비율로 표현합니다. 적절한 데이터 분석 소프트웨어(여기서는 IBM SPSS Statistics)에서 스튜던트 t-검정 또는 카이 제곱 검정을 사용하여 통계 분석을 수행합니다. P < 0.05의 유의 수준을 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.

결과

짧은 공동 배양 절차를 받은 그룹에서 구조를 받은 환자는 제외되었습니다. 단기 수정을 받은 47명의 환자 중 환자의 연령과 채취된 난모세포의 수 측면에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았다(표 1). OCCC를 즉시 부분적으로 제거하면 난모세포 주변에 남아 있는 OCCC가 느슨해져서(그림 3) 두 번째 극체를 쉽게 감지할 수 있었습니다. 분열률...

토론

과립층 세포의 즉각적인 부분 제거는 단기 수정의 조기 분해 과정을 가속화할 수 있고, 단기 수정과 기존 IVF 모두에서 두 번째 극체의 관찰 시간을 단축할 수 있으며, 후속 배아 발달을 손상시키지 않을 수 있습니다. 현재 전 세계적으로 실험실은 수정 장애와 낮은 성공률을 완화하기 위해 다양한 전략을 채택하고 있습니다. 바람직한 방법은 단기 수정 후 4-6시간 후에 제2 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
G-IVFT PLUS	Vitrolife	10136
OVOIL	Vitrolife	10029
G-MOPS PLUS	Vitrolife	10130
Falcon 3003 dish	Corning	353003
Falcon 3001 dish	Corning	353001
Falcon 2001 tube	Corning	352001
Falcon 4013 cup	Corning	354013
Falcon 3037 dish	Corning	351058
Pasteur pipette	Darwin	D1150-5P