Немедленное частичное удаление кумулюс-ооцитарных комплексов: усовершенствованный подход к быстрому наблюдению за экстракорпоральным оплодотворением

Резюме

В данной работе мы представляем оптимизированный метод оперативного удаления порции кумулус-ооцитарных комплексов после забора яйцеклетки, чтобы ускорить процесс наблюдения за ЭКО, сократить время, необходимое для удаления гранулезных клеток, свести к минимуму воздействие на ооциты внешних элементов и не препятствовать развитию эмбриона, что в конечном итоге повышает эффективность лабораторных процедур ЭКО.

Аннотация

Несмотря на стремительное развитие клинических и лабораторных технологий экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), значительная часть (10-15%) пациенток продолжает испытывать нарушения оплодотворения, что приводит к низким показателям оплодотворения и производству нежизнеспособных эмбрионов. Краткосрочное оплодотворение включает в себя раннее удаление гранулезных клеток для наблюдения за экструзией второго полярного тела, что позволяет оценить оплодотворение и принять ранние корректирующие меры для решения проблемы низкой интенсивности оплодотворения и полной неудачи оплодотворения. Тем не менее, наблюдение за краткосрочным оплодотворением при ЭКО затруднено такими проблемами, как чрезмерно большие необработанные кластеры кумулюс-ооцитарных комплексов и адгезия между яйцеклетками, что требует сложных внешних процедур для удаления гранулезных клеток, а также длительная продолжительность наблюдения. Чтобы решить эту проблему, в данном исследовании предлагается метод немедленного частичного удаления гранулезных клеток после извлечения яйцеклеток. Такой подход оптимизирует последующие этапы краткосрочного оплодотворения и мониторинга традиционного оплодотворения, сокращает время, необходимое для экструзии ооцитов, минимизирует вероятность воздействия внешней среды на ооциты и снижает риск пропуска критического окна наблюдения за оплодотворением. Следовательно, исследование дает новые клинические данные, направленные на повышение операционной эффективности эмбриональных лабораторий при ЭКО.

Введение

В области экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКО-ЭТ) типичный уровень оплодотворения находится в диапазоне от 60% до 80%¹. Тем не менее, примерно от 4% до 16% случаев сталкиваются либо с полным неудачным оплодотворением, либо с низким уровнем оплодотворения, что создает проблемы для прогнозирования ^2,3. Для улучшения клинических исходов беременности и снижения частоты полного и низкого оплодотворения использование краткосрочного оплодотворения в процедурах ЭКО находится на подъеме⁴. Этот подход влечет за собой оперативное удаление гранулезных клеток для мониторинга экструзии второго полярного тельца, оценки статуса оплодотворения и, возможно, проведения лечебной интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ). Связь между комплексом кучевых клеток ооцита (OCCC) и ооцитом сильнее во время краткосрочного оплодотворения по сравнению с традиционным ночным оплодотворением, что увеличивает сложность удаления OCCC⁵. Такие факторы, как избыток количества ооцитов, большие комплексы OCCC или межооцитарные спайки, могут привести к увеличению времени удаления гранулезных клеток во время кратковременного оплодотворения, тем самым продлевая период, в течение которого яйцеклетки остаются вне инкубатора⁴. Для оптимизации периода наблюдения за оплодотворением разработан модифицированный подход к забору яйцеклеток после яйцеклетки, предполагающий частичное иссечение гранулезных клеток из ооцитов со значительными комплексами OCCC. Этот метод помогает сохранить гранулезные клетки, окружающие ооциты, сохраняя целостность ранней структуры ооцитов⁶ и позволяя этим клеткам продолжать поставлять жизненно важные факторы для созревания ооцитов и последующего связывания эмбрионов при оплодотворении⁷.

Следовательно, данное исследование сосредоточено на пациентах, проходящих лечение ЭКО-ЭТ в центре репродуктивной медицины в качестве участников исследования, целью которого является изучение влияния метода механического иссечения клеток частичной гранулезы на продолжительность процедур как краткосрочного оплодотворения, так и мониторинга ночного оплодотворения, а также оценки результатов нормального оплодотворения и поздней стадии развития. Это исследование призвано дать ценную информацию для улучшения лабораторных процедур эмбрионов при ЭКО.

протокол

Все процедуры проводились в соответствии со стандартными операционными процедурами отделения репродуктивной медицины Народной больницы Мэйчжоу и подлежали рассмотрению Комитетом по этике того же отделения. Письменное информированное согласие было получено от каждой участвующей пары. В исследование были включены участники, прошедшие первый цикл ЭКО с переносом эмбрионов на стадии расщепления или бластоцисты, а также женщины в возрасте от 20 до 45 лет. Критерии исключения включали использование донорских яйцеклеток/сперматозоидов и специфические состояния, такие как врожденные или вторичные аномалии матки (например, перегородка матки, однорогая матка, дидельфис матки), аденомиоз, подслизистая миома матки или толщина эндометрия менее 7 мм в день переноса эмбрионов. В общей сложности 115 пациентов, зарегистрированных в период с декабря 2023 года по февраль 2024 года, были стратифицированы на две группы в зависимости от того, было ли выполнено немедленное частичное удаление OCCC.

1. Подготовка перед забором ооцитов

1. Поместите чашки для сбора ооцитов (Table of Materials) в инкубатор при температуре 37 °C на ночь.
2. Инкубируйте 12 мл среды для манипуляций с фолликулами (Таблица материалов) в 14 мл пробирок с круглым дном при температуре 37 °C в течение ночи. Перенесите пробирки на предварительно разогретую штатив для пробирок за 30 минут до забора ооцитов.
3. Подготовьте среду для работы с фолликулами: добавьте 9 мл среды для манипуляций с фолликулами в пробирку с круглым дном объемом 14 мл (Таблица материалов) и инкубируйте при 37 °C в течение ночи. В день забора ооцитов перенесите 4,5 мл среды в предварительно инкубированную чашку для сбора ооцитов (Table of Materials), покрытую 2 мл 100% парафинового масла.
4. Приготовьте промывочный раствор OCCC: добавьте 4,5 мл среды для удобрения (Таблица материалов) в чашку для сбора ооцитов и инкубируйте при 37 °C в течение ночи.
5. Приготовьте среду для удобрения: Добавьте 1 мл среды для удобрения в посуду диаметром 6 см, покрытую 100% парафиновым маслом (Таблица материалов) и выдерживайте при температуре 37 °C в течение ночи.
6. Подготовьте стеклянные пипетки Пастера (Таблица материалов): Аккуратно затупите и закруглите кончики, обжигая их на спиртовой лампе в течение примерно 5 секунд (Рисунок 1). Прикрепите всасывающую головку к кончику пипеток Пастера, следя за тем, чтобы она могла касаться дна посуды, не царапая. Ополосните стеклянные пипетки Пастера и 10 см посуду средством для манипуляций с фолликулами.

2. Забор ооцитов и немедленное частичное удаление OCCC

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стереомикроскоп во время процедур выделения ооцитов и удаления OCCC. Для достижения оптимальных результатов все процедуры следует проводить на нагревательном столе с контролем температуры (37 °C), а все оборудование должно быть предварительно разогрето за 30 минут до забора ооцитов.

1. Соберите преовуляторную фолликулярную жидкость во время забора ооцитов в соответствии с рекомендациями ESHRE⁸.
   1. Вкратце, используйте иглу 17 G для извлечения ооцитов под трансвагинальным ультразвуковым контролем. Соответствующее отрицательное давление колеблется в пределах 120-140 мм рт.ст.
   2. Налейте фолликулярную жидкость, собранную в пробирке с круглым дном объемом 14 мл, в чашку диаметром 10 см (Таблица материалов), поддерживая глубину жидкости менее 0,5 см. Поставьте блюдо на платформу с постоянной температурой (37 °C).
2. Наблюдайте за OCCC под стереомикроскопом, чтобы подтвердить наличие ооцитов и оценить их зрелость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Зрелость ОООС оценивается на основе морфологии кучевых клеток и видимости определенных структур ооцитов⁹.
3. Аспирируйте OCCC с помощью пипетки Пастера с тупым концом. Наклоняем посуду на 10 см примерно на 15 градусов и разкладываем все крупные OCCC. Избегайте аспирации ооцита и окружающих гранулезных клеток в радиусе 2500 мкм. Разрежьте лишние гранулезные клетки с помощью пастеровской пипетки вдоль продольной оси (рисунок 2). Подробные шаги следующие:
   1. Наблюдайте невооруженным глазом, чтобы увидеть, есть ли в фолликулярной жидкости сероватая полупрозрачная мукоидная масса. Если не найдено, быстро отыщите сероватую полупрозрачную слизистую массу, вращая по часовой стрелке снаружи внутрь под стереомикроскопом OCCC.
   2. Подтвердите наличие ооцитов в OCCC и проведите предварительную оценку зрелости ооцитов.
   3. Затем предварительно приготовьте силиконовую аспирационную пипетку с круглой отполированной пламенем пипеткой Пастера, аспирируйте OCCC и одновременно аккуратно поднимите чашку для культуры в положении 9-10 часов левым безымянным пальцем руки, держащей чашку длиной 10 см, слегка наклонив чашку для культуры примерно на 15° влево (размещение безымянного пальца под чашкой примерно на необходимый угол).
   4. Выплевывая аспирированный OCCC в положении «11 часов» блюда, слегка удлините его горизонтально вправо. Затем наблюдайте за размером гранулезных клеток вокруг расширенного OCCC. Впоследствии, в подходящем положении горизонтально вытянутого OCCC, с помощью пастеровской пипетки сделайте быстрый и аккуратный нисходящий разрез на избыточных гранулезных клетках сверху вниз.
4. Переложите нарезанный OCCC в сборную чашку с промывочным раствором OCCC. Перелейте оставшуюся фолликулярную жидкость в стерильную емкость для образца (Таблица материалов). Повторяйте эти действия до тех пор, пока не соберутся все комплексы.

3. Подготовка спермы и экстракорпоральная инсеминация

1. Соберите образцы спермы с помощью эякуляции утром в день забора ооцитов. Оцените концентрацию, подвижность и морфологию сперматозоидов под световым микроскопом в соответствии с критериями Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ, 2010)¹⁰. Затем переложите сперматозоидную гранулу в новую центрифужную пробирку и дважды промойте ее в удобряющей среде¹¹. Инкубируйте их при 6%_CO2 и 37 °C до тех пор, пока это не понадобится.
2. Осемените OCCC 1 x 10⁵ до 3 x 10⁵ подвижных сперматозоидов на миллилитр в одной капле примерно через 2-3 часа после извлечения в чашке для оплодотворения (Таблица материалов). Добавьте в чашку для удобрения 6-8 OCCC и 1 мл среды для удобрения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После промывки липких OCCC они переносятся в чашку для удобрения с помощью пипетки Пастера. Выпускайте по одному OCCC за раз, осторожно отрывая пипетку от поверхности жидкости, прежде чем выпустить следующий, следя за тем, чтобы каждый OCCC был размещен в чашке по отдельности, чтобы предотвратить скопление.

4. Удаление кумулюсных клеток

1. Для кратковременного внесения удобрений выполните описанные ниже действия.
   1. Коинкубируйте OCCC со сперматозоидами в течение 4-6 ч. После инкубации механически удалите кумулюсные клетки, окружающие ооциты.
   2. Аспирируйте ооциты с помощью пипетки с внутренним диаметром немного меньше ооцитов, чтобы обеспечить полное удаление кучевых клеток.
   3. Подтвердите оплодотворение, наблюдая за наличием двух полярных тел. Ооциты, показывающие второе полярное тельце, считаются оплодотворенными.
   4. Определите те случаи, которые не показывают второе полярное тельце, как неудачи в оплодотворении, требующие спасательного ИКСИ.
2. Для регулярного оплодотворения, после 18-20 ч совместной инкубации, удалите кумулюсные клетки с помощью пипеток для оценки оплодотворения.

5. Культивирование эмбрионов

1. Культивируют и контролируют оплодотворенные ооциты в течение 3-5 дней после забора ооцитов. Оценивайте оплодотворение через 20 ч после осеменения для определения количества пронуклеусов. Затем культивируют каждую зиготу по отдельности в средней капле и переносят эмбрионы после оплодотворения в среду для расщепления.
   Примечание: Идеальный эмбрион к третьему дню должен состоять из шести или более бластомеров одинакового размера и демонстрировать скорость фрагментации, не превышающую или равную 10%¹².
2. Решение о проведении бактериологического исследования бластоцисты зависит от предпочтений пациента и конкретных обстоятельств, таких как количество и качество эмбрионов, полученных на 3-й день. Перенесите эмбрионы 3-го дня в среду бластоцисты и оцените на 5-й день. Используйте систему оценки Гарднера для оценки бластоцист, при этом высококачественные бластоцисты имеют оценку ≥ 4 BB¹³.

6. Измерение результатов и статистический анализ

1. Непрерывные данные представляют в виде среднего значения ± стандартного отклонения, а порядковые данные — в виде пропорций. Выполните статистический анализ с помощью t-критерия Стьюдента или критерия хи-квадрат в соответствующем программном обеспечении для анализа данных (в данном случае IBM SPSS Statistics). Считать статистически значимым уровень значимости P < 0,05.

Результаты

В группе, проходящей короткие процедуры коинкубации, пациенты, получившие помощь, были исключены. Из 47 пациенток, получавших краткосрочную инсеминацию, не наблюдалось существенных различий по возрасту пациенток и количеству извлеченных ооцитов (табл. 1). Нем?...

Обсуждение

Немедленное частичное удаление гранулезных клеток может ускорить процесс раннего распада при краткосрочном оплодотворении, сократить время наблюдения за вторым полярным тельцем как при краткосрочном оплодотворении, так и при обычном ЭКО и не поставить под угрозу п...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
G-IVFT PLUS	Vitrolife	10136
OVOIL	Vitrolife	10029
G-MOPS PLUS	Vitrolife	10130
Falcon 3003 dish	Corning	353003
Falcon 3001 dish	Corning	353001
Falcon 2001 tube	Corning	352001
Falcon 4013 cup	Corning	354013
Falcon 3037 dish	Corning	351058
Pasteur pipette	Darwin	D1150-5P