La rimozione parziale immediata dei complessi cumuli-ovociti: un approccio raffinato per l'osservazione rapida della fecondazione in vitro

Riepilogo

Qui, presentiamo un metodo ottimizzato per rimuovere prontamente una parte dei complessi cumulo-ovocita dopo il prelievo degli ovuli per accelerare il processo di osservazione della fecondazione in vitro, riducendo il tempo necessario per la rimozione delle cellule della granulosa, riducendo al minimo l'esposizione degli ovociti agli elementi esterni e non ostacolando lo sviluppo dell'embrione, migliorando in definitiva l'efficienza delle procedure di laboratorio della fecondazione in vitro.

Abstract

Nonostante i rapidi progressi nelle tecnologie cliniche e di laboratorio per la fecondazione in vitro (IVF), una percentuale significativa (10%-15%) dei pazienti continua a soffrire di disturbi della fecondazione, portando a bassi tassi di fecondazione e alla produzione di embrioni non vitali. La fecondazione a breve termine comporta la rimozione precoce delle cellule della granulosa per osservare l'estrusione del secondo globulo polare, consentendo la valutazione della fecondazione e le misure correttive precoci per affrontare i bassi tassi di fecondazione e il completo fallimento della fecondazione. Tuttavia, l'osservazione della fecondazione a breve termine nella fecondazione in vitro è ostacolata da sfide come gruppi eccessivamente grandi non elaborati di complessi cumulo-ovociti e adesione tra gli ovuli, che richiedono complesse procedure esterne per la rimozione delle cellule della granulosa e una durata prolungata dell'osservazione. Per affrontare questo problema, questo studio propone un metodo di rimozione parziale immediata delle cellule della granulosa dopo il prelievo degli ovociti. Questo approccio semplifica le fasi successive della fecondazione a breve termine e del monitoraggio tradizionale della fertilizzazione, riduce il tempo necessario per l'estrusione degli ovociti, minimizza la probabilità di impatti ambientali esterni sugli ovociti e diminuisce il rischio di perdere la finestra critica di osservazione della fecondazione. Di conseguenza, lo studio produce nuove prove cliniche volte a migliorare l'efficienza operativa dei laboratori embrionali nella fecondazione in vitro.

Introduzione

Nel campo della fecondazione in vitro-trasferimento di embrioni (FIV-ET), il tasso di fecondazione tipico è compreso tra il 60% e l'80%¹. Tuttavia, circa il 4-16% dei casi incontra un fallimento completo della fecondazione o bassi tassi di fecondazione, presentando sfide nella previsione ^2,3. Per migliorare i risultati clinici della gravidanza e ridurre i casi di completa non fecondazione e bassa fecondazione, l'utilizzo della fecondazione a breve termine nelle procedure di fecondazione in vitro è in aumento⁴. Questo approccio comporta la rimozione tempestiva delle cellule della granulosa per monitorare l'estrusione del secondo globulo polare, valutare lo stato di fecondazione e potenzialmente condurre un'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI). Il legame tra il complesso cellulare del cumulo dell'ovocita (OCCC) e l'ovocita è più forte durante la fecondazione a breve termine rispetto alla tradizionale fecondazione notturna, aumentando così la sfida della rimozione dell'OCCC⁵. Fattori come un eccesso di numero di ovociti, grandi complessi OCCC o aderenze interocitarie possono portare a tempi prolungati di rimozione delle cellule della granulosa durante la fecondazione a breve termine, prolungando così il periodo in cui gli ovuli rimangono fuori dall'incubatrice⁴. Per ottimizzare il periodo di osservazione della fecondazione, è stato ideato un approccio modificato post-prelievo degli ovociti, che prevede l'escissione parziale di cellule della granulosa da ovociti con complessi OCCC significativi. Questa tecnica aiuta a trattenere le cellule della granulosa che circondano gli ovociti, preservando l'integrità della struttura precoce dell'ovocita⁶ e consentendo a queste cellule di continuare a fornire fattori vitali per la maturazione dell'ovocita e il successivo legame tra fecondazione ed embrione⁷.

Di conseguenza, questo studio si concentra su pazienti sottoposti a trattamento di fecondazione in vitro-ET presso un centro di medicina riproduttiva come partecipanti alla ricerca, con l'obiettivo di indagare l'impatto di un metodo di escissione meccanica immediata parziale delle cellule della granulosa sulla durata delle procedure sia per la fecondazione a breve termine che per il monitoraggio notturno della fecondazione, valutando anche i risultati della normale fecondazione e dello sviluppo in fase avanzata. Questa ricerca intende offrire preziose informazioni per migliorare le procedure di laboratorio embrionale nella fecondazione in vitro.

Protocollo

Tutte le procedure sono state condotte in conformità con le procedure operative standard del Dipartimento di Medicina Riproduttiva dell'Ospedale del Popolo di Meizhou e sono state soggette a revisione da parte del Comitato Etico dello stesso dipartimento. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ciascuna coppia partecipante. Lo studio ha incluso partecipanti sottoposti al loro primo ciclo di fecondazione in vitro con trasferimento di embrioni allo stadio di scissione o blastocisti, nonché donne di età compresa tra 20 e 45 anni. I criteri di esclusione includevano l'uso di ovuli/spermatozoi di donatori e condizioni specifiche come anomalie uterine congenite o secondarie (ad esempio, utero setto, utero unicorno, didelfia uterina), adenomiosi, fibromi sottomucosi uterini o spessore dell'endometrio inferiore a 7 mm il giorno del trasferimento dell'embrione. Un totale di 115 pazienti arruolati tra dicembre 2023 e febbraio 2024 sono stati stratificati in due gruppi in base all'esecuzione o meno immediata della rimozione parziale dell'OCCC.

1. Preparazione prima del prelievo degli ovociti

1. Posizionare le piastre di prelievo degli ovociti (Tabella dei materiali) nell'incubatore a 37 °C per una notte.
2. Incubare 12 mL di terreno di manipolazione dei follicoli (Tabella dei materiali) in provette da 14 mL a fondo tondo a 37 °C per una notte. Trasferire le provette nel rack per provette preriscaldato 30 minuti prima del prelievo degli ovociti.
3. Preparare il terreno di manipolazione dei follicoli: aggiungere 9 mL di terreno di manipolazione dei follicoli a una provetta da 14 mL a fondo tondo (Tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per una notte. Il giorno del prelievo degli ovociti, trasferire 4,5 ml di terreno in una piastra di prelievo degli ovociti preincubata (Tabella dei materiali) ricoperta con 2 ml di olio di paraffina al 100%.
4. Preparare la soluzione di lavaggio OCCC: aggiungere 4,5 ml di terreno di fertilizzazione (Tabella dei materiali) a una piastra di raccolta degli ovociti e incubare a 37 °C per una notte.
5. Preparare il terreno di fertilizzazione: aggiungere 1 mL di terreno di fertilizzazione in un piatto di 6 cm ricoperto di olio di paraffina al 100% (Tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per una notte.
6. Preparare le pipette Pasteur in vetro (Tabella dei materiali): Smussare delicatamente e arrotondare le punte bruciandole su una lampada ad alcool per circa 5 s (Figura 1). Collegare una testa di aspirazione alla punta delle pipette Pasteur, assicurandosi che possa toccare il fondo del piatto senza graffiare. Sciacquare le pipette di vetro Pasteur e le piastre da 10 cm con un mezzo di manipolazione dei follicoli.

2. Prelievo di ovociti e rimozione parziale immediata dell'OCCC

NOTA: Utilizzare uno stereomicroscopio durante le procedure di isolamento degli ovociti e di rimozione OCCC. Per ottenere risultati ottimali, tutte le procedure devono essere eseguite su un tavolo riscaldante con controllo della temperatura (37 °C) e tutte le apparecchiature devono essere preriscaldate 30 minuti prima del prelievo degli ovociti.

1. Raccogliere il liquido follicolare preovulatorio durante il prelievo degli ovociti secondo le raccomandazioni ESHRE⁸.
   1. In breve, utilizzare un ago da 17 G per recuperare gli ovociti sotto guida ecografica transvaginale. La pressione negativa appropriata varia da 120 a 140 mmHg.
   2. Versare il liquido follicolare raccolto nella provetta a fondo tondo da 14 ml in un piatto da 10 cm (Tabella dei materiali), mantenendo una profondità del fluido inferiore a 0,5 cm. Posizionare la pirofila su una piattaforma a temperatura costante (37 °C).
2. Osservare l'OCCC al microscopio stereoscopico per confermare la presenza di ovociti e valutarne la maturità.
   NOTA: La maturità dell'OOOC viene valutata in base alla morfologia delle cellule del cumulo e alla visibilità di alcune strutture ovocitarie⁹.
3. Aspirare l'OCCC utilizzando una pipetta Pasteur con estremità smussata. Inclinare il piatto da 10 cm di circa 15 gradi e stendere tutto l'OCCC grande. Evitare di aspirare l'ovocita e le cellule della granulosa circostanti entro un raggio di 2500 μm. Tagliare le cellule della granulosa in eccesso con la pipetta Pasteur lungo l'asse longitudinale (Figura 2). I passaggi dettagliati sono i seguenti:
   1. Osservare ad occhio nudo per vedere se c'è una massa mucoide traslucida grigiastra nel liquido follicolare. Se non viene trovato, cerca rapidamente la massa mucoide traslucida grigiastra ruotando in senso orario dall'esterno verso l'interno sotto uno stereomicroscopio, l'OCCC.
   2. Confermare la presenza di ovociti nell'OCCC ed effettuare una valutazione preliminare della maturità degli ovociti.
   3. Quindi, preparare in anticipo una pipetta per aspirazione in silicone con una pipetta Pasteur rotonda lucidata a fiamma, aspirare l'OCCC e, allo stesso tempo, sollevare delicatamente la piastra di coltura a ore 9-10 con l'anulare sinistro della mano che tiene la piastra da 10 cm, inclinando leggermente la piastra di coltura di circa 15° a sinistra (posizionare l'anulare sotto la piastra è approssimativamente l'angolo richiesto).
   4. Mentre sputa l'OCCC aspirato a ore 11 del piatto, allungalo delicatamente orizzontalmente verso destra. Quindi, osservare le dimensioni delle cellule della granulosa attorno all'OCCC espanso. Successivamente, nella posizione opportuna dell'OCCC allungato orizzontalmente, utilizzare la pipetta Pasteur per effettuare un taglio discendente rapido e delicato sulle cellule della granulosa in eccesso dall'alto verso il basso.
4. Trasferire l'OCCC tagliato in una capsula di raccolta contenente la soluzione di lavaggio OCCC. Versare il liquido follicolare rimanente in un contenitore sterile per campioni (Tabella dei materiali). Ripetere questi passaggi fino a quando tutti i complessi non sono stati raccolti.

3. Preparazione dello sperma e inseminazione in vitro

1. Raccogliere i campioni di sperma tramite eiaculazione la mattina del prelievo degli ovociti. Valutare la concentrazione, la motilità e la morfologia degli spermatozoi al microscopio ottico seguendo i criteri^{10 dell'Organizzazione} Mondiale della Sanità (OMS, 2010). Quindi, trasferire il pellet di sperma in una nuova provetta da centrifuga e lavarlo due volte nel terreno di fertilizzazione¹¹. Incubarli al 6% di CO₂ e 37 °C fino al momento del bisogno.
2. Inseminare gli OCCC con 1 x 10⁵ a 3 x 10⁵ spermatozoi mobili per millilitro in una singola goccia circa 2-3 ore dopo il prelievo nella piastra di fecondazione (Tabella dei materiali). Aggiungere 6-8 OCCC e 1 mL di terreno di fertilizzazione alla piastra di fertilizzazione.
   NOTA: Dopo aver lavato l'OCCC appiccicoso, vengono trasferiti nella piastra di fertilizzazione utilizzando una pipetta Pasteur. Rilasciare un OCCC alla volta, sollevando delicatamente la pipetta dalla superficie del liquido prima di rilasciare il successivo, assicurandosi che ogni OCCC sia posizionato singolarmente nella piastra per evitare l'aggregazione.

4. Rimozione delle cellule cumuliformi

1. Per la concimazione a breve termine, seguire i passaggi descritti di seguito.
   1. Co-incubare gli OCCC con gli spermatozoi per 4-6 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere meccanicamente le cellule del cumulo che circondano gli ovociti.
   2. Aspirare gli ovociti utilizzando una pipetta con un diametro interno leggermente più piccolo degli ovociti per garantire la completa rimozione delle cellule del cumulo.
   3. Confermare la fecondazione osservando la presenza di due corpi polari. Gli ovociti che mostrano un secondo globulo polare sono considerati fecondati.
   4. Identificare quei casi che non mostrano il secondo globulo polare come fallimenti di fecondazione, che richiedono il salvataggio ICSI.
2. Per una fecondazione regolare, dopo 18-20 ore di co-incubazione, rimuovere le cellule del cumulo utilizzando le pipette per la valutazione della fecondazione.

5. Coltura embrionale

1. Coltura e monitoraggio degli ovociti fecondati per 3-5 giorni dopo il prelievo degli ovociti. Valutare la fecondazione a 20 ore dopo l'inseminazione per determinare il numero di pronuclei. Successivamente, coltivare ogni zigote individualmente in una gocciolina di terreno e trasferire gli embrioni dopo la fecondazione in un mezzo di scissione.
   NOTA: Un embrione ideale entro il terzo giorno dovrebbe essere costituito da sei o più blastomeri di uguali dimensioni e mostrare un tasso di frammentazione inferiore o uguale al 10%¹².
2. La decisione di procedere con la coltura di blastocisti dipende dalle preferenze del paziente e dalle circostanze specifiche, come la quantità e la qualità degli embrioni ottenuti il giorno 3. Trasferire gli embrioni del giorno 3 nel terreno di blastocisti e valutare il giorno 5. Usa il sistema di punteggio di Gardner per valutare le blastocisti, con blastocisti di alta qualità con punteggi di ≥ 4 BB¹³.

6. Misure di outcome e analisi statistica

1. Riporta i dati continui come media ± deviazione standard ed esprimi i dati ordinali come proporzioni. Eseguire analisi statistiche utilizzando il t-test di Student o il test del chi quadrato in un software di analisi dei dati appropriato (qui, IBM SPSS Statistics). Considerare un livello di significatività di P < 0,05 come statisticamente significativo.

Risultati

Nel gruppo sottoposto a brevi procedure di co-incubazione, sono stati esclusi i pazienti che hanno ricevuto il salvataggio. Su 47 pazienti che hanno ricevuto inseminazione a breve termine, non sono state osservate differenze significative in termini di età delle pazienti e numero di ovociti recuperati (Tabella 1). L'immediata rimozione parziale dell'OCCC ha provocato un allentamento dell'OCCC rimanente attorno agli ovociti (Figura 3), facil...

Discussione

La rimozione parziale immediata delle cellule della granulosa può accelerare il processo di disintegrazione precoce della fecondazione a breve termine, ridurre il tempo di osservazione per il secondo globulo polare sia nella fecondazione a breve termine che nella fecondazione in vitro convenzionale e non compromettere il successivo sviluppo embrionale. Attualmente, i laboratori di tutto il mondo impiegano varie strategie per mitigare i disturbi della fecondazione e i bassi tassi di succ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
G-IVFT PLUS	Vitrolife	10136
OVOIL	Vitrolife	10029
G-MOPS PLUS	Vitrolife	10130
Falcon 3003 dish	Corning	353003
Falcon 3001 dish	Corning	353001
Falcon 2001 tube	Corning	352001
Falcon 4013 cup	Corning	354013
Falcon 3037 dish	Corning	351058
Pasteur pipette	Darwin	D1150-5P