Tümör Hücrelerinin Farelerin Omuriliğine Cerrahi Nakli

Özet

Mevcut protokol, tümör hücrelerinin intervertebral boşluğa enjekte edilmesiyle tekrarlanabilir bir murin spinal kord gliomu modelinin geliştirilmesini tanımlamakta ve araştırma ve terapötik geliştirme için daha etkili ve daha az invaziv bir yaklaşım sunmaktadır.

Özet

Omurilik gliomları genellikle omuriliğin kötü huylu tümörleridir ve yüksek oranda özürlülüğe yol açar. Bununla birlikte, tek tip tedavi kılavuzları ve omurilik gliomları ile ilgili kapsamlı veriler, uygun preklinik hayvan modellerinin olmaması nedeniyle sınırlı kalmaktadır. Basit ve tekrarlanabilir bir hayvan modeli geliştirmek, temel ve translasyonel araştırmaları ilerletmek için gerekli hale gelmiştir. Murin omuriliği, insan omuriliği ile yapısal benzerlikler paylaştığı için bir murin modeli idealdir. Bu protokol, yedinci servikal omurun dikenli sürecini bir kılavuz olarak kullanarak tümör hücrelerini doğrudan intervertebral boşluğa enjekte ederek tekrarlanabilir bir murin spinal kord glioma modelinin oluşturulmasını tanımlar. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım daha etkili ve kullanışlıdır, daha küçük bir kesi, daha az invazivlik ve kan kaybı, daha hızlı iyileşme ve daha stabil tümör oluşumunu içerir. Bu modelin hastalık mekanizmalarının anlaşılmasını ilerletmesi, cerrahi stratejileri optimize etmesi ve omurilik gliomları için terapötik ilaçların geliştirilmesini desteklemesi beklenmektedir.

Giriş

Spinal kord gliomları, kauda equina'nınkiler de dahil olmak üzere, genellikle omuriliğin malign neoplazmlarıdır ve% 20-40'ı astrositom ve geri kalanı ependimomlar¹ olarak sınıflandırılır. Histolojik özelliklere dayanarak, spinal kord gliomları dört dereceye (I-IV) ayrılır. Derece I ve II tümörler düşük dereceli gliomlar olarak kabul edilirken, derece III ve IV tümörler yüksek dereceli gliomlar olarak sınıflandırılır. Omurilik gliomları omuriliğin herhangi bir segmentinde ortaya çıkabilmesine rağmen, en sık servikal bölgede bulunur (vakaların %33'ü) ve diğer bölgelerde nispeten nadirdir, vakaların %26'sı torasik bölgede ve %24'ü bel bölgesinde².

Cerrahi, radyoterapi ve alkilleyici ajanlar, büyük ölçüde beyin gliomları 3 ile ilgili klinik çalışmalardan tahmin edilen spinal kord gliomları için birincil tedavi seçenekleridir^. Bununla birlikte, önceki araştırmalar, omurilik gliomlarının histolojik profillerinin beyin gliomlarınınkine benzemesine rağmen, farklı moleküler imzaların varlığının onları serebral muadillerinden ayırdığını göstermiştir⁴. Kohortumuzda, spinal kord glioma hastaları adjuvan kemoterapi veya radyoterapiden anlamlı bir fayda elde etmedi, bu da mevcut tedavilerin sınırlı etkinliğinin ve yeni terapötik stratejilere duyulan ihtiyacın altını çizdi⁵. Bu nedenle, temel araştırmaları ve klinik öncesi çalışmaları ilerletmek için güvenilir ve bilgilendirici hayvan modelleri gereklidir.

Şu anda, Minru ve ^ark.6 tarafından tanımlanan yöntem de dahil olmak üzere birçok iyi bilinen spinal kord glioma modeli mevcuttur. Bu modeller öncelikle omuriliği ortaya çıkarmak için torasik omur çıkarma tekniklerini kullanır ^6,7,8. Sıçan modelleri geçmişte kullanılmış olsa da, fare modellerine kıyasla daha yüksek maliyetler, daha küçük örneklem boyutları ve daha büyük yönetim zorlukları ile ilişkilidir. Ek olarak, sıçan modellerinden daha fazla genetik olarak değiştirilmiş deneysel fare modeli mevcuttur. Bağışıklığı yeterli bir fare modeli, omurga tümörü mikro çevresindeki bağışıklık tepkisini incelemek ve omurilik gliomları için immünoterapötik stratejiler geliştirmek için özellikle değerlidir. Ayrıca, bu yöntem omurilik gliomları için hasta kaynaklı ksenogreft modelleri oluşturmak için çok uygundur.

Bu protokol, farelerde bir omurilik glioma transplantasyon modeli oluşturmak için güvenli, teknik olarak basit ve hızlı bir şekilde tekrarlanabilir bir prosedür önermektedir. Modelin, glioma ilerlemesinin altında yatan büyük ölçüde keşfedilmemiş mekanizmalara yönelik araştırmaları ilerletmesi ve omurilik gliomları için terapötik ilaçların geliştirilmesini kolaylaştırması beklenmektedir.

Protokol

Bu protokol, Capital Medical University Biyomedikal Araştırmalarda Hayvan Bakımı ve Tedavisi Etiği Kurumsal Komitesi tarafından onaylanan yönergelere (AEEI-2021-187) uygun olarak yürütülmüştür. Bu çalışmada 8 haftalık ve 19-21 g ağırlığındaki dişi C57BL/6 fareler kullanıldı. Kullanılan reaktifler ve ekipman, Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

1. Ameliyat öncesi hazırlık

1. Tüm cerrahi aletleri iyice temizleyin ve sterilize edin.
2. Ameliyat masasına alkol püskürtün ve steril kağıt havlu kullanarak silerek temizleyin.

2. Nakil için GL261-luc ve B16-F10-luc hücrelerinin hazırlanması

NOT: GL261-luc GBM hücre hattı ticari olarak elde edilirken, B16-F10-luc melanom hücre hattı Profesör Wang Xi'nin bir hediyesiydi. Her iki hücre hattının da deney öncesi testlerle mikoplazma enfeksiyonu içermediği doğrulandı.

1. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin (100 U / mL) -streptomisin (100 μg / mL) ile takviye ederek tam DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı) hazırlayın.
2. GL261-luc veya B16-F10-luc hücrelerini tam DMEM ortamında kültürleyin ve implantasyon için logaritmik büyüme fazı sırasında hücreleri toplayın.
3. Hücreleri steril PBS ile iki kez yıkayın, daha sonra% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ile 3 dakika inkübe edin.
4. Elde edilen hücre süspansiyonunu bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleyin.
5. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı bir pipet kullanarak atın, hücreleri steril PBS'de yeniden süspanse edin ve bir kez daha santrifüjleyin.
6. Hücreleri tripan mavisi ile boyayın ve bir hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri sayın.
7. Hücre süspansiyonunu GL261-luc hücreleri için 5 × 10⁶ hücre/mL veya B16-F10-luc hücreleri için 5 ×^{10 5} hücre/mL konsantrasyonda hazırlayın ve kullanıma hazır hale getirin.

3. Hayvan hazırlama

1. % 2.5 tribromoetanol çözeltisinin (10 μL / g) intraperitoneal enjeksiyonu ile fareleri tartın ve uyuşturun. Pedal refleksinin kaybını kontrol ederek anesteziyi onaylayın. Hazırlıktan dikişe kadar tüm prosedür yaklaşık 5-10 dakika sürmelidir.
   NOT: İşlem boyunca vücut ısısını korumak için hayvanı bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirin.
2. Cildi açığa çıkarın ve temiz bir cerrahi pencere hazırlayın (Şekil 1A). Sırt boynu bölgesinden ve orta hattan iki yana uzanan 2 cm'lik bir alandan saçları saç kesme makinesi kullanarak tıraş edin.
   1. Kalan tüyleri almak için, pamuklu çubuk kullanarak traş edilen bölgelere ince bir tabaka tüy dökücü krem uygulayın ve 1-2 dakika bekletin. Daha sonra tüy dökücü kremi sabunla nemlendirilmiş gazlı bezle silin.
3. Cildi 30 saniye boyunca dairesel hareketlerle uygulanan iyot çözeltisi kullanarak dezenfekte edin, ardından deiyodinasyon için% 75 alkol ile silin.

4. Servikal omurganın açığa çıkması ve yerleştirme noktasının belirlenmesi

1. Fareleri sırt tarafları yukarı bakacak şekilde konumlandırın ve tıbbi bant kullanarak uzuvlarını ameliyat masasına sabitleyin. Omuriliğe daha iyi erişim sağlamak için destek için boyun bölgesinin altına 1-2 cm kalınlığında bir gazlı bez yerleştirin.
2. Cerrahi bir neşter ve bıçak kullanarak boyun derisi boyunca yaklaşık 1,5 cm'lik uzunlamasına bir kesi yapın (Şekil 1B). Boyun kaslarını künt diseksiyonla nazikçe ayırın ve herhangi bir kan damarına zarar vermemeye dikkat edin.
3. Farelerde belirgin bir kemikli dönüm noktası olan yedinci servikal vertebral spinöz süreci ortaya çıkarmak için servikal omurlara bitişik kasları dikkatlice inceleyin (Şekil 1C ve Şekil 1G-I).
4. Enjeksiyona devam etmeden önce steril pamuklu çubuklar kullanarak cerrahi bölgedeki kanı temizleyin.
5. Delinme noktasını omurganın orta hattından 0,5-0,9 mm'ye ayarlayın, farelerin vücut ağırlığına (16-24 g) bağlı olarak enjeksiyon derinliğini 0,6-0,9 mm'ye ayarlayın.
   NOT: Omurilik enjeksiyon derinliği 22-24 g ağırlığındaki fareler için 0,9 mm'dir.

5. Tümör hücrelerinin enjeksiyonu

1. 10 μL'lik düz iğneli bir şırıngayı steril PBS solüsyonu ile 2-3 kez iyice durulayın.
2. Hava kabarcığı olmadığından emin olarak 2 μL hücre süspansiyonunu şırıngaya çekin.
3. Servikal vertebral spinöz süreci forseps ile nazikçe kavrayarak ve kaldırarak stabilize edin. Dura mater'i delmek için eğimli bir iğne (1.87 mm uzunluğunda ve 0.48 mm çapında) kullanın (Şekil 1D). Ardından, tümör hücrelerini enjekte etmek için düz bir iğneli şırıngaya (0.48 mm çapında) geçin (Şekil 1E).
   NOT: İğne geçişi sırasında delinme bölgesi korunur ve doğru yerleştirme, sinir stimülasyonundan kaynaklanan alt ekstremite seğirmesi ile doğrulanır.
4. Bozulmayı önlemek için hücre süspansiyonunu yavaşça enjekte edin.
5. Başarılı tümör implantasyonunu sağlamak için şırıngayı enjeksiyondan sonra 30 saniye boyunca yerinde tutun.

6. Ameliyat sonrası bakım

1. Ameliyat bitiminde cilt kesisini 3-0 naylon dikiş ile dikilerek kapatın (Görsel 1F).
2. Fareyi yan yatırın ve kafesteki anesteziden sonra iyileşme sırasında sıcaklığı korumak ve dengeli nefes almayı sağlamak için ısıtılmış bir matın üzerine yerleştirin.
3. Ağrıyı hafifletmek için Buprenorfin (0.1 mg / kg) 3 gün boyunca günde iki kez deri altından uygulayın.
4. Kanama veya yara yırtılması belirtisi olmadan ameliyat öncesi aktivitesini geri kazandığından emin olmak için fareyi izleyin.
   NOT: Arka bacak zayıflığı da dahil olmak üzere geçici omurilik disfonksiyonu ameliyattan sonra yaygındır ve tipik olarak 3 saat içinde düzelir. Farelerin yaklaşık% 5'inde felç gelişebilir, ancak genellikle 3 gün içinde iyileşir. Bu fareler için, yeterli erişilebilirliği sağlamak için besleyici olarak eksiksiz bir diyet ve doğrudan kafes zemininde jel su sağlayın. Belden aşağısı felçli olan farelerin küçük bir yüzdesi (yaklaşık% 5) ötenazi gerektirebilir.
5. Farelerin suya ve yiyeceğe sürekli erişimi olduğundan emin olun.
   NOT: Hayvanlar kilo kaybı veya felç belirtileri gösteriyorsa, ayrı ayrı barındırılmalıdırlar.

7. İn vivo biyolüminesans görüntüleme

1. Farelere D-PBS'de çözünmüş 150 mg / kg D-lusiferin intraperitoneal enjeksiyonu uygulayın.
2. Fareleri indüksiyon için izofluran içeren bir anestezi odasına yerleştirin.
3. İşlem sırasında anesteziyi sürdürmek için fareleri entegre anestezik manifolduna aktarın.
4. Önceki rapor^9'da açıklandığı gibi in vivo biyolüminesan görüntüleme gerçekleştirin.
   NOT: Küçük hayvanların canlı görüntülemesinde D-lusiferin için en uygun yanıt süresi enjeksiyondan 10 dakika sonradır. Görüntülemenin enjeksiyondan tam olarak 10 dakika sonra yapıldığından emin olun.

Sonuçlar

Spinal gliomun stabil ve güvenilir bir hayvan modelini oluşturmak için, C57BL / 6 farelerinde altıncı ve yedinci servikal omurlar arasındaki intervertebral boşluk, literatür taraması ve deneysel bulgulara dayanarak aşılama için ideal bölge olarak tanımlandı¹⁰. Yedinci servikal omur, enjeksiyon bölgesinin doğru bir şekilde konumlandırılmasına ve enjeksiyon işleminin stabilize edilmesine yardımcı olan belirgin bir kemikli dönüm noktası ola...

Tartışmalar

Omurilik gliomu, omurilikteki en sık görülen primer malign tümör türüdür ve intramedüller tümörlerin %80'inden fazlasını oluşturur. Patolojik olarak, spinal kord gliomları öncelikle ependimomlar veya astrositomlar olarak sınıflandırılır ve özellikle astrositomlar^11'e odaklanır. Astrositomlar arasında, bazıları, kötü prognozlarla ilişkili olan diffüz orta hat gliomları (DMG'ler) olarak da bilinen H3K27M mutasyonlarını barındırır....

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
A nutritionally complete food and water gelled diet (Nutra-Gel)	Bio-Serv	N/A
Adhesion microscope slides	CITOTEST	188105
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jacksonimmuno	115-007-003
B16-F10-luc	Professor Wang Xi's laboratory	N/A
Buprenorphine Related Compound A	Sigma-Aldrich	457071-73-7
CD163 (ABT-CD163) mouse mAb	Immunoway	YM6146
CD86 rabbit pAb	Immunoway	YT7823
Cell counter	Bio-rad	1450102
Cell Counting Slides	Biorad	1450011
DAPI/Sealant Dual Solution (Anti-Quenching)	Immunoway	YS0014
Dilator	Jinzhong	D22178
D-Luciferin	PerkinElmer	122799
DMEM	Gibco	C11995500BT
D-PBS	Solarbio	D1040
Fetal Bovine Serum, qualified	Gibco	10270-106
GL261-luc	Shanghai Zishi Biotechnology	N/A
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Life	A21244
Goat Serum	Beyotime	C0265
Hamilton microinjector 10 µL fixed 701N	Hamilton	80383
In vivo bioluminescent imaging (IVIS Spectrum)	PerkinElmer	N/A
Methanol	Fuyu Chemical	67-56-1
Micro Scissors	Jinzhong	WAA320
Microliter Syringes (10 µL, pointed tip)	Shanghai Gaoge	N/A
Microscope cover glass	CITOTEST	10212440C
needle holder 12.5 cm	Jinzhong	JCZ200
Ophthalmic Forceps 10 cm	Jinzhong	JD1060
Ophthalmic Scissors 10 cm	Jinzhong	Y00030
PBS, 10×	Solarbio	P1022
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Scalpel Blades	Jinzhong	J0B050
super pap pen	ZSGB-Bio	ZLI-9303
Surgical Knife Handle	Jinzhong	J11010
Surgical scissors 12.5cm straight tip	Jinzhong	J21010
Nylon Surgical Sutures with thread, size 3-0	UNIFY	N/A
Tissue-Tek O.C.T. Compound	SAKURA	4583
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Triton X-100	Servicebio	GC204003
Trypan Blue Stain Solution, 0.4%	Solarbio	C0040
Trypsin Digestion solutions, 0.25% (without phenol red)	Solarbio	T1350
Tween-20	Solarbio	T8220