종양 세포를 마우스의 척수에 외과적 이식

요약

본 프로토콜은 종양 세포를 추간 공간에 주입하여 척수 신경교종의 재현 가능한 쥐 모델을 개발하는 방법을 설명하며, 연구 및 치료 개발을 위한 보다 효과적이고 덜 침습적인 접근 방식을 제공합니다.

초록

척수 신경교종은 일반적으로 척수의 악성 종양으로 높은 장애 비율을 초래합니다. 그러나 척수 신경교종에 대한 통일된 치료 지침과 포괄적인 데이터는 적절한 전임상 동물 모델이 없기 때문에 여전히 제한적입니다. 간단하고 재현 가능한 동물 모델을 개발하는 것은 기초 및 중개 연구를 진전시키는 데 필수적인 요소가 되었습니다. 쥐 모델은 쥐의 척수가 인간의 척수와 구조적 유사성을 공유하기 때문에 이상적입니다. 이 프로토콜은 일곱 번째 경추의 척추돌기를 가이드로 사용하여 종양 세포를 추간 공간에 직접 주입하여 척수 신경교종의 재현 가능한 쥐 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 다른 방법에 비해 이 방법은 절개 부위가 작고, 침습성 및 출혈이 감소하며, 회복이 빠르고, 종양이 안정적으로 형성되는 등 더 효과적이고 편리합니다. 이 모델은 질병 메커니즘에 대한 이해를 증진하고, 수술 전략을 최적화하며, 척수 신경교종에 대한 치료 약물 개발을 지원할 것으로 예상됩니다.

서문

척수 신경교종(cauda equina)을 포함한 척수 신경교종(spinal cord gliomas)은 일반적으로 척수의 악성 신생물이며, 20%-40%는 성상세포종(astrocytomas)으로, 나머지는 뇌실막종(ependymomas)으로 분류된다¹. 조직학적 특징에 따라 척수 신경교종은 4가지 등급(I-IV)으로 분류됩니다. I등급 및 II등급 종양은 저등급 신경교종으로 간주되며, III등급 및 IV등급 종양은 고등급 신경교종으로 분류됩니다. 척수 신경교종은 척수의 모든 분절에서 발생할 수 있지만, 경추 부위(33%)에서 가장 빈번하게 발견되며 다른 부위에서는 상대적으로 드물며, 흉부 부위에서 26%, 요추 부위에서 24%가 발생한다².

수술, 방사선 요법 및 알킬화제는 척수 신경교종의 주요 치료 옵션이며, 주로 뇌 신경교종에 대한 임상시험에서 외삽된 것이다³. 그러나 이전 연구에서는 척수 신경교종의 조직학적 프로필이 뇌 신경교종의 조직학적 프로필과 유사하지만, 뚜렷한 분자 서명의 존재가 대뇌 신경교종과 구별된다는 것을 입증했습니다⁴. 본 연구에서 척수 신경교종 환자는 보조 화학요법이나 방사선 요법에서 유의미한 효과를 얻지 못했으며, 이는 현재 치료법의 제한된 효과와 새로운 치료 전략의 필요성을 강조한다⁵. 따라서 신뢰할 수 있고 유익한 동물 모델은 기초 연구 및 전임상 연구를 진전시키는 데 필수적입니다.

현재 Minru et ^al.6에 의해 설명된 방법을 포함하여 몇 가지 잘 확립된 척수 신경교종 모델이 존재합니다. 이 모델은 주로 흉추 제거 기술을 사용하여 척수를 노출시킵니다 ^6,7,8. 과거에 쥐 모델이 사용되기는 했지만, 쥐 모델에 비해 비용이 더 많이 들고, 표본 크기가 작으며, 관리 문제가 더 크다는 단점이 있습니다. 또한 쥐 모델보다 유전적으로 변형된 실험용 마우스 모델을 더 많이 사용할 수 있습니다. 면역이 가능한 마우스 모델은 척추 종양 미세환경 내의 면역 반응을 연구하고 척수 신경교종에 대한 면역 치료 전략을 개발하는 데 특히 유용합니다. 또한, 이 방법은 척수 신경교종에 대한 환자 유래 이종 이식 모델을 생성하는 데 매우 적합합니다.

이 프로토콜은 마우스에서 척수 신경교종 이식 모델을 만들기 위한 안전하고 기술적으로 간단하며 빠르게 재현 가능한 절차를 제안합니다. 이 모델은 신경교종 진행의 기저에 있는 거의 탐구되지 않은 메커니즘에 대한 연구를 진전시키고 척수 신경교종에 대한 치료 약물 개발을 촉진할 것으로 예상됩니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Capital Medical University의 생물의학 연구에서 동물 관리 및 치료 윤리를 위한 기관 위원회(AEEI-2021-187)에서 승인한 지침에 따라 수행되었습니다. 이 연구에는 생후 8주, 체중 19-21g의 암컷 C57BL/6 마우스가 사용되었습니다. 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 자세히 설명되어 있습니다.

1. 수술 전 준비

1. 모든 수술 기구를 철저히 청소하고 살균하십시오.
2. 수술대에 알코올을 뿌리고 멸균 종이 타월을 사용하여 깨끗이 닦습니다.

2. 이식을 위한 GL261-luc 및 B16-F10-luc 세포의 준비

참고: GL261-luc GBM 세포주는 상업적으로 얻은 것이고, B16-F10-luc 흑색종 세포주는 Wang Xi 교수의 선물이었습니다. 두 세포주 모두 사전 실험 테스트를 통해 마이코플라스마 감염이 없는 것으로 확인되었습니다.

1. 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린(100 U/mL)-스트렙토마이신(100 μg/mL)을 보충하여 완전한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 준비합니다.
2. 완전한 DMEM 배지에서 GL261-luc 또는 B16-F10-luc 세포를 배양하고 이식을 위한 로그 성장 단계에서 세포를 수집합니다.
3. 멸균 PBS로 세포를 두 번 세척한 다음 0.05% 트립신-EDTA 용액으로 3분 동안 배양합니다.
4. 생성된 세포 현탁액을 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 500 × g 의 원심분리를 합니다.
5. 원심분리 후 피펫을 사용하여 상등액을 버리고 멸균 PBS에 세포를 재현탁한 후 다시 한 번 원심분리합니다.
6. 트리판 블루로 세포를 염색하고 세포 계수기를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다.
7. GL261-luc 세포의 경우 5 × 10⁶ cells/mL 또는 B16-F10-luc 세포의 경우 5 × 10⁵ cells/mL의 농도로 세포 현탁액을 준비하여 사용할 수 있도록 합니다.

3. 동물 준비

1. 2.5% 트리브로모에탄올 용액(10μL/g)을 복강내 주사하여 마우스의 무게를 측정하고 마취합니다. 페달 반사의 손실을 확인하여 마취를 확인하십시오. 준비에서 봉합까지 전체 절차는 약 5-10분 정도 소요됩니다.
   알림: 시술 내내 체온을 유지하기 위해 동물을 가열 패드 위에 올려 놓습니다.
2. 피부를 노출시키고 깨끗한 수술 창을 준비합니다(그림 1A). 이발기를 사용하여 등쪽 목 부분과 정중선에서 양측으로 뻗은 2cm 부분의 수염을 면도합니다.
   1. 남아 있는 털을 제거하려면 면봉을 사용하여 면도 부위에 제모 크림을 얇게 바르고 1-2분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 비누를 적신 거즈로 제모 크림을 닦아냅니다.
3. 요오드 용액을 사용하여 피부를 소독하고 30초 동안 원을 그리며 바른 다음 75% 알코올로 닦아 요오드를 제거합니다.

4. 경추의 노출 및 삽입 지점의 결정

1. 생쥐의 등쪽이 위를 향하도록 배치하고 의료용 테이프를 사용하여 팔다리를 수술대에 고정합니다. 목 부위 아래에 1-2cm 두께의 거즈 패드를 놓아 척수에 더 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.
2. 수술용 메스와 칼날을 사용하여 목 피부를 따라 약 1.5cm의 세로로 절개합니다(그림 1B). 뭉툭한 절개로 목 근육을 부드럽게 분리하고 혈관이 손상되지 않도록 주의하십시오.
3. 경추에 인접한 근육을 조심스럽게 절개하여 생쥐의 뚜렷한 뼈 랜드마크인 일곱 번째 경추 척추돌기를 드러냅니다(그림 1C 및 그림 1G-I).
4. 주사를 진행하기 전에 멸균 면봉을 사용하여 수술 부위의 혈액을 제거합니다.
5. 천자 지점을 척추 정중선에서 0.5-0.9mm로 설정하고 마우스의 체중(0.6-0.9g)에 따라 주입 깊이를 16-24mm로 조정합니다.
   참고: 척수 주입 깊이는 체중이 22-24g인 마우스의 경우 0.9mm입니다.

5. 종양 세포의 주입

1. 10μL 편평한 주사기를 멸균 PBS 용액으로 2-3회 철저히 헹굽니다.
2. 세포 현탁액 2μL를 주사기로 빨아들여 기포가 없는지 확인합니다.
3. 경추 척추돌기를 집게로 부드럽게 잡고 들어 올려 안정화합니다. 경막에 구멍을 뚫기 위해 경막(길이 1.87mm, 직경 0.48mm)이 비스듬한 바늘을 사용합니다(그림 1D). 그런 다음 편평한 주사기(직경 0.48mm)로 전환하여 종양 세포를 주입합니다(그림 1E).
   참고: 찔린 부위는 바늘을 교체하는 동안 보존되며, 신경 자극으로 인한 하지 경련으로 정확한 위치가 확인됩니다.
4. 중단을 피하기 위해 세포 현탁액을 천천히 주입합니다.
5. 성공적인 종양 이식을 위해 주사기 주입 후 30초 동안 주사기를 제자리에 두십시오.

6. 수술 후 관리

1. 수술 마지막에 3-0 나일론 봉합사로 봉합하여 절개 부위를 봉합합니다(그림 1F).
2. 마우스를 옆으로 눕히고 가열된 매트 위에 올려 놓아 케이지에서 마취에서 회복하는 동안 따뜻함을 유지하고 안정적인 호흡을 보장합니다.
3. 통증 완화를 위해 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 3일 동안 하루 2회 피하주사합니다.
4. 쥐를 모니터링하여 출혈이나 상처 찢어짐의 징후 없이 수술 전 활동을 회복하는지 확인합니다.
   참고: 뒷다리 약화를 포함한 일시적인 척수 기능 장애는 수술 후 흔하며 일반적으로 3시간 이내에 해결됩니다. 약 5%의 쥐에서 마비가 발생할 수 있지만 일반적으로 3일 이내에 회복됩니다. 이 쥐의 경우 영양학적으로 완전한 식단을 제공하고 케이지 바닥에 직접 젤 워터를 제공하여 적절한 접근성을 보장합니다. 하반신 마비를 경험한 쥐의 소수(약 5%)는 안락사가 필요할 수 있습니다.
5. 쥐가 물과 음식에 지속적으로 접근할 수 있도록 합니다.
   참고: 동물이 체중 감소 또는 마비의 징후를 보이면 개별적으로 수용해야 합니다.

7. 생체 내 생물 발광 이미징

1. D-PBS에 용해된 150mg/kg D-루시페린을 마우스에 복강내 주사합니다.
2. 유도를 위해 이소플루란이 포함된 마취실에 마우스를 놓습니다.
3. 시술 중 마취를 유지하기 위해 마우스를 통합 마취 매니폴드로 옮깁니다.
4. 이전 보고서⁹에 설명된 대로 생체 내 생물 발광 이미징을 수행합니다.
   참고: 작은 동물의 라이브 이미징에서 D-루시페린의 최적 반응 시간은 주입 후 10분입니다. 주사 후 정확히 10분 후에 이미징이 수행되었는지 확인합니다.

결과

척추신경교종의 안정적이고 신뢰할 수 있는 동물 모델을 확립하기 위해 문헌 검토 및 실험 결과를 바탕으로 C57BL/6 마우스의 6번째 경추와 7번째 경추 사이의 추간 공간을 접종하기에 이상적인 장소로 확인했다¹⁰. 일곱 번째 경추는 뚜렷한 뼈 랜드마크인 가시돌기(spinous process)를 제공하며(그림 1G-I), 이는 주...

토론

척수 신경교종은 척수에 있는 가장 흔한 유형의 원발성 악성 종양으로, 골수내 종양의 80% 이상을 차지합니다. 병리학적으로 척수 신경교종은 주로 뇌실막종 또는 성상세포종으로 분류되며, 특히 성상세포종에 중점을 둔다¹¹. 성상세포종 중 일부는 미만성 정중선 신경교종(DMG)이라고도 하는 H3K27M 돌연변이를 가지고 있으며, 이는 나쁜 예후와 관련이 있습...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
A nutritionally complete food and water gelled diet (Nutra-Gel)	Bio-Serv	N/A
Adhesion microscope slides	CITOTEST	188105
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jacksonimmuno	115-007-003
B16-F10-luc	Professor Wang Xi's laboratory	N/A
Buprenorphine Related Compound A	Sigma-Aldrich	457071-73-7
CD163 (ABT-CD163) mouse mAb	Immunoway	YM6146
CD86 rabbit pAb	Immunoway	YT7823
Cell counter	Bio-rad	1450102
Cell Counting Slides	Biorad	1450011
DAPI/Sealant Dual Solution (Anti-Quenching)	Immunoway	YS0014
Dilator	Jinzhong	D22178
D-Luciferin	PerkinElmer	122799
DMEM	Gibco	C11995500BT
D-PBS	Solarbio	D1040
Fetal Bovine Serum, qualified	Gibco	10270-106
GL261-luc	Shanghai Zishi Biotechnology	N/A
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Life	A21244
Goat Serum	Beyotime	C0265
Hamilton microinjector 10 µL fixed 701N	Hamilton	80383
In vivo bioluminescent imaging (IVIS Spectrum)	PerkinElmer	N/A
Methanol	Fuyu Chemical	67-56-1
Micro Scissors	Jinzhong	WAA320
Microliter Syringes (10 µL, pointed tip)	Shanghai Gaoge	N/A
Microscope cover glass	CITOTEST	10212440C
needle holder 12.5 cm	Jinzhong	JCZ200
Ophthalmic Forceps 10 cm	Jinzhong	JD1060
Ophthalmic Scissors 10 cm	Jinzhong	Y00030
PBS, 10×	Solarbio	P1022
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Scalpel Blades	Jinzhong	J0B050
super pap pen	ZSGB-Bio	ZLI-9303
Surgical Knife Handle	Jinzhong	J11010
Surgical scissors 12.5cm straight tip	Jinzhong	J21010
Nylon Surgical Sutures with thread, size 3-0	UNIFY	N/A
Tissue-Tek O.C.T. Compound	SAKURA	4583
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Triton X-100	Servicebio	GC204003
Trypan Blue Stain Solution, 0.4%	Solarbio	C0040
Trypsin Digestion solutions, 0.25% (without phenol red)	Solarbio	T1350
Tween-20	Solarbio	T8220