Хирургическая трансплантация опухолевых клеток в спинной мозг мышей

Резюме

Настоящий протокол описывает разработку воспроизводимой мышиной модели глиомы спинного мозга путем введения опухолевых клеток в межпозвоночное пространство, предлагая более эффективный и менее инвазивный подход к исследованиям и терапевтическим разработкам.

Аннотация

Глиомы спинного мозга обычно являются злокачественными опухолями спинного мозга, приводящими к высокому уровню инвалидности. Тем не менее, единые рекомендации по лечению и всеобъемлющие данные о глиомах спинного мозга остаются ограниченными из-за отсутствия подходящих доклинических моделей на животных. Разработка простой и воспроизводимой животной модели стала важной для продвижения фундаментальных и трансляционных исследований. Мышиная модель идеальна, так как мышиный спинной мозг имеет структурное сходство со спинным мозгом человека. Этот протокол описывает создание воспроизводимой мышиной модели глиомы спинного мозга путем непосредственного введения опухолевых клеток в межпозвонковое пространство с использованием остистого отростка седьмого шейного позвонка в качестве ориентира. По сравнению с другими методами, этот подход более эффективен и удобен, предполагает меньший разрез, меньшую травматичность и кровопотерю, более быстрое восстановление и более стабильное образование опухоли. Ожидается, что эта модель углубит понимание механизмов заболевания, оптимизирует хирургические стратегии и поддержит разработку терапевтических препаратов для лечения глиом спинного мозга.

Введение

Глиомы спинного мозга, в том числе конского хвоста, обычно являются злокачественными новообразованиями спинного мозга, при этом 20-40% классифицируются как астроцитомы, а остальные - как эпендимомы¹. Исходя из гистологических особенностей, глиомы спинного мозга подразделяются на четыре степени (I-IV). Опухоли I и II степени считаются глиомами низкой степени злокачественности, в то время как опухоли III и IV степени классифицируются как глиомы высокой степени злокачественности. Хотя глиомы спинного мозга могут возникать в любом сегменте спинного мозга, они чаще всего обнаруживаются в шейном отделе (33% случаев) и относительно редко в других регионах, с 26% случаев в грудном отделе и 24% в поясничном^{отделе2}.

Хирургия, лучевая терапия и алкилирующие агенты являются основными вариантами лечения глиом спинного мозга, в значительной степени экстраполированными из клинических испытаний глиом головного мозга³. Тем не менее, предыдущие исследования показали, что, хотя гистологические профили глиом спинного мозга напоминают гиомы головного мозга, наличие отчетливых молекулярных сигнатур отличает их от церебральных аналогов⁴. В нашей когорте пациенты с глиомой спинного мозга не получили существенной пользы ни от адъювантной химиотерапии, ни от лучевой терапии, что подчеркивает ограниченную эффективность современных методов лечения и необходимость новых терапевтических^{стратегий}. Таким образом, надежные и информативные животные модели имеют важное значение для продвижения фундаментальных исследований и доклинических исследований.

В настоящее время существует несколько хорошо зарекомендовавших себя моделей глиомы спинного мозга, в том числе метод, описанный Minru et ^al.6. В этих моделях в основном используются методы удаления грудных позвонков для обнажения спинного мозга ^6,7,8. Хотя модели на крысах использовались в прошлом, они связаны с более высокими затратами, меньшими размерами выборки и большими проблемами управления по сравнению с мышиными моделями. Кроме того, доступно больше генетически модифицированных экспериментальных моделей мышей, чем моделей крыс. Иммунно-компетентная мышиная модель особенно ценна для изучения иммунного ответа в микроокружении опухоли позвоночника и для разработки иммунотерапевтических стратегий при глиомах спинного мозга. Кроме того, этот метод хорошо подходит для создания моделей ксенотрансплантатов, полученных от пациентов, для глиом спинного мозга.

Этот протокол предлагает безопасную, технически простую и быстро воспроизводимую процедуру создания модели трансплантации глиомы спинного мозга у мышей. Ожидается, что эта модель будет способствовать исследованиям в значительной степени неизученных механизмов, лежащих в основе прогрессирования глиомы, и будет способствовать разработке терапевтических препаратов для лечения глиом спинного мозга.

протокол

Этот протокол был составлен в соответствии с руководящими принципами, утвержденными Институциональным комитетом по этике ухода за животными и лечения в биомедицинских исследованиях Столичного медицинского университета (AEEI-2021-187). В исследовании использовались самки мышей C57BL/6 в возрасте 8 недель и массой 19-21 г. Используемые реагенты и оборудование подробно описаны в Таблице материалов.

1. Предоперационная подготовка

1. Тщательно очистите и простерилизуйте все хирургические инструменты.
2. Сбрызните хирургический стол спиртом и протрите его стерильными бумажными полотенцами.

2. Подготовка клеток GL261-luc и B16-F10-luc к трансплантации

Примечание: Клеточная линия GL261-luc GBM была получена коммерчески, в то время как клеточная линия меланомы B16-F10-luc была подарена профессором Ван Си. В ходе предэкспериментальных испытаний было подтверждено, что обе клеточные линии не содержат микоплазменной инфекции.

1. Приготовьте полную DMEM (модифицированную орлиную среду Dulbecco), добавив в нее 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина (100 ЕД/мл)-стрептомицина (100 мкг/мл).
2. Культивируйте клетки GL261-luc или B16-F10-luc в полной среде DMEM и собирайте клетки во время логарифмической фазы роста для имплантации.
3. Дважды промойте клетки стерильным PBS, затем инкубируйте их с 0,05% раствором трипсина-ЭДТА в течение 3 мин.
4. Полученную клеточную суспензию переложить в пробирку и центрифугировать при 500 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
5. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки, повторно суспендируйте клетки в стерильной PBS и снова центрифугируйте.
6. Покрасьте клетки трипановым синим цветом и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью счетчика клеток.
7. Приготовьте клеточную суспензию в концентрации 5 × 10⁶ клеток/мл для клеток GL261-luc или 5 × 10⁵ клеток/мл для клеток B16-F10-luc, сделав ее готовой к применению.

3. Подготовка животных

1. Взвесьте и обезболите мышей путем внутрибрюшинного введения 2,5% раствора трибромэтанола (10 мкл/г). Подтвердите анестезию, проверив на потерю педального рефлекса. Вся процедура, от подготовки до наложения швов, должна занять примерно 5-10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Расположите животное на грелке, чтобы поддерживать температуру тела на протяжении всей процедуры.
2. Обнажите кожу и подготовьте чистое операционное окно (рисунок 1A). С помощью машинок для стрижки волос сбрейте волосы со спинной части шеи и на участке длиной 2 см, проходящем с обеих сторон от средней линии.
   1. Чтобы удалить оставшиеся волосы, нанесите тонкий слой крема для депиляции на выбритые участки с помощью ватного тампона и оставьте на 1-2 минуты. После этого сотрите крем для депиляции марлей, смоченной в мыле.
3. Продезинфицируйте кожу с помощью раствора йода, нанесенного круговыми движениями в течение 30 с, с последующим протиранием 75% спиртом для дейодирования.

4. Обнажение шейного отдела позвоночника и определение точки введения

1. Расположите мышей тыльной стороной вверх и прикрепите их конечности к операционному столу с помощью медицинской ленты. Подложите марлевую салфетку толщиной 1-2 см под область шеи для поддержки, обеспечивая лучший доступ к спинному мозгу.
2. Сделайте продольный разрез примерно 1,5 см вдоль кожи шеи с помощью хирургического скальпеля и лезвия (рисунок 1Б). Аккуратно разделите мышцы шеи тупым рассечением, стараясь не повредить кровеносные сосуды.
3. Тщательно рассеките мышцы, прилегающие к шейным позвонкам, чтобы обнажить седьмой шейный позвоночный остистый отросток, отчетливый костный ориентир у мышей (рисунок 1C и рисунок 1G-I).
4. Перед тем, как приступить к инъекции, удалите кровь из области операции с помощью стерильных ватных тампонов.
5. Точку прокола устанавливают на расстоянии 0,5-0,9 мм от средней линии позвоночника, регулируя глубину инъекции до 0,6-0,9 мм исходя из массы тела мышей (16-24 г).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина введения в спинной мозг составляет 0,9 мм для мышей массой 22-24 г.

5. Введение опухолевых клеток

1. Плоскоигольный шприц объемом 10 мкл тщательно промыть стерильным раствором PBS 2-3 раза.
2. Наберите 2 мкл клеточной суспензии в шприц, убедившись, что в ней нет пузырьков воздуха.
3. Стабилизируйте шейный позвоночный остистый отросток, мягко захватывая и поднимая его щипцами. С помощью скошенной иглы (1,87 мм в длину и 0,48 мм в диаметре) проколите твердую мозговую оболочку (рисунок 1D). Затем переключитесь на шприц с плоской иглой (диаметром 0,48 мм) для введения опухолевых клеток (рисунок 1E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Место прокола сохраняется во время переключения иглы, а точное размещение подтверждается подергиваниями нижних конечностей от стимуляции нервов.
4. Вводите клеточную суспензию медленно, чтобы избежать нарушения.
5. Удерживайте шприц на месте в течение 30 с после инъекции, чтобы обеспечить успешную имплантацию опухоли.

6. Послеоперационный уход

1. Закройте разрез кожи, наложив шов на нейлоновый шов 3-0 в конце операции (Рисунок 1F).
2. Положите мышь на бок и положите ее на подогретый коврик, чтобы сохранить тепло и обеспечить стабильное дыхание во время восстановления после анестезии в клетке.
3. Вводите бупренорфин (0,1 мг/кг) подкожно два раза в день в течение 3 дней для облегчения боли.
4. Следите за мышью, чтобы убедиться, что она восстанавливает предоперационную активность без признаков кровотечения или разрыва раны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Временная дисфункция спинного мозга, включая слабость задних конечностей, является распространенным явлением после операции и обычно проходит в течение 3 часов. Примерно у 5% мышей может развиться паралич, но обычно они выздоравливают в течение 3 дней. Для этих мышей обеспечьте полноценный питательный рацион и гелевую воду прямо на полу клетки, чтобы обеспечить достаточную доступность. Небольшому проценту (около 5%) мышей, испытывающих параплегию, может потребоваться эвтаназия.
5. Обеспечьте мышам постоянный доступ к воде и пище.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если у животных проявляются признаки потери веса или паралича, их следует содержать отдельно.

7. Биолюминесцентная визуализация in vivo

1. Введите мышам внутрибрюшинную инъекцию 150 мг/кг D-люциферина, растворенного в D-PBS.
2. Поместите мышей в анестезиологическую камеру, содержащую изофлуран для индукции.
3. Переведите мышей на интегральный анестезиологический коллектор для поддержания анестезии во время процедуры.
4. Выполните биолюминесцентную визуализацию in vivo , как описано в предыдущем отчете⁹.
   Примечание: Оптимальное время реакции на D-люциферин при визуализации мелких животных в реальном времени составляет 10 минут после инъекции. Убедитесь, что визуализация проводится ровно через 10 минут после инъекции.

Результаты

Чтобы создать стабильную и надежную модель глиомы позвоночника на животных, межпозвоночное пространство между шестым и седьмым шейными позвонками у мышей C57BL/6 было определено как идеальное место для инокуляции на основе обзора литературы и экспериментальных

Обсуждение

Глиома спинного мозга является наиболее распространенным типом первичной злокачественной опухоли в спинном мозге, на долю которой приходится более 80% интрамедуллярных опухолей. Патологически глиомы спинного мозга в первую очередь классифицируются как эпендимомы и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
A nutritionally complete food and water gelled diet (Nutra-Gel)	Bio-Serv	N/A
Adhesion microscope slides	CITOTEST	188105
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jacksonimmuno	115-007-003
B16-F10-luc	Professor Wang Xi's laboratory	N/A
Buprenorphine Related Compound A	Sigma-Aldrich	457071-73-7
CD163 (ABT-CD163) mouse mAb	Immunoway	YM6146
CD86 rabbit pAb	Immunoway	YT7823
Cell counter	Bio-rad	1450102
Cell Counting Slides	Biorad	1450011
DAPI/Sealant Dual Solution (Anti-Quenching)	Immunoway	YS0014
Dilator	Jinzhong	D22178
D-Luciferin	PerkinElmer	122799
DMEM	Gibco	C11995500BT
D-PBS	Solarbio	D1040
Fetal Bovine Serum, qualified	Gibco	10270-106
GL261-luc	Shanghai Zishi Biotechnology	N/A
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Life	A21244
Goat Serum	Beyotime	C0265
Hamilton microinjector 10 µL fixed 701N	Hamilton	80383
In vivo bioluminescent imaging (IVIS Spectrum)	PerkinElmer	N/A
Methanol	Fuyu Chemical	67-56-1
Micro Scissors	Jinzhong	WAA320
Microliter Syringes (10 µL, pointed tip)	Shanghai Gaoge	N/A
Microscope cover glass	CITOTEST	10212440C
needle holder 12.5 cm	Jinzhong	JCZ200
Ophthalmic Forceps 10 cm	Jinzhong	JD1060
Ophthalmic Scissors 10 cm	Jinzhong	Y00030
PBS, 10×	Solarbio	P1022
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Scalpel Blades	Jinzhong	J0B050
super pap pen	ZSGB-Bio	ZLI-9303
Surgical Knife Handle	Jinzhong	J11010
Surgical scissors 12.5cm straight tip	Jinzhong	J21010
Nylon Surgical Sutures with thread, size 3-0	UNIFY	N/A
Tissue-Tek O.C.T. Compound	SAKURA	4583
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Triton X-100	Servicebio	GC204003
Trypan Blue Stain Solution, 0.4%	Solarbio	C0040
Trypsin Digestion solutions, 0.25% (without phenol red)	Solarbio	T1350
Tween-20	Solarbio	T8220