Chirurgische Transplantation von Tumorzellen in das Rückenmark von Mäusen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Entwicklung eines reproduzierbaren Mausmodells des Rückenmarksglioms durch Injektion von Tumorzellen in den Zwischenwirbelraum und bietet damit einen effektiveren und weniger invasiven Ansatz für die Forschung und therapeutische Entwicklung.

Zusammenfassung

Rückenmarksgliome sind häufig bösartige Tumoren des Rückenmarks, die zu einer hohen Behinderungsrate führen. Einheitliche Behandlungsleitlinien und umfassende Daten zu Rückenmarksgliomen sind jedoch aufgrund des Mangels an geeigneten präklinischen Tiermodellen nach wie vor begrenzt. Die Entwicklung eines einfachen und reproduzierbaren Tiermodells ist für die Förderung der Grundlagen- und translationalen Forschung unerlässlich geworden. Ein Mausmodell ist ideal, da das murine Rückenmark strukturelle Ähnlichkeiten mit dem menschlichen Rückenmark aufweist. Dieses Protokoll beschreibt die Generierung eines reproduzierbaren Mausmodells des Rückenmarksglioms durch direkte Injektion von Tumorzellen in den Zwischenwirbelraum unter Orientierung des Dornfortsatzes des siebten Halswirbels. Im Vergleich zu anderen Methoden ist dieser Ansatz effektiver und bequemer, da er einen kleineren Schnitt, eine geringere Invasivität und einen geringeren Blutverlust, eine schnellere Genesung und eine stabilere Tumorbildung ermöglicht. Es wird erwartet, dass dieses Modell das Verständnis von Krankheitsmechanismen voranbringt, chirurgische Strategien optimiert und die Entwicklung von therapeutischen Medikamenten für Rückenmarksgliome unterstützt.

Einleitung

Rückenmarksgliome, einschließlich derjenigen der Cauda equina, sind häufig bösartige Neubildungen des Rückenmarks, wobei 20 % bis 40 % als Astrozytome und der Rest als Ependymome klassifiziert werden¹. Basierend auf den histologischen Merkmalen werden Rückenmarksgliome in vier Grade (I-IV) eingeteilt. Tumoren der Grade I und II gelten als niedriggradige Gliome, während Tumoren der Grade III und IV als hochgradige Gliome klassifiziert werden. Obwohl Rückenmarksgliome in jedem Segment des Rückenmarks auftreten können, treten sie am häufigsten im zervikalen Bereich auf (33 % der Fälle) und sind in anderen Regionen relativ selten, mit 26 % der Fälle im thorakalen Bereich und 24 % im lumbalen Bereich².

Operation, Strahlentherapie und Alkylierungsmittel sind die primären Behandlungsoptionen für Rückenmarksgliome, die weitgehend aus klinischen Studien an Hirngliomen extrapoliert wurden³. Frühere Forschungen haben jedoch gezeigt, dass die histologischen Profile von Rückenmarksgliomen zwar denen von Hirngliomen ähneln, sie jedoch durch das Vorhandensein unterschiedlicher molekularer Signaturen von ihren zerebralen Gegenstücken unterscheiden⁴. In unserer Kohorte zogen Patienten mit Rückenmarksgliomen weder durch eine adjuvante Chemotherapie noch durch eine Strahlentherapie einen signifikanten Nutzen, was die begrenzte Wirksamkeit der derzeitigen Behandlungen und den Bedarf an neuen therapeutischen Strategien unterstreicht⁵. Daher sind zuverlässige und aussagekräftige Tiermodelle unerlässlich, um die Grundlagenforschung und präklinische Studien voranzutreiben.

Derzeit existieren mehrere gut etablierte Rückenmarksgliommodelle, darunter die von Minru et ^al.6 beschriebene Methode. Bei diesen Modellen werden in erster Linie Techniken zur Entfernung von Brustwirbeln eingesetzt, um das Rückenmark freizulegen ^6,7,8. Obwohl Rattenmodelle in der Vergangenheit eingesetzt wurden, sind sie im Vergleich zu Mausmodellen mit höheren Kosten, kleineren Stichprobengrößen und größeren Managementherausforderungen verbunden. Darüber hinaus stehen mehr genetisch veränderte experimentelle Mausmodelle zur Verfügung als Rattenmodelle. Ein immunkompetentes Mausmodell ist besonders wertvoll für die Untersuchung der Immunantwort in der Mikroumgebung von Spinaltumoren und für die Entwicklung immuntherapeutischer Strategien für Rückenmarksgliome. Darüber hinaus eignet sich diese Methode gut zur Generierung von patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen für Rückenmarksgliome.

Dieses Protokoll stellt ein sicheres, technisch einfaches und schnell reproduzierbares Verfahren zur Erstellung eines Rückenmarksgliom-Transplantationsmodells bei Mäusen vor. Es wird erwartet, dass das Modell die Erforschung der weitgehend unerforschten Mechanismen, die der Progression von Gliomen zugrunde liegen, voranbringt und die Entwicklung von therapeutischen Medikamenten für Rückenmarksgliome erleichtert.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt, die vom Institutionellen Komitee für die Ethik der Tierpflege und -behandlung in der biomedizinischen Forschung an der Capital Medical University (AEEI-2021-187) genehmigt wurden. In dieser Studie wurden weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 8 Wochen und einem Gewicht von 19-21 g verwendet. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Präoperative Vorbereitung

1. Reinigen und sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente gründlich.
2. Sprühen Sie den Operationstisch mit Alkohol ein und wischen Sie ihn mit sterilen Papiertüchern sauber.

2. Vorbereitung von GL261-luc- und B16-F10-luc-Zellen für die Transplantation

HINWEIS: Die GL261-luc GBM-Zelllinie wurde kommerziell erworben, während die B16-F10-luc-Melanom-Zelllinie ein Geschenk von Professor Wang Xi war. Beide Zelllinien wurden durch präexperimentelle Tests als frei von Mykoplasmeninfektionen bestätigt.

1. Bereiten Sie vollständiges DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) vor, indem Sie es mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin (100 U/ml)-Streptomycin (100 μg/ml) ergänzen.
2. Kultivieren Sie GL261-luc- oder B16-F10-luc-Zellen im vollständigen DMEM-Medium und sammeln Sie Zellen während der logarithmischen Wachstumsphase für die Implantation.
3. Waschen Sie die Zellen zweimal mit sterilem PBS und inkubieren Sie sie dann 3 Minuten lang mit 0,05%iger Trypsin-EDTA-Lösung.
4. Die resultierende Zellsuspension in ein Röhrchen überführen und bei 500 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
5. Nach der Zentrifugation wird der Überstand mit einer Pipette verworfen, die Zellen in sterilem PBS resuspendiert und erneut zentrifugiert.
6. Färben Sie die Zellen mit Trypanblau und zählen Sie lebensfähige Zellen mit einem Zellzähler.
7. Bereiten Sie die Zellsuspension in einer Konzentration von 5 × 10⁶ Zellen/ml für GL261-luc-Zellen oder 5 × 10⁵ Zellen/ml für B16-F10-luc-Zellen vor und machen Sie sie gebrauchsfertig.

3. Vorbereitung der Tiere

1. Wiegen und betäuben Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion einer 2,5%igen Tribromethanollösung (10 μL/g). Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie den Verlust des Pedalreflexes überprüfen. Der gesamte Eingriff, von der Vorbereitung bis zum Nähen, sollte ca. 5-10 Minuten dauern.
   HINWEIS: Positionieren Sie das Tier auf einem Heizkissen, um die Körpertemperatur während des gesamten Vorgangs zu halten.
2. Legen Sie die Haut frei und bereiten Sie ein sauberes Operationsfenster vor (Abbildung 1A). Rasieren Sie die Haare ab dem Nackenbereich und einen 2 cm langen Bereich, der sich beidseitig von der Mittellinie erstreckt, mit einer Haarschneidemaschine.
   1. Um verbleibende Haare zu entfernen, tragen Sie mit einem Wattestäbchen eine dünne Schicht Enthaarungscreme auf die rasierten Stellen auf und lassen Sie sie 1-2 Minuten einwirken. Wischen Sie anschließend die Enthaarungscreme mit seifenfeuchter Gaze ab.
3. Desinfizieren Sie die Haut mit Jodlösung, die 30 s lang in kreisenden Bewegungen aufgetragen wird, gefolgt von einem Abwischen mit 75% Alkohol zur Entjodierung.

4. Freilegung der Halswirbelsäule und Bestimmung des Einstichpunktes

1. Positionieren Sie die Mäuse mit der Rückenseite nach oben und befestigen Sie ihre Gliedmaßen mit medizinischem Klebeband auf dem Operationstisch. Legen Sie ein 1-2 cm dickes Mullpolster unter den Nackenbereich, um es zu stützen und einen besseren Zugang zum Rückenmark zu ermöglichen.
2. Machen Sie mit einem chirurgischen Skalpell und einer Klinge einen Längsschnitt von ca. 1,5 cm entlang der Halshaut (Abbildung 1B). Trennen Sie die Nackenmuskulatur vorsichtig durch stumpfe Dissektion und achten Sie darauf, dass keine Blutgefäße verletzt werden.
3. Präparieren Sie vorsichtig die an die Halswirbel angrenzenden Muskeln, um den siebten Dornfortsatz des Halswirbels freizulegen, einen deutlichen knöchernen Orientierungspunkt bei Mäusen (Abbildung 1C und Abbildung 1G-I).
4. Entfernen Sie mit sterilen Wattestäbchen jegliches Blut aus dem Operationsbereich, bevor Sie mit der Injektion fortfahren.
5. Stellen Sie den Einstichpunkt auf 0,5-0,9 mm von der Mittellinie der Wirbelsäule ein und passen Sie die Injektionstiefe auf 0,6-0,9 mm an, basierend auf dem Körpergewicht der Mäuse (16-24 g).
   HINWEIS: Die Injektionstiefe des Rückenmarks beträgt 0,9 mm für Mäuse mit einem Gewicht von 22-24 g.

5. Injektion von Tumorzellen

1. Spülen Sie eine 10-μl-Flachnadelspritze 2-3 Mal gründlich mit steriler PBS-Lösung.
2. Ziehen Sie 2 μl der Zellsuspension in die Spritze und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
3. Stabilisieren Sie den Dornfortsatz der Halswirbelsäule, indem Sie ihn sanft greifen und mit einer Pinzette anheben. Verwenden Sie eine abgeschrägte Nadel (1,87 mm Länge und 0,48 mm Durchmesser), um die Dura mater zu punktieren (Abbildung 1D). Wechseln Sie dann zu einer Flachnadelspritze (0,48 mm Durchmesser), um die Tumorzellen zu injizieren (Abbildung 1E).
   HINWEIS: Die Einstichstelle bleibt während des Nadelwechsels erhalten, wobei die genaue Platzierung durch das Zucken der unteren Gliedmaßen durch die Nervenstimulation bestätigt wird.
4. Injizieren Sie die Zellsuspension langsam, um eine Störung zu vermeiden.
5. Lassen Sie die Spritze 30 s nach der Injektion an Ort und Stelle, um eine erfolgreiche Tumorimplantation zu gewährleisten.

6. Nachsorge

1. Schließen Sie den Hautschnitt, indem Sie am Ende der Operation mit einer 3-0-Nylonnaht vernähen (Abbildung 1F).
2. Positionieren Sie die Maus auf der Seite und legen Sie sie auf eine beheizte Matte, um die Wärme zu erhalten und eine stabile Atmung während der Genesung von der Narkose im Käfig zu gewährleisten.
3. Verabreichen Sie Buprenorphin (0,1 mg/kg) zweimal täglich subkutan über einen Zeitraum von 3 Tagen, um die Schmerzen zu lindern.
4. Überwachen Sie die Maus, um sicherzustellen, dass sie ihre präoperative Aktivität ohne Anzeichen von Blutungen oder Wundrissen wiedererlangt.
   HINWEIS: Eine vorübergehende Dysfunktion des Rückenmarks, einschließlich der Schwäche der hinteren Gliedmaßen, tritt nach der Operation häufig auf und verschwindet in der Regel innerhalb von 3 Stunden. Etwa 5% der Mäuse können Lähmungen entwickeln, erholen sich aber in der Regel innerhalb von 3 Tagen. Stellen Sie für diese Mäuse eine ernährungsphysiologisch vollwertige Ernährung und Gelwasser direkt auf dem Käfigboden bereit, um eine ausreichende Zugänglichkeit zu gewährleisten. Ein kleiner Prozentsatz (etwa 5%) der Mäuse, die an Querschnittslähmung leiden, kann eine Euthanasie benötigen.
5. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse ständigen Zugang zu Wasser und Futter haben.
   HINWEIS: Wenn die Tiere Anzeichen von Gewichtsverlust oder Lähmung aufweisen, sollten sie einzeln untergebracht werden.

7. In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung

1. Verabreichen Sie den Mäusen eine intraperitoneale Injektion von 150 mg/kg D-Luciferin, gelöst in D-PBS.
2. Legen Sie die Mäuse zur Induktion in eine Anästhesiekammer, die Isofluran enthält.
3. Übertragen Sie die Mäuse in den integrierten Anästhesieverteiler, um die Anästhesie während des Eingriffs aufrechtzuerhalten.
4. Führen Sie in vivo biolumineszierende Bildgebung durch, wie im vorherigen Bericht^{beschrieben 9}.
   HINWEIS: Die optimale Ansprechzeit für D-Luciferin in der Live-Bildgebung von Kleintieren beträgt 10 Minuten nach der Injektion. Stellen Sie sicher, dass die Bildgebung genau 10 Minuten nach der Injektion durchgeführt wird.

Ergebnisse

Um ein stabiles und zuverlässiges Tiermodell des spinalen Glioms zu etablieren, wurde der Zwischenwirbelraum zwischen dem sechsten und siebten Halswirbel bei C57BL/6-Mäusen auf der Grundlage von Literaturrecherchen und experimentellen Befunden als idealer Ort für die Inokulation identifiziert¹⁰. Der siebte Halswirbel stellt einen deutlichen knöchernen Orientierungspunkt dar, den Dornfortsatz (Abbildung 1G-I

Diskussion

Das Rückenmarksgliom ist die häufigste Art von primären bösartigen Tumoren im Rückenmark und macht über 80 % der intramedullären Tumoren aus. Pathologisch werden Rückenmarksgliome in erster Linie als Ependymome oder Astrozytome klassifiziert, mit besonderem Fokus auf Astrozytome¹¹. Unter den Astrozytomen beherbergen einige H3K27M-Mutationen, die auch als diffuse Mittelliniengliome (DMGs) bezeichnet werden und mit schlechten Prognosen verbunden sind. Ein ch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
A nutritionally complete food and water gelled diet (Nutra-Gel)	Bio-Serv	N/A
Adhesion microscope slides	CITOTEST	188105
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jacksonimmuno	115-007-003
B16-F10-luc	Professor Wang Xi's laboratory	N/A
Buprenorphine Related Compound A	Sigma-Aldrich	457071-73-7
CD163 (ABT-CD163) mouse mAb	Immunoway	YM6146
CD86 rabbit pAb	Immunoway	YT7823
Cell counter	Bio-rad	1450102
Cell Counting Slides	Biorad	1450011
DAPI/Sealant Dual Solution (Anti-Quenching)	Immunoway	YS0014
Dilator	Jinzhong	D22178
D-Luciferin	PerkinElmer	122799
DMEM	Gibco	C11995500BT
D-PBS	Solarbio	D1040
Fetal Bovine Serum, qualified	Gibco	10270-106
GL261-luc	Shanghai Zishi Biotechnology	N/A
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Life	A21244
Goat Serum	Beyotime	C0265
Hamilton microinjector 10 µL fixed 701N	Hamilton	80383
In vivo bioluminescent imaging (IVIS Spectrum)	PerkinElmer	N/A
Methanol	Fuyu Chemical	67-56-1
Micro Scissors	Jinzhong	WAA320
Microliter Syringes (10 µL, pointed tip)	Shanghai Gaoge	N/A
Microscope cover glass	CITOTEST	10212440C
needle holder 12.5 cm	Jinzhong	JCZ200
Ophthalmic Forceps 10 cm	Jinzhong	JD1060
Ophthalmic Scissors 10 cm	Jinzhong	Y00030
PBS, 10×	Solarbio	P1022
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Scalpel Blades	Jinzhong	J0B050
super pap pen	ZSGB-Bio	ZLI-9303
Surgical Knife Handle	Jinzhong	J11010
Surgical scissors 12.5cm straight tip	Jinzhong	J21010
Nylon Surgical Sutures with thread, size 3-0	UNIFY	N/A
Tissue-Tek O.C.T. Compound	SAKURA	4583
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Triton X-100	Servicebio	GC204003
Trypan Blue Stain Solution, 0.4%	Solarbio	C0040
Trypsin Digestion solutions, 0.25% (without phenol red)	Solarbio	T1350
Tween-20	Solarbio	T8220