Klinik Öncesi Büyük Hayvan Modelinde Böbrek Alımı

Özet

Burada, müteakip makine perfüzyonu veya transplantasyonu için klinik öncesi bir domuz modelinde böbrek alımı için cerrahi bir modeli detaylandıran bir protokol sunuyoruz.

Özet

Makine perfüzyonu, ex vivo organ değerlendirmesi, izleme, tedavi, optimizasyon ve koruma sürelerini uzatmak için uygun bir strateji olarak gelişmiştir. Büyük hayvan modelleri, bu teknolojilerin geliştirilmesi ve optimizasyonu için çok önemli olmuştur. Bununla birlikte, greft kalitesini ve veri tekrarlanabilirliğini sağlamak için, organ ve doku alımı için standardize edilmiş ve klinik olarak çevrilebilir cerrahi teknikler izlenmelidir. Bu nedenle, burada, klinik öncesi bir domuz modelinde böbrek tedariki için optimize edilmiş bir protokolü açıklıyoruz. Böbrek geri kazanımı, karışık cins (Yorkshire çapraz/karışım) domuzlar kullanılarak gerçekleştirilir. Kısaca, cerrahi alanın steril dezenfeksiyonu ve örtülmesini takiben, her iki böbreğe optimum erişim sağlamak için tam bir orta hat insizyonu yapılır. Üreter, renal ven ve arter, sırasıyla inferior vena kava ve aorttan köken alana kadar diseke edilir. Tam böbrek diseksiyonundan sonra üreter bağlanır ve distal olarak kesilir. Donör hayvan daha sonra kg / vücut ağırlığı başına 100 IU ile tamamen heparinize edilir. Daha sonra, renal arter aorta yakın klemplenir ve renal ven, bir Satinsky vasküler klempi kullanılarak vena kavaya yakın klemplenir. Böbrek grefti daha sonra rezeke edilir ve renal arter hemen arka masaya kanüle edilir. Böbrek daha sonra buz gibi bir koruma solüsyonu ile yıkanacak ve makine perfüzyonu veya transplantasyon olana kadar buz üzerinde saklanacaktır. Son olarak renal arter güdüğü 2-0 ipek ligatür ile bağlanır ve vena kava 6-0 polipropilen sütür ile kapatılır. Bu teknik böbrekleri kurtarır ve canlı (tek böbrek) veya ölmüş (çift böbrek) donör ayarını simüle eder. Tek böbrek iyileşmesi, sonraki bir ototransplantasyon gerçekleştirmek için avantaj sunar. Ölen donör modelinde, ötenaziden önce kan torbası iğneleri doğrudan aort içine sokularak kan toplanabilir, böylece hayvanın kan cezası alınması ve ex vivo makine perfüzyonu için kan sağlanması sağlanabilir.

Giriş

Böbrek nakli, diyalize kıyasla daha iyi yaşam kalitesi ve uzun vadeli sonuçlar sağlayan son dönem böbrek yetmezliği (SDBY) için en uygun tedavi yöntemidir¹. Organ korumadaki ilerlemelere rağmen, böbrek nakli için bekleme listesindeyken her gün düzinelerce insan SDBY'den ölmektedir². Makine perfüzyonu, koruma sürelerini artıran, genişletilmiş donör ağları ve daha verimli organ tahsisi sağlayan büyüyen bir alandır. Bu teknoloji aynı zamanda ex vivo organ izleme ve optimizasyonuna izin verir, böylece iskemi-reperfüzyon hasarının (IRI) etkilerini en aza indirir. Statik soğuk hava deposu (SCS) ile karşılaştırıldığında, makine perfüzyonunun gecikmiş greft fonksiyonu insidansını önemli ölçüde azalttığı gösterilmiştir ^3,4. Makine perfüzyonu ayrıca, aksi takdirde nakil⁵ kriterlerini karşılamayacak olan marjinal greftlerin yeniden canlandırıldığını göstermiştir. Teknolojik gelişmelere rağmen, en yaygın koruma tekniği buz üzerinde SCS olmaya devam ediyor. Daha fazla klinik öncesi deneyler ve veriler, makine perfüzyonunu böbrek korumanın temel dayanağı haline getirmeye yardımcı olabilir.

Böbrek nakli için domuz modeli iyi kurulmuştur ve böbrek koruma teknolojisinin, özellikle de makine perfüzyonunun geliştirilmesinin ayrılmaz bir parçası olmuştur. Tek lobüler kemirgen böbreklerinin aksine, domuz ve insan böbreklerinin her ikisi de çok lobürdür, boyut olarak benzerdir ve benzer arteriyel, venöz ve idrar anatomisini paylaşır ^6,7. Bu nedenle, domuz böbreği, özellikle tıbbi cihazlar ve ilaç tedavileri açısından klinik ortama doğrudan bir çeviri kolaylaştırır. Ek olarak, domuz böbrekleri, insan böbrekleriyle benzer bir IRI patofizyolojisi gösterir⁸, bu da onları böbrek koruma çalışmaları için ideal kılar.

Greft kalitesini ve veri tekrarlanabilirliğini sağlamak için, organ ve doku alımı için standardize edilmiş ve klinik olarak çevrilebilir cerrahi teknikler izlenmelidir. Bu nedenle, burada, klinik öncesi bir domuz modelinde böbrek tedariki için optimize edilmiş bir protokolü açıklıyoruz. Bu protokol böbreklerin geri kazanılmasına izin verir ve canlı (tek böbrek) veya ölen (çift böbrek) donör ayarını simüle eder. Tek böbrek iyileşmesi, müteakip bir ototransplantasyon gerçekleştirme avantajı sunar. Çift böbrek kurtarma modelinde, ötenazi öncesi kan alımı, kan torbası iğnelerinin doğrudan aort içine sokulması, böylece hayvanın kan durumunun açığa çıkarılması ve ex vivo makine perfüzyonu için kan sağlanması ile mümkündür.

Protokol

Açıklanan tüm prosedürler, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA) lisanslı, Laboratuvar Hayvanları Refahı Ofisi (OLAW) güvencesinde ve Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite edilmiş bir kurum olan Johns Hopkins Üniversitesi Kurumsal Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı'nın Hayvan Refahı Yasası, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi ve Amerika Birleşik Devletleri Halk Sağlığı Servisi'nin Laboratuvar Hayvanlarının İnsani Bakımı ve Kullanımı Politikası'na uygun olarak muhafaza edildi.

1. Hayvanlar ve barınma

1. Bu protokol için 3-6 aylık klinik olarak sağlıklı 20-40 kg Yorkshire domuzları (Sus scrofa domesticus) veya karşılaştırılabilir kullanın.
2. Hayvanları, çıtalı döşeme ile zincir bağlantılı çit yollarında barındırın.

2. Ameliyat öncesi prosedür ve anestezi

1. Sedasyon zamanından en az 12 saat önce hayvanı aç bırakın.
2. Ameliyattan en az 12 saat önce oral simetikon (20 mg / kg) uygulayın ve bağırsak genişlemesini azaltmak için sedasyondan en az 1 saat önce dozu tekrarlayın.
3. Birden fazla enjeksiyondan kaçınmak için ketamin (20-30 mg / kg) ve ksilazin (2-3 mg / kg) tek bir şırıngada kas içine uygulayın.
4. Domuzu ameliyat öncesi evreleme alanına aktarın. Marjinal kulak damarına intravenöz bir kateter yerleştirin. Prosedür boyunca 3-10 mg / kg / saat% 0.9 salin veya Emzirilmiş Ringer solüsyonu uygulayın.
5. Domuz yeterince sedasyona tabi tutulduktan sonra, gaz anestezisi ve mekanik ventilasyon için bir endotrakeal tüp (20-30 kg hayvan için 6.0-6.5 mm kelepçeli endotrakeal tüp; 30-40 kg için 6.5-7.0 mm kelepçeli) yerleştirin. Gerekirse, etki etmek için intravenöz olarak uygulanan bir doz propofol (0.8-1.66 mg / kg) ile kolaylaştırın.
6. Hayvanı ameliyathaneye taşımadan önce, ameliyat bölgesindeki ve çevresindeki tüyleri makas kullanarak ve ayrıca cerrahi bölgeyi kirli bir şekilde ovalayarak çıkarın.
7. Hayvanı ameliyat masasına aktarın. Ameliyatın başlamasından 10 dakika önce intravenöz olarak ve intraoperatif olarak her 90 dakikada bir sefazolin (20-22 mg / kg) uygulayın. Ameliyatın başlangıcında pantoprazol (0.5-1 mg / kg) intravenöz olarak uygulayın.
8. İnsizyondan önce ilave analjeziyi kolaylaştırmak için lidokain (2 mg / kg'a kadar) ile deri altından lokal bir blok uygulayın.
9. Cerrahi bölgeyi klorheksidin veya betadin ve% 70 etanol veya salin arasında değiştirerek en az üç kez aseptik olarak hazırlayın.
10. Sıvı hacmini, kalp atış hızını, kan basıncını, nabız oksimetresini, kapnografiyi, elektrokardiyografiyi ve rektal sıcaklığı sürekli olarak izleyin. Bu değerleri her 10-15 dakikada bir kaydedin. Hipotermiyi önlemek için ısıtılmış bir gövde altı pedi ve sıcak hava battaniyesi kullanın.
11. Ameliyata başlamadan önce, çene tonusu, palpebral refleks ve önceki adımda listelenen parametrelerin bir kombinasyonunu kullanarak hayvanın uygun cerrahi anestezi düzleminde olduğunu onaylayın.

3. Böbrek toplama prosedürü

1. Bölüm 2'de açıklanan adımları izleyerek hayvanı ameliyata hazırlayın.
2. Cerrahi alanın steril dezenfeksiyonu ve örtülmesinin ardından, her iki böbreğe de optimum erişim sağlamak için medyan laparotomi (25-30 cm) yapın. Standart bir abdominal ekartör yerleştirin.
3. Kolonu ve ince bağırsağı ılık tuzlu suya batırılmış havlularla örtün. Sol böbreğe erişim için bağırsakları sağ tarafa veya sağ böbreğe erişim için sol tarafa geri çekin.
4. Böbreğin üzerindeki peritonu açın ve herhangi bir yapışmayı serbest bırakmak için böbreğin etrafını inceleyin. Üreteri 10-12 cm uzunluk elde edilene kadar diseksiyon yapın.
5. Renal ven ve arteri, sırasıyla inferior vena kava ve aorttan kökenlerine kadar inceleyin.
6. Tam renal diseksiyondan sonra, üreteri distal olarak 2-0 ipek ligatür ile bağlayın ve bağa proksimal olarak kesin. İdrar drenajına izin vermek için proksimal üreter ucunu açık bırakın.
7. Hayvanı intravenöz heparin (100 IU / kg) ile heparinize edin ve böbreğin yeterli heparinizasyonunu sağlamak için 2 dakika bekleyin. Bu adım, her böbreğin rezeksiyonundan önce tekrarlanmalıdır.
8. Renal arter ve renal veni sırasıyla aort ve inferior vena kavaya yakın iki Satinsky vasküler klempi ile klempleyin. Böbrek atardamarını ve toplardamarını klemplere yakın keserek böbrek greftini çıkarın.
9. Renal arteri hemen 3 mm künt uçlu perfüzyon kanülü ile kanül edin. Böbreği buz gibi Wisconsin Üniversitesi (UW) solüsyonu veya Custodiol Histidin-triptofan-ketoglutarat (HTK) koruma solüsyonu ile yıkayın.
10. UW veya HTK ile yıkadıktan sonra perfüzyon kanülünü çıkarın ve böbreği yıkamak için kullanılan aynı buz gibi soğuk koruma solüsyonu ile doldurulmuş steril bir organ torbasına yerleştirin. Bu torbayı ikinci bir steril organ torbasına yerleştirin. Daha sonra organı saklayın veya makine perfüzyonunu başlatın.
11. Renal arter kütüğünü 2-0 ipek ligatür ile bağlayın. Renal ven kütüğünü 6-0 polipropilen içeren iki katmanlı bir koşu ipliği ile kapatın.

4. Kan alımı prosedürü

1. Prosedür terminal ise ve diğer tüm cerrahi müdahaleler yapıldıysa, makine perfüzyonu ve kan kaybı ile ötenazi için kan alımına devam edin.
2. Bağırsakları sağ tarafa çekin ve infrarenal abdominal aortu tanımlayın. Damarı kaplayan büyük yapışıklıkları veya dokuları serbest bırakın.
3. Kan alma torbası iğnesini doğrudan aortun içine yerleştirin. Doldurmayı kolaylaştırmak için torbayı hayvanın altına asın. Torba dolduğunda (yaklaşık 450 mL kan), iğneyi aorttan çıkarın ve delinme bölgesine baskı uygulayın.
4. İkinci bir kan torbası için, yeni iğneyi önceki delinme bölgesine proksimalden 1-2 cm yerleştirin. Gerektiği kadar birden fazla kan torbası ile tekrarlayın, her iğne ile proksimal olarak 1-2 cm hareket edin.
5. Gerekli tüm kan toplandıktan sonra, pentobarbital bileşenin en az 78 mg / kg'lık bir dozunda intravenöz pentobarbital sodyum / fenitoin sodyum enjeksiyonu ile kalp durmasını indükleyin. Pentobarbitalin böbreğin sonraki tahlillerine müdahale edeceği endişesi varsa, anestezi altında domuzlara uygulanırsa alternatif bir kimyasal ötenazi yöntemi olarak potasyum klorür (KCl) (75-100 mg / kg IV) kullanın. Kalp atışı eksikliği, kornea refleksi eksikliği ve vücut ısısında önemli bir azalma ile ölümü doğrulayın.
   NOT: Kurban edilen domuzun kalan organları ve dokusu, 3R prensiplerine uygun olarak başka araştırma veya eğitim amaçları için kullanılabilir.

Sonuçlar

Araştırma grubumuz, hem katı organ nakli hem de vaskülarize kompozit allotransplantasyonun domuz modelleri ile yaklaşık 15 yıla yayılan geniş bir deneyime sahiptir 9,10,11,12,13,14,15,16,17

Tartışmalar

Böbrek nakli için domuz modeli, makine perfüzyon teknolojisinin geliştirilmesi ve optimizasyonu için hayati önem taşımaktadır. İnsan böbreklerine ^6,7,8 anatomik, immünolojik ve patofizyolojik benzerlikler göz önüne alındığında, domuz böbrekleri klinik test ve uygulamaya kolaylaştırılmış bir çeviri sunar.

Domuz bö...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol Solution	Fisher Scientific	04-355-122
Adson Tissue ForceA2:D30ps, 4.75", 1 x 2 Teeth	Wexler Surgical	FL0081.1
Bair Hugger Animal Health Overbody Blanket	3M	53777
Bair Hugger Warming Unit	3M	77500
Balfour Abdominal Retractor w/ Fixed Side Blades, 4" Deep, 10" Maximum Spread	MPM Medical Supply	124-7017
Betadine Solution (5% Providone-iodine)	MWI Animal Health	NDC-67618-155-01
Cefazolin for Injection, USP	MWI Animal Health	NDC-63323-237-10
Chlorhexidine Solution	MWI Animal Health	NDC-30798-624-31
Custodial HTK Organ Preservation Solution	Essential Pharmaceuticals	25767073545
DeBakey Tissue Forceps, 7.75", 2 mm Tips	Wexler Surgical	FL0789.1
EUTHASOL (pentobarbital sodium and phenytoin sodium)	Virbac	NDC-051311-050-01
Heparin Sodium Injection, USP	MWI Animal Health	NDC-71288-402-10
Hot Dog Temperature Management Controller	Augustine Surgical Inc.	WC71V
Hot Dog Veterinary Underbody Warming Mattress	Augustine Surgical Inc.	V106
Invisishield Isolation Bag, 20" x 20"	Medline	DYNJSD1003
Jacobson Micro Needle Holder, Straight Jaws, Round Handle, 7.25"	Wexler Surgical	NL0729.11
Ketamine Hydrochloride Injectable Solution	NexGen Pharmaceuticals	NC-0256
Lap Sponges 18" x 18"	Medline	MDS231318LF
Metzenbaum Dissection Scissors, 7" Curved	Wexler Surgical	SL5011.1S
Non-Conductive Suction Tubing with Scalloped Connectors, 1/4" x 10'	Medline	DYND50251
Pantoprazole Sodium for Injection	MWI Animal Health	NDC-55150-202-00
Perfusion Cannula, Free-Flow, 3 mm Blunt Tip	MED Alliance Solutions	PER-3003S
Rigid Bulb Tip Yankauer	Medline	DYND50130
Satinsky Clamp, 30 mm Angled DeBakey Atraumatic Jaws, Curved Shanks, 10"	Wexler Surgical	AL2150.1
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Servator B UW (University of Wisconsin)	Global Transplant Solutions	JFISERB10A r2
Single Collection Unit Prefilled CPDA-1, 450 mL	Jorgensen Laboratories	JO520
Sofsilk Suture Tie, 2-0, Black, 18"	Covidien	S-195
Surgical Scalpel Blade No. 10	World Precision Instruments	500239
Surgipro II Suture, 6-0, Blue, 30", Double Armed, CV-22 Needle	Covidien	VP-733-X
Three-Quarter Surgical Drape	Medline	DYNJP2414
Valleylab Electrosurgical Pencil with Stainless Steel Electrodes	Covidien	CVNE2516H
Valleylab Force FXc Electrosurgical Generator	Covidien	MFI-MDT-FORCE-FXC
Valleylab Polyhesive Adult Patient Return Electrode	Covidien	E7507-SD
Xylazine Hydrochloride Injectable Solution	NexGen Pharmaceuticals	NC-0334