Aquisição de rim em um modelo animal pré-clínico de grande porte

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo que detalha um modelo cirúrgico para aquisição de rim em um modelo suíno pré-clínico para subsequente perfusão ou transplante por máquina.

Resumo

A perfusão por máquina evoluiu como uma estratégia viável para avaliação, monitoramento, tratamento, otimização de órgãos ex vivo , bem como para prolongar os tempos de preservação. Modelos animais de grande porte têm sido primordiais para o desenvolvimento e otimização dessas tecnologias. No entanto, para garantir a qualidade do enxerto e a reprodutibilidade dos dados, técnicas cirúrgicas padronizadas e clinicamente traduzíveis para a captação de órgãos e tecidos devem ser seguidas. Assim, descrevemos um protocolo otimizado para aquisição de rim em um modelo pré-clínico de suínos. A recuperação renal é realizada usando porcos de raça mista (Yorkshire cross/mix). Resumidamente, após a desinfecção estéril e o drapeado do campo cirúrgico, uma incisão completa na linha média é realizada para obter acesso ideal a ambos os rins. O ureter, a veia renal e a artéria são dissecados até sua origem da veia cava inferior e da aorta, respectivamente. Após a dissecção renal completa, o ureter é amarrado e cortado distalmente. O animal dador é então totalmente heparinizado com 100 UI por kg/peso corporal. Em seguida, a artéria renal é pinçada perto da aorta e a veia renal é pinçada perto da veia cava usando uma pinça vascular de Satinsky. O enxerto renal é então ressecado e a artéria renal é imediatamente canulada na mesa traseira. O rim será então lavado com uma solução de preservação gelada e armazenado no gelo até a perfusão da máquina ou transplante. Finalmente, o coto da artéria renal é ligado com uma ligadura de seda 2-0 e a veia cava é fechada com uma sutura de polipropileno 6-0. Essa técnica recupera rins e simula uma configuração de doador vivo (rim único) ou falecido (rim duplo). A recuperação renal única oferece a vantagem de realizar um autotransplante subsequente. No modelo de doador falecido, o sangue pode ser coletado antes da eutanásia, inserindo agulhas de bolsa de sangue diretamente na aorta, exsanguinando o animal e fornecendo sangue para perfusão ex vivo da máquina.

Introdução

O transplante renal é o tratamento ideal para a doença renal terminal (DRT), proporcionando melhor qualidade de vida e resultados a longo prazo em comparação com a diálise¹. Apesar dos avanços na preservação de órgãos, dezenas de pessoas morrem todos os dias de DRT enquanto estão na lista de espera para um transplante de rim². A perfusão por máquina é um campo em crescimento que aumenta os tempos de preservação, permitindo redes de doadores estendidas e alocação mais eficiente de órgãos. Essa tecnologia também permite o monitoramento e otimização ex vivo de órgãos, minimizando assim os efeitos da lesão de isquemia-reperfusão (IRI). Quando comparada ao armazenamento refrigerado estático (SCS), a perfusão da máquina demonstrou reduzir significativamente a incidência de função tardia do enxerto ^3,4. A perfusão por máquina também demonstrou revitalização de enxertos marginais, que de outra forma não teriam atendido aos critérios para transplante⁵. Apesar dos avanços tecnológicos, a técnica de preservação mais comum continua sendo o SCS no gelo. Outros experimentos e dados pré-clínicos podem ajudar a tornar a perfusão da máquina um dos pilares da preservação do rim.

O modelo suíno para transplante renal está bem estabelecido e tem sido parte integrante do desenvolvimento da tecnologia de preservação renal, especialmente a perfusão por máquina. Ao contrário dos rins unilobulares de roedores, os rins suínos e humanos são multilobulares, semelhantes em tamanho e compartilham anatomia arterial, venosa e urinária análoga ^6,7. Portanto, o rim suíno facilita uma tradução direta para o ambiente clínico, especialmente em termos de dispositivos médicos e terapias medicamentosas. Além disso, os rins suínos apresentam uma fisiopatologia da IRI semelhante à dos rins humanos⁸, tornando-os ideais para estudos de preservação renal.

Para garantir a qualidade do enxerto e a reprodutibilidade dos dados, técnicas cirúrgicas padronizadas e clinicamente traduzíveis para obtenção de órgãos e tecidos devem ser seguidas. Assim, descrevemos um protocolo otimizado para aquisição de rim em um modelo pré-clínico de suínos. Este protocolo permite a recuperação de rins e simula um ambiente de doador vivo (rim único) ou falecido (rim duplo). A recuperação renal única oferece a vantagem de realizar um autotransplante subsequente. No modelo de recuperação renal dupla, a coleta de sangue antes da eutanásia é possível inserindo agulhas de bolsa de sangue diretamente na aorta, exsanguinando o animal e fornecendo sangue para perfusão ex vivo da máquina.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Institucional da Universidade Johns Hopkins, uma instituição credenciada pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), pelo Escritório de Bem-Estar de Animais de Laboratório (OLAW) e pela Associação para Avaliação e Acreditação de Cuidados com Animais de Laboratório (AAALAC). Os animais foram mantidos de acordo com a Lei de Bem-Estar Animal do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e a Política do Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório.

1. Animais e alojamento

1. Use porcos Yorkshire (Sus scrofa domesticus) clinicamente saudáveis de 3 a 6 meses de idade e 20 a 40 kg, ou comparáveis, para este protocolo.
2. Alojar os animais em cercas de arame com piso de ripas.

2. Procedimento pré-operatório e anestesia

1. Jejue o animal pelo menos 12 h antes do tempo de sedação.
2. Administre simeticona oral (20 mg / kg) pelo menos 12 h antes da cirurgia e repita a dosagem pelo menos 1 h antes da sedação para reduzir a dilatação intestinal.
3. Administre cetamina (20-30 mg / kg) e xilazina (2-3 mg / kg) em uma única seringa por via intramuscular para evitar injeções múltiplas.
4. Transfira o porco para a área de estadiamento pré-operatório. Coloque um cateter intravenoso em uma veia marginal da orelha. Administre 3-10 mg/kg/h de solução salina a 0,9% ou solução de Ringer com lactato durante todo o procedimento.
5. Assim que o porco estiver adequadamente sedado, coloque um tubo endotraqueal (tubo endotraqueal com balonete de 6,0-6,5 mm para animais de 20-30 kg; 6,5-7,0 mm com balonete para 30-40 kg) para administração de anestesia gasosa e ventilação mecânica. Se necessário, facilite com uma dose de propofol (0,8-1,66 mg / kg) por via intravenosa, administrada para efeito.
6. Remova os pelos no local da cirurgia e ao redor dele usando uma tesoura, bem como uma esfoliação suja do local da cirurgia, antes de mover o animal para a sala de cirurgia.
7. Transfira o animal para a mesa de operação. Administre cefazolina (20-22 mg/kg) por via intravenosa 10 minutos antes do início da cirurgia e novamente a cada 90 minutos no intraoperatório. Administre pantoprazol (0,5-1 mg / kg) por via intravenosa no início da cirurgia.
8. Administre um bloqueio local por via subcutânea com lidocaína (até 2 mg/kg) para facilitar a analgesia adicional antes da incisão.
9. Prepare assepticamente o local da cirurgia, alternando entre clorexidina ou betadina e etanol ou solução salina a 70%, pelo menos três vezes.
10. Monitore continuamente o volume de fluidos, frequência cardíaca, pressão arterial, oximetria de pulso, capnografia, eletrocardiografia e temperatura retal. Registre esses valores a cada 10-15 minutos. Use uma almofada aquecida na parte inferior da carroceria e um cobertor de ar quente para evitar hipotermia.
11. Antes do início da cirurgia, confirme se o animal está dentro do plano apropriado de anestesia cirúrgica, utilizando uma combinação de tônus da mandíbula, reflexo palpebral e parâmetros listados na etapa anterior.

3. Procedimento de colheita renal

1. Prepare o animal para a cirurgia, seguindo os passos descritos na Secção 2.
2. Após a desinfecção estéril e o drapeado do campo cirúrgico, realize uma laparotomia mediana (25-30 cm) para obter acesso ideal a ambos os rins. Insira um afastador abdominal padrão.
3. Cubra o cólon e o intestino delgado com toalhas embebidas em solução salina morna. Retraia os intestinos para o lado direito para acesso ao rim esquerdo ou para o lado esquerdo para acesso ao rim direito.
4. Abra o peritônio que cobre o rim e disseque ao redor do rim para liberar quaisquer aderências. Disseque o ureter até obter 10-12 cm de comprimento.
5. Dissecar a veia e a artéria renal até sua origem na veia cava inferior e na aorta, respectivamente.
6. Após a dissecção renal completa, amarre o ureter distalmente com ligadura de seda 2-0 e corte proximalmente à gravata. Deixe a extremidade proximal do ureter aberta para permitir a drenagem da urina.
7. Heparinizar o animal com heparina intravenosa (100 UI/kg) e aguardar 2 min para garantir a heparinização adequada do rim. Esta etapa deve ser repetida antes da ressecção de cada rim.
8. Pinçar a artéria renal e a veia renal próximas à aorta e à veia cava inferior, respectivamente, com duas pinças vasculares de Satinsky. Remova o enxerto renal cortando a artéria renal e a veia perto das pinças.
9. Canule imediatamente a artéria renal com uma cânula de perfusão de ponta romba de 3 mm. Lave o rim com solução gelada da Universidade de Wisconsin (UW) ou solução de preservação de Custodiol Histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK).
10. Remova a cânula de perfusão após a lavagem com UW ou HTK e coloque o rim em uma bolsa de órgãos estéril cheia da mesma solução de preservação gelada que foi usada para lavar o rim. Coloque este saco dentro de um segundo saco de órgão estéril. Posteriormente, armazene o órgão ou inicie a perfusão da máquina.
11. Ligue o coto da artéria renal com uma ligadura de seda 2-0. Feche o coto da veia renal com uma sutura contínua de duas camadas com polipropileno 6-0.

4. Procedimento de colheita de sangue

1. Se o procedimento for terminal e todas as outras intervenções cirúrgicas tiverem sido realizadas, prossiga com a coleta de sangue para perfusão mecânica e eutanásia por exsanguinação.
2. Retraia os intestinos para o lado direito e identifique a aorta abdominal infrarrenal. Libere quaisquer aderências grandes ou tecido cobrindo o vaso.
3. Insira a agulha da bolsa de coleta de sangue diretamente na aorta. Pendure o saco abaixo do animal para facilitar o enchimento. Quando a bolsa estiver cheia (aproximadamente 450 mL de sangue), remova a agulha da aorta e mantenha a pressão no local da punção.
4. Para uma segunda bolsa de sangue, insira a nova agulha 1-2 cm proximalmente ao local da punção anterior. Repita com várias bolsas de sangue conforme necessário, movendo-se 1-2 cm proximalmente com cada agulha.
5. Após a coleta de todo o sangue necessário, induza a parada cardíaca com injeção intravenosa de pentobarbital sódico / fenitoína sódica na dose de pelo menos 78 mg / kg do componente pentobarbital. Se houver preocupação de que o pentobarbital interfira nos ensaios subsequentes do rim, use cloreto de potássio (KCl) (75-100 mg / kg IV) como um método alternativo de eutanásia química se for administrado a porcos sob anestesia. Verifique a morte por falta de batimentos cardíacos, ausência de reflexo corneano e diminuição significativa da temperatura corporal.
   NOTA: Os órgãos e tecidos restantes do porco sacrificado podem ser usados para outros fins de pesquisa ou educacionais, em conformidade com os princípios 3R.

Resultados

Nosso grupo de pesquisa tem ampla experiência de quase 15 anos com modelos suínos de transplante de órgãos sólidos e alotransplante composto vascularizado 9,10,11,12,13,14,15,16,17 . ...

Discussão

O modelo suíno para transplante renal tem sido vital para o desenvolvimento e otimização da tecnologia de perfusão por máquina. Dadas as semelhanças anatômicas, imunológicas e fisiopatológicas com os rins humanos ^6,7,8, os rins suínos oferecem uma tradução facilitada para testes clínicos e práticas.

O modelo de aquisição de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol Solution	Fisher Scientific	04-355-122
Adson Tissue ForceA2:D30ps, 4.75", 1 x 2 Teeth	Wexler Surgical	FL0081.1
Bair Hugger Animal Health Overbody Blanket	3M	53777
Bair Hugger Warming Unit	3M	77500
Balfour Abdominal Retractor w/ Fixed Side Blades, 4" Deep, 10" Maximum Spread	MPM Medical Supply	124-7017
Betadine Solution (5% Providone-iodine)	MWI Animal Health	NDC-67618-155-01
Cefazolin for Injection, USP	MWI Animal Health	NDC-63323-237-10
Chlorhexidine Solution	MWI Animal Health	NDC-30798-624-31
Custodial HTK Organ Preservation Solution	Essential Pharmaceuticals	25767073545
DeBakey Tissue Forceps, 7.75", 2 mm Tips	Wexler Surgical	FL0789.1
EUTHASOL (pentobarbital sodium and phenytoin sodium)	Virbac	NDC-051311-050-01
Heparin Sodium Injection, USP	MWI Animal Health	NDC-71288-402-10
Hot Dog Temperature Management Controller	Augustine Surgical Inc.	WC71V
Hot Dog Veterinary Underbody Warming Mattress	Augustine Surgical Inc.	V106
Invisishield Isolation Bag, 20" x 20"	Medline	DYNJSD1003
Jacobson Micro Needle Holder, Straight Jaws, Round Handle, 7.25"	Wexler Surgical	NL0729.11
Ketamine Hydrochloride Injectable Solution	NexGen Pharmaceuticals	NC-0256
Lap Sponges 18" x 18"	Medline	MDS231318LF
Metzenbaum Dissection Scissors, 7" Curved	Wexler Surgical	SL5011.1S
Non-Conductive Suction Tubing with Scalloped Connectors, 1/4" x 10'	Medline	DYND50251
Pantoprazole Sodium for Injection	MWI Animal Health	NDC-55150-202-00
Perfusion Cannula, Free-Flow, 3 mm Blunt Tip	MED Alliance Solutions	PER-3003S
Rigid Bulb Tip Yankauer	Medline	DYND50130
Satinsky Clamp, 30 mm Angled DeBakey Atraumatic Jaws, Curved Shanks, 10"	Wexler Surgical	AL2150.1
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Servator B UW (University of Wisconsin)	Global Transplant Solutions	JFISERB10A r2
Single Collection Unit Prefilled CPDA-1, 450 mL	Jorgensen Laboratories	JO520
Sofsilk Suture Tie, 2-0, Black, 18"	Covidien	S-195
Surgical Scalpel Blade No. 10	World Precision Instruments	500239
Surgipro II Suture, 6-0, Blue, 30", Double Armed, CV-22 Needle	Covidien	VP-733-X
Three-Quarter Surgical Drape	Medline	DYNJP2414
Valleylab Electrosurgical Pencil with Stainless Steel Electrodes	Covidien	CVNE2516H
Valleylab Force FXc Electrosurgical Generator	Covidien	MFI-MDT-FORCE-FXC
Valleylab Polyhesive Adult Patient Return Electrode	Covidien	E7507-SD
Xylazine Hydrochloride Injectable Solution	NexGen Pharmaceuticals	NC-0334