Prélèvement rénal dans un modèle préclinique de grand animal

Résumé

Ici, nous présentons un protocole qui détaille un modèle chirurgical pour l’approvisionnement en reins dans un modèle porcin préclinique pour une perfusion ou une transplantation ultérieure en machine.

Résumé

La perfusion mécanique est devenue une stratégie viable pour l’évaluation, la surveillance, le traitement, l’optimisation des organes ex vivo , ainsi que pour prolonger les temps de conservation. Les grands modèles animaux ont été primordiaux pour le développement et l’optimisation de ces technologies. Cependant, afin de garantir la qualité du greffon et la reproductibilité des données, des techniques chirurgicales standardisées et cliniquement traduisibles pour l’approvisionnement en organes et en tissus doivent être suivies. Ainsi, nous décrivons ici un protocole optimisé pour l’approvisionnement en reins dans un modèle porcin préclinique. La récupération rénale est effectuée à l’aide de porcs de race mixte (croisement Yorkshire/mélange). Brièvement, après la désinfection stérile et le drapage du champ opératoire, une incision médiane complète est pratiquée pour obtenir un accès optimal aux deux reins. L’uretère, la veine rénale et l’artère sont disséqués jusqu’à leur origine de la veine cave inférieure et de l’aorte, respectivement. Après une dissection rénale complète, l’uretère est attaché et coupé distalement. L’animal donneur est ensuite complètement hépariné avec 100 UI par kg/poids corporel. Ensuite, l’artère rénale est clampée près de l’aorte, et la veine rénale est clampée près de la veine cave à l’aide d’une pince vasculaire Satinsky. La greffe rénale est ensuite réséquée et l’artère rénale est immédiatement canulée à l’arrière-table. Le rein sera ensuite rincé avec une solution de conservation glacée et stocké sur de la glace jusqu’à la perfusion en machine ou la transplantation. Enfin, le moignon de l’artère rénale est ligaturé avec une ligature en soie 2-0, et la veine cave est fermée avec une suture en polypropylène 6-0. Cette technique permet de récupérer les reins et de simuler le cas d’un donneur vivant (rein unique) ou décédé (rein double). La récupération d’un seul rein offre l’avantage d’effectuer une autotransplantation ultérieure. Dans le modèle de donneur décédé, le sang peut être prélevé avant l’euthanasie en insérant des aiguilles de poche de sang directement dans l’aorte, exsanguant ainsi l’animal et fournissant du sang pour la perfusion ex vivo de la machine.

Introduction

La transplantation rénale est le traitement optimal de l’insuffisance rénale terminale (IRT), offrant une meilleure qualité de vie et des résultats à long terme par rapport à la dialyse¹. Malgré les progrès réalisés dans le domaine de la préservation des organes, des dizaines de personnes meurent chaque jour d’une IRT alors qu’elles sont sur la liste d’attente pour une greffe de rein². La perfusion mécanique est un domaine en pleine croissance qui augmente les temps de conservation, ce qui permet d’étendre les réseaux de donneurs et d’attribuer plus efficacement les organes. Cette technologie permet également la surveillance et l’optimisation ex vivo des organes, minimisant ainsi les effets des lésions d’ischémie-reperfusion (IRI). Par rapport à l’entreposage frigorifique statique (SCS), il a été démontré que la perfusion par machine réduit considérablement l’incidence du retard de la fonction du greffon ^3,4. La perfusion mécanique a également démontré une revitalisation de greffons marginaux, qui n’auraient autrement pas satisfait aux critères de transplantation⁵. Malgré les progrès technologiques, la technique de conservation la plus courante reste le SCS sur glace. D’autres expériences et données précliniques peuvent aider à faire de la perfusion mécanique un pilier de la préservation des reins.

Le modèle porcin pour la transplantation rénale est bien établi et a fait partie intégrante du développement de la technologie de préservation des reins, en particulier de la perfusion automatique. Contrairement aux reins unilobulaires des rongeurs, les reins porcins et humains sont tous deux multilobulaires, de taille similaire et partagent une anatomie artérielle, veineuse et urinaire analogue ^6,7. Par conséquent, le rein porcin facilite une traduction directe dans le cadre clinique, notamment en termes de dispositifs médicaux et de thérapies médicamenteuses. De plus, les reins porcins présentent une physiopathologie similaire à celle des reins humains⁸, ce qui les rend idéaux pour les études de préservation des reins.

Afin d’assurer la qualité du greffon et la reproductibilité des données, des techniques chirurgicales standardisées et cliniquement traduisibles pour l’obtention d’organes et de tissus doivent être suivies. Ainsi, nous décrivons ici un protocole optimisé pour l’approvisionnement en reins dans un modèle porcin préclinique. Ce protocole permet la récupération des reins et simule le cadre d’un donneur vivant (rein unique) ou décédé (rein double). La récupération d’un seul rein offre l’avantage de réaliser une autotransplantation ultérieure. Dans le modèle de récupération rénale double, il est possible de prélever du sang avant l’euthanasie en insérant des aiguilles de poche de sang directement dans l’aorte, exsanguant ainsi l’animal et fournissant du sang pour la perfusion ex vivo de la machine.

Protocole

Toutes les procédures décrites ont été approuvées par l’Institutional Care and Use Committee de l’Université Johns Hopkins, un établissement agréé par le ministère de l’Agriculture des États-Unis (USDA), assuré par l’Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW) et par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Les animaux ont été entretenus conformément à la loi sur le bien-être des animaux du ministère de l’Agriculture des États-Unis, au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health et à la politique du Service de santé publique des États-Unis sur les soins et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire.

1. Animaux et logement

1. Utilisez des porcs Yorkshire (Sus scrofa domesticus) de 3 à 6 mois, cliniquement sains, de 20 à 40 kg, ou comparables, pour ce protocole.
2. Abritez les animaux dans des clôtures à mailles losangées avec un plancher en caillebotis.

2. Procédure préopératoire et anesthésie

1. Faites jeûner l’animal au moins 12 h avant l’heure de la sédation.
2. Administrer de la siméthicone par voie orale (20 mg/kg) au moins 12 h avant la chirurgie et répéter l’administration au moins 1 h avant la sédation pour réduire la dilatation intestinale.
3. Administrer de la kétamine (20-30 mg/kg) et de la xylazine (2-3 mg/kg) dans une seule seringue par voie intramusculaire pour éviter les injections multiples.
4. Transférez le porc dans la zone de stadification préopératoire. Placez un cathéter intraveineux dans une veine marginale de l’oreille. Administrer 3 à 10 mg/kg/h de solution saline à 0,9 % ou de solution de Ringer lactate tout au long de la procédure.
5. Une fois que le porc est correctement sédatif, placez une sonde endotrachéale (sonde endotrachéale à ballonnet de 6,0 à 6,5 mm pour un animal de 20 à 30 kg ; sonde à ballonnet de 6,5 à 7,0 mm pour un animal de 30 à 40 kg) pour l’administration de l’anesthésie gazeuse et de la ventilation mécanique. Si nécessaire, administrer une dose de propofol (0,8-1,66 mg/kg) par voie intraveineuse, administrée pour faire effet.
6. Retirez les poils sur et autour du site chirurgical à l’aide d’une tondeuse, ainsi qu’un gommage sale du site chirurgical, avant de déplacer l’animal dans la salle d’opération.
7. Transférez l’animal sur la table d’opération. Administrer la céfazoline (20-22 mg/kg) par voie intraveineuse 10 minutes avant le début de la chirurgie et à nouveau toutes les 90 minutes en peropératoire. Administrer du pantoprazole (0,5-1 mg/kg) par voie intraveineuse au début de la chirurgie.
8. Administrer un bloc local par voie sous-cutanée avec de la lidocaïne (jusqu’à 2 mg/kg) pour faciliter l’ajout d’une analgésie avant l’incision.
9. Préparez aseptiquement le site chirurgical, en alternant entre la chlorhexidine ou la bétadine et l’éthanol à 70 % ou le sérum physiologique, au moins trois fois.
10. Surveillez en permanence le volume de liquide, la fréquence cardiaque, la pression artérielle, l’oxymétrie de pouls, la capnographie, l’électrocardiographie et la température rectale. Notez ces valeurs toutes les 10 à 15 minutes. Utilisez un coussin chauffant sous le corps et une couverture d’air chaud pour prévenir l’hypothermie.
11. Avant de commencer la chirurgie, confirmez que l’animal se trouve dans le plan approprié de l’anesthésie chirurgicale en utilisant une combinaison de tonus de la mâchoire, de réflexe palpébral et des paramètres énumérés à l’étape précédente.

3. Procédure de prélèvement des reins

1. Préparez l’animal à la chirurgie en suivant les étapes décrites à la section 2.
2. Après la désinfection stérile et le drapage du champ opératoire, effectuez une laparotomie médiane (25-30 cm) pour obtenir un accès optimal aux deux reins. Insérez un écarteur abdominal standard.
3. Couvrez le côlon et l’intestin grêle avec des serviettes imbibées de solution saline chaude. Rétractez les intestins vers le côté droit pour accéder au rein gauche ou vers le côté gauche pour accéder au rein droit.
4. Ouvrez le péritoine qui recouvre le rein et disséquez autour du rein pour libérer toute adhérence. Disséquez l’uretère jusqu’à l’obtention d’une longueur de 10 à 12 cm.
5. Disséquer la veine rénale et l’artère jusqu’à leur origine de la veine cave inférieure et de l’aorte, respectivement.
6. Après une dissection rénale complète, attachez l’uretère distalement avec une ligature de soie 2-0 et coupez proximal à la légalité. Laissez l’extrémité proximale de l’uretère ouverte pour permettre le drainage de l’urine.
7. Hépariniser l’animal avec de l’héparine intraveineuse (100 UI/kg) et attendre 2 min pour assurer une héparinisation adéquate du rein. Cette étape doit être répétée avant la résection de chaque rein.
8. Clampez l’artère rénale et la veine rénale près de l’aorte et de la veine cave inférieure, respectivement, avec deux clamps vasculaires Satinsky. Retirez le greffon rénal en coupant l’artère rénale et la veine près des pinces.
9. Canuler immédiatement l’artère rénale à l’aide d’une canule de perfusion à bout émoussé de 3 mm. Rincer le rein avec une solution glacée de l’Université du Wisconsin (UW) ou une solution de conservation Custodiol Histidine-tryptophane-cétoglutarate (HTK).
10. Retirez la canule de perfusion après avoir rincé avec UW ou HTK et placez le rein dans un sac d’organe stérile rempli de la même solution de conservation glacée que celle utilisée pour rincer le rein. Placez ce sac dans un deuxième sac d’organe stérile. Par la suite, stockez l’organe ou lancez la perfusion de la machine.
11. Lister le moignon de l’artère rénale avec une ligature de soie 2-0. Fermez le moignon de la veine rénale avec une suture à deux couches en polypropylène 6-0.

4. Procédure de prélèvement sanguin

1. Si l’intervention est terminale et que toutes les autres interventions chirurgicales ont été effectuées, procéder au prélèvement de sang pour la perfusion mécanique et l’euthanasie par exsanguination.
2. Rétractez les intestins vers le côté droit et identifiez l’aorte abdominale infrarénale. Libérez toute grosse adhérence ou tissu recouvrant le vaisseau.
3. Insérez l’aiguille de la poche de prélèvement sanguin directement dans l’aorte. Accrochez le sac sous l’animal pour faciliter le remplissage. Une fois que le sac est plein (environ 450 ml de sang), retirez l’aiguille de l’aorte et maintenez la pression sur le point de ponction.
4. Pour une deuxième poche de sang, insérez la nouvelle aiguille de 1 à 2 cm en proximal du site de ponction précédent. Répétez l’opération avec plusieurs poches de sang au besoin, en vous déplaçant de 1 à 2 cm vers la proximale avec chaque aiguille.
5. Une fois que tout le sang nécessaire a été prélevé, induire un arrêt cardiaque par injection intraveineuse de pentobarbital sodique/phénytoïne sodique à une dose d’au moins 78 mg/kg du composant pentobarbital. Si l’on craint que le pentobarbital n’interfère avec les dosages ultérieurs du rein, utiliser le chlorure de potassium (KCl) (75-100 mg/kg IV) comme méthode d’euthanasie chimique alternative s’il est administré à des porcs sous anesthésie. Vérifiez la mort par manque de rythme cardiaque, absence de réflexe cornéen et une diminution significative de la température corporelle.
   REMARQUE : Les organes et tissus restants du porc sacrifié peuvent être utilisés à d’autres fins de recherche ou d’éducation conformément aux principes des 3R.

Résultats

Notre groupe de recherche possède une vaste expérience de près de 15 ans avec des modèles porcins de transplantation d’organes solides et d’allotransplantation composite vascularisée 9,10,11,12,13,14,15,16,17 ^...

Discussion

Le modèle porcin pour la transplantation rénale a joué un rôle essentiel dans le développement et l’optimisation de la technologie de perfusion automatique. Compte tenu des similitudes anatomiques, immunologiques et physiopathologiques avec les reins humains ^6,7,8, les reins porcins offrent une traduction facilitée aux tests cliniques et à la pratique.

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol Solution	Fisher Scientific	04-355-122
Adson Tissue ForceA2:D30ps, 4.75", 1 x 2 Teeth	Wexler Surgical	FL0081.1
Bair Hugger Animal Health Overbody Blanket	3M	53777
Bair Hugger Warming Unit	3M	77500
Balfour Abdominal Retractor w/ Fixed Side Blades, 4" Deep, 10" Maximum Spread	MPM Medical Supply	124-7017
Betadine Solution (5% Providone-iodine)	MWI Animal Health	NDC-67618-155-01
Cefazolin for Injection, USP	MWI Animal Health	NDC-63323-237-10
Chlorhexidine Solution	MWI Animal Health	NDC-30798-624-31
Custodial HTK Organ Preservation Solution	Essential Pharmaceuticals	25767073545
DeBakey Tissue Forceps, 7.75", 2 mm Tips	Wexler Surgical	FL0789.1
EUTHASOL (pentobarbital sodium and phenytoin sodium)	Virbac	NDC-051311-050-01
Heparin Sodium Injection, USP	MWI Animal Health	NDC-71288-402-10
Hot Dog Temperature Management Controller	Augustine Surgical Inc.	WC71V
Hot Dog Veterinary Underbody Warming Mattress	Augustine Surgical Inc.	V106
Invisishield Isolation Bag, 20" x 20"	Medline	DYNJSD1003
Jacobson Micro Needle Holder, Straight Jaws, Round Handle, 7.25"	Wexler Surgical	NL0729.11
Ketamine Hydrochloride Injectable Solution	NexGen Pharmaceuticals	NC-0256
Lap Sponges 18" x 18"	Medline	MDS231318LF
Metzenbaum Dissection Scissors, 7" Curved	Wexler Surgical	SL5011.1S
Non-Conductive Suction Tubing with Scalloped Connectors, 1/4" x 10'	Medline	DYND50251
Pantoprazole Sodium for Injection	MWI Animal Health	NDC-55150-202-00
Perfusion Cannula, Free-Flow, 3 mm Blunt Tip	MED Alliance Solutions	PER-3003S
Rigid Bulb Tip Yankauer	Medline	DYND50130
Satinsky Clamp, 30 mm Angled DeBakey Atraumatic Jaws, Curved Shanks, 10"	Wexler Surgical	AL2150.1
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Servator B UW (University of Wisconsin)	Global Transplant Solutions	JFISERB10A r2
Single Collection Unit Prefilled CPDA-1, 450 mL	Jorgensen Laboratories	JO520
Sofsilk Suture Tie, 2-0, Black, 18"	Covidien	S-195
Surgical Scalpel Blade No. 10	World Precision Instruments	500239
Surgipro II Suture, 6-0, Blue, 30", Double Armed, CV-22 Needle	Covidien	VP-733-X
Three-Quarter Surgical Drape	Medline	DYNJP2414
Valleylab Electrosurgical Pencil with Stainless Steel Electrodes	Covidien	CVNE2516H
Valleylab Force FXc Electrosurgical Generator	Covidien	MFI-MDT-FORCE-FXC
Valleylab Polyhesive Adult Patient Return Electrode	Covidien	E7507-SD
Xylazine Hydrochloride Injectable Solution	NexGen Pharmaceuticals	NC-0334