Nierenbeschaffung im präklinischen Großtiermodell

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das ein chirurgisches Modell für die Nierenbeschaffung in einem präklinischen Schweinemodell für die anschließende maschinelle Perfusion oder Transplantation beschreibt.

Zusammenfassung

Die maschinelle Perfusion hat sich zu einer praktikablen Strategie für die ex vivo Organbewertung, -überwachung, -behandlung, -optimierung sowie zur Verlängerung der Konservierungszeiten entwickelt. Großtiermodelle waren für die Entwicklung und Optimierung dieser Technologien von größter Bedeutung. Um jedoch die Qualität des Transplantats und die Reproduzierbarkeit der Daten zu gewährleisten, sollten standardisierte und klinisch übertragbare Operationstechniken für die Organ- und Gewebegewinnung befolgt werden. Daher beschreiben wir hier ein optimiertes Protokoll für die Nierenbeschaffung in einem präklinischen Schweinemodell. Die Nierenwiederherstellung wird mit Mischlingsschweinen (Yorkshire-Kreuzung/Mix) durchgeführt. Kurz gesagt, nach der sterilen Desinfektion und Abdeckung des Operationsfeldes wird ein vollständiger Mittellinienschnitt durchgeführt, um einen optimalen Zugang zu beiden Nieren zu erhalten. Der Harnleiter, die Nierenvene und die Arterie werden bis zu ihrem Ursprung aus der Vena cava inferior bzw. der Aorta präpariert. Nach vollständiger Nierendissektion wird der Harnleiter abgebunden und distal durchtrennt. Das Spendertier wird dann mit 100 IE pro kg/Körpergewicht vollständig heparinisiert. Als nächstes wird die Nierenarterie nahe der Aorta und die Nierenvene mit einer Satinsky-Gefäßklemme nahe der Hohlvene geklemmt. Das Nierentransplantat wird dann reseziert und die Nierenarterie wird sofort auf dem Rückentisch kanüliert. Die Niere wird dann mit einer eiskalten Konservierungslösung gespült und bis zur maschinellen Perfusion oder Transplantation auf Eis gelagert. Schließlich wird der Stumpf der Nierenarterie mit einer 2-0-Seidenligatur ligiert und die Hohlvene mit einer 6-0-Polypropylen-Naht verschlossen. Bei dieser Technik werden Nieren wiederhergestellt und entweder eine lebende (Einzelniere) oder eine verstorbene (zwei Nieren) Spendereinstellungen simuliert. Die Wiederherstellung einer einzelnen Niere bietet den Vorteil, eine anschließende Autotransplantation durchzuführen. Im Modell des verstorbenen Spenders kann vor der Euthanasie Blut entnommen werden, indem Blutbeutelnadeln direkt in die Aorta eingeführt werden, wodurch das Tier ausgeblutet und Blut für die ex vivo maschinelle Perfusion bereitgestellt wird.

Einleitung

Die Nierentransplantation ist die optimale Behandlung der Nierenerkrankung im Endstadium und bietet im Vergleich zur Dialyse eine verbesserte Lebensqualität und langfristige Ergebnisse¹. Trotz Fortschritten bei der Organkonservierung sterben jeden Tag Dutzende von Menschen an ESRD, während sie auf der Warteliste für eine Nierentransplantation stehen². Die maschinelle Perfusion ist ein wachsendes Gebiet, das die Konservierungszeiten verlängert und so erweiterte Spendernetzwerke und eine effizientere Organzuteilung ermöglicht. Diese Technologie ermöglicht auch die Ex-vivo-Überwachung und -Optimierung von Organen, wodurch die Auswirkungen von Ischämie-Reperfusionsschäden (IRI) minimiert werden. Im Vergleich zur statischen Kühllagerung (SCS) hat sich gezeigt, dass die maschinelle Perfusion die Inzidenz einer verzögerten Transplantatfunktion signifikant reduziert ^3,4. Die maschinelle Perfusion hat auch eine Revitalisierung von marginalen Transplantaten gezeigt, die sonst die Kriterien für die Transplantation⁵ nicht erfüllt hätten. Trotz technologischer Fortschritte bleibt die gebräuchlichste Konservierungstechnik SCS auf Eis. Weitere präklinische Experimente und Daten können dazu beitragen, die maschinelle Perfusion zu einer tragenden Säule des Nierenerhalts zu machen.

Das Schweinemodell für die Nierentransplantation ist gut etabliert und war ein wesentlicher Bestandteil der Entwicklung der Technologie zur Nierenkonservierung, insbesondere der maschinellen Perfusion. Im Gegensatz zu unilobulären Nagetiernieren sind sowohl die Schweine- als auch die menschliche Niere multilobulär, ähnlich groß und teilen sich eine analoge arterielle, venöse und harnare Anatomie ^6,7. Daher ermöglicht die Schweineniere eine direkte Translation in das klinische Umfeld, insbesondere im Hinblick auf Medizinprodukte und medikamentöse Therapien. Darüber hinaus weisen Schweinenieren eine ähnliche Pathophysiologie der IRI auf wie menschliche Nieren⁸, was sie ideal für Studien zur Nierenkonservierung macht.

Um die Qualität des Transplantats und die Reproduzierbarkeit der Daten zu gewährleisten, sollten standardisierte und klinisch übertragbare Operationstechniken für die Organ- und Gewebegewinnung befolgt werden. Daher beschreiben wir hier ein optimiertes Protokoll für die Nierenbeschaffung in einem präklinischen Schweinemodell. Dieses Protokoll ermöglicht die Genesung von Nieren und simuliert entweder eine lebende (Einzelniere) oder eine verstorbene (zwei Nieren) Spendereinstellungen. Die Wiederherstellung einer einzelnen Niere bietet den Vorteil, dass eine anschließende Autotransplantation durchgeführt werden kann. Beim dualen Nierenwiederherstellungsmodell ist eine Blutentnahme vor der Euthanasie möglich, indem Blutbeutelnadeln direkt in die Aorta eingeführt werden, wodurch das Tier ausgeblutet und Blut für die ex vivo maschinelle Perfusion bereitgestellt wird.

Protokoll

Alle beschriebenen Verfahren wurden vom Institutional Care and Use Committee der Johns Hopkins University, einer vom US-Landwirtschaftsministerium (USDA) lizenzierten Institution, dem Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW) und der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditierten Institution genehmigt. Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit dem Animal Welfare Act des US-Landwirtschaftsministeriums, dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health und der Richtlinie des United States Public Health Service zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren gehalten.

1. Tiere und Unterbringung

1. Verwenden Sie für dieses Protokoll 3-6 Monate alte, klinisch gesunde 20-40 kg schwere Yorkshire-Schweine (Sus scrofa domesticus) oder vergleichbare Schweine.
2. Halten Sie die Tiere in Maschendrahtzäunen mit Spaltenboden.

2. Präoperativer Eingriff und Anästhesie

1. Fasten Sie das Tier mindestens 12 Stunden vor der Sedierungszeit.
2. Verabreichen Sie orales Simethicon (20 mg/kg) mindestens 12 h vor der Operation und wiederholen Sie die Dosierung mindestens 1 h vor der Sedierung, um die Darmerweiterung zu reduzieren.
3. Verabreichen Sie Ketamin (20-30 mg/kg) und Xylazin (2-3 mg/kg) in einer einzigen Spritze intramuskulär, um Mehrfachinjektionen zu vermeiden.
4. Bringen Sie den Molch in den präoperativen Bereitstellungsbereich. Legen Sie einen intravenösen Katheter in eine marginale Ohrvene. Verabreichen Sie während des gesamten Eingriffs 3-10 mg/kg/h 0,9% Kochsalzlösung oder Laktat-Ringer-Lösung.
5. Sobald das Schwein ausreichend sediert ist, legen Sie einen Endotrachealtubus (6,0-6,5 mm Endotrachealtubus mit Cuff für 20-30 kg Tier; 6,5-7,0 mm mit Cuff für 30-40 kg) für die Verabreichung von Gasanästhesie und mechanischer Beatmung an. Falls erforderlich, erleichtern Sie mit einer Dosis Propofol (0,8-1,66 mg/kg) intravenös, die bis zur Wirkung verabreicht wird.
6. Entfernen Sie die Haare auf und um die Operationsstelle herum mit einer Schermaschine sowie ein schmutziges Peeling der Operationsstelle, bevor Sie das Tier in den Operationssaal bringen.
7. Bringen Sie das Tier auf den Operationstisch. Cefazolin (20-22 mg/kg) 10 Minuten vor Beginn der Operation intravenös und intraoperativ alle 90 Minuten verabreichen. Verabreichen Sie Pantoprazol (0,5-1 mg/kg) intravenös zu Beginn der Operation.
8. Verabreichen Sie einen lokalen Block subkutan mit Lidocain (bis zu 2 mg/kg), um eine zusätzliche Analgesie vor der Inzision zu erleichtern.
9. Bereiten Sie die Operationsstelle aseptisch vor, indem Sie mindestens dreimal zwischen Chlorhexidin oder Betadin und 70 % Ethanol oder Kochsalzlösung wechseln.
10. Überwachen Sie kontinuierlich das Flüssigkeitsvolumen, die Herzfrequenz, den Blutdruck, die Pulsoximetrie, die Kapnographie, die Elektrokardiographie und die Rektaltemperatur. Notieren Sie diese Werte alle 10-15 Minuten. Verwenden Sie ein beheiztes Unterbodenpolster und eine Warmluftdecke, um Unterkühlung zu vermeiden.
11. Bestätigen Sie vor Beginn der Operation, dass sich das Tier innerhalb der geeigneten Ebene der chirurgischen Anästhesie befindet, indem Sie eine Kombination aus Kiefertonus, Lidreflex und Parametern verwenden, die im vorherigen Schritt aufgeführt sind.

3. Ablauf der Nierenentnahme

1. Bereiten Sie das Tier für die Operation vor, indem Sie die in Abschnitt 2 beschriebenen Schritte befolgen.
2. Nach der sterilen Desinfektion und Abdeckung des Operationsfeldes wird eine mediane Laparotomie (25-30 cm) durchgeführt, um einen optimalen Zugang zu beiden Nieren zu erhalten. Setzen Sie einen Standard-Bauchretraktor ein.
3. Decken Sie den Dickdarm und den Dünndarm mit in warmer Kochsalzlösung getränkten Handtüchern ab. Ziehen Sie den Darm entweder auf die rechte Seite zurück, um Zugang zur linken Niere zu erhalten, oder zur linken Seite, um Zugang zur rechten Niere zu erhalten.
4. Öffnen Sie das Bauchfell, das über der Niere liegt, und präparieren Sie um die Niere herum, um eventuelle Verwachsungen zu lösen. Präparieren Sie den Harnleiter, bis eine Länge von 10-12 cm erreicht ist.
5. Präparieren Sie die Nierenvene und die Arterie bis zu ihrem Ursprung aus der unteren Hohlvene bzw. der Aorta.
6. Nach vollständiger Nierendissektion den Harnleiter distal mit einer 2-0 Seidenligatur abbinden und proximal zum Krawatte schneiden. Lassen Sie das Ende des proximalen Harnleiters offen, um den Urinabfluss zu ermöglichen.
7. Heparinisieren Sie das Tier mit intravenösem Heparin (100 I.E./kg) und warten Sie 2 Minuten, um eine ausreichende Heparinisierung der Niere sicherzustellen. Dieser Schritt sollte vor der Resektion jeder Niere wiederholt werden.
8. Die Nierenarterie und die Nierenvene in der Nähe der Aorta bzw. der Vena cava inferior mit zwei Satinsky-Gefäßklemmen einklemmen. Entfernen Sie das Nierentransplantat, indem Sie die Nierenarterie und die Vene in der Nähe der Klemmen durchtrennen.
9. Kanülieren Sie die Nierenarterie sofort mit einer 3 mm Perfusionskanüle mit stumpfer Spitze. Spülen Sie die Niere mit eiskalter Lösung der University of Wisconsin (UW) oder Custodiol-Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat (HTK)-Konservierungslösung.
10. Entfernen Sie die Perfusionskanüle nach der Spülung mit UW oder HTK und legen Sie die Niere in einen sterilen Organbeutel, der mit der gleichen eiskalten Konservierungslösung gefüllt ist, die auch für die Spülung der Niere verwendet wurde. Platzieren Sie diesen Beutel in einem zweiten sterilen Organbeutel. Lagern Sie das Organ anschließend ein oder leiten Sie die maschinelle Perfusion ein.
11. Ligatur des Nierenarterstumpfes mit einer 2-0 Seidenligatur. Den Nierenvenenstumpf mit einer zweilagigen Laufnaht aus 6-0 Polypropylen verschließen.

4. Ablauf der Blutentnahme

1. Wenn der Eingriff unheilbar ist und alle anderen chirurgischen Eingriffe durchgeführt wurden, fahren Sie mit der Blutentnahme für die maschinelle Perfusion und der Euthanasie durch Entblutung fort.
2. Ziehen Sie den Darm auf die rechte Seite zurück und identifizieren Sie die infrarenale Bauchschlagader. Befreien Sie große Verwachsungen oder Gewebe, das das Gefäß bedeckt.
3. Führen Sie die Nadel des Blutentnahmebeutels direkt in die Aorta ein. Hängen Sie den Beutel unter das Tier, um das Befüllen zu erleichtern. Sobald der Beutel voll ist (ca. 450 ml Blut), entfernen Sie die Nadel aus der Aorta und halten Sie den Druck auf die Einstichstelle.
4. Für einen zweiten Blutbeutel führen Sie die neue Nadel 1-2 cm proximal zur vorherigen Einstichstelle ein. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf mit mehreren Blutbeuteln und bewegen Sie sich mit jeder Nadel 1-2 cm proximal.
5. Nachdem das gesamte erforderliche Blut entnommen wurde, leiten Sie einen Herzstillstand durch intravenöse Injektion von Pentobarbital-Natrium/Phenytoin-Natrium in einer Dosis von mindestens 78 mg/kg der Pentobarbitalkomponente ein. Wenn die Befürchtung besteht, dass Pentobarbital nachfolgende Tests der Niere beeinträchtigt, verwenden Sie Kaliumchlorid (KCl) (75-100 mg/kg i.v.) als alternative chemische Euthanasiemethode, wenn es Schweinen unter Narkose verabreicht wird. Verifizieren Sie den Tod durch fehlenden Herzschlag, fehlenden Hornhautreflex und eine signifikante Abnahme der Körpertemperatur.
   HINWEIS: Die verbleibenden Organe und Gewebe des getöteten Schweins können unter Beachtung der 3R-Prinzipien für andere Forschungs- oder Bildungszwecke verwendet werden.

Ergebnisse

Unsere Forschungsgruppe verfügt über eine breite Erfahrung von fast 15 Jahren mit Schweinemodellen sowohl für die Transplantation solider Organe als auch für die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation 9,10,11,12,13,14,15,16,17

Diskussion

Das Schweinemodell für die Nierentransplantation war für die Entwicklung und Optimierung der maschinellen Perfusionstechnologie von entscheidender Bedeutung. Angesichts der anatomischen, immunologischen und pathophysiologischen Ähnlichkeiten mit der menschlichen Niere ^6,7,8 bieten Schweinenieren eine erleichterte Translation in die klinische Erprobung und Praxis.

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol Solution	Fisher Scientific	04-355-122
Adson Tissue ForceA2:D30ps, 4.75", 1 x 2 Teeth	Wexler Surgical	FL0081.1
Bair Hugger Animal Health Overbody Blanket	3M	53777
Bair Hugger Warming Unit	3M	77500
Balfour Abdominal Retractor w/ Fixed Side Blades, 4" Deep, 10" Maximum Spread	MPM Medical Supply	124-7017
Betadine Solution (5% Providone-iodine)	MWI Animal Health	NDC-67618-155-01
Cefazolin for Injection, USP	MWI Animal Health	NDC-63323-237-10
Chlorhexidine Solution	MWI Animal Health	NDC-30798-624-31
Custodial HTK Organ Preservation Solution	Essential Pharmaceuticals	25767073545
DeBakey Tissue Forceps, 7.75", 2 mm Tips	Wexler Surgical	FL0789.1
EUTHASOL (pentobarbital sodium and phenytoin sodium)	Virbac	NDC-051311-050-01
Heparin Sodium Injection, USP	MWI Animal Health	NDC-71288-402-10
Hot Dog Temperature Management Controller	Augustine Surgical Inc.	WC71V
Hot Dog Veterinary Underbody Warming Mattress	Augustine Surgical Inc.	V106
Invisishield Isolation Bag, 20" x 20"	Medline	DYNJSD1003
Jacobson Micro Needle Holder, Straight Jaws, Round Handle, 7.25"	Wexler Surgical	NL0729.11
Ketamine Hydrochloride Injectable Solution	NexGen Pharmaceuticals	NC-0256
Lap Sponges 18" x 18"	Medline	MDS231318LF
Metzenbaum Dissection Scissors, 7" Curved	Wexler Surgical	SL5011.1S
Non-Conductive Suction Tubing with Scalloped Connectors, 1/4" x 10'	Medline	DYND50251
Pantoprazole Sodium for Injection	MWI Animal Health	NDC-55150-202-00
Perfusion Cannula, Free-Flow, 3 mm Blunt Tip	MED Alliance Solutions	PER-3003S
Rigid Bulb Tip Yankauer	Medline	DYND50130
Satinsky Clamp, 30 mm Angled DeBakey Atraumatic Jaws, Curved Shanks, 10"	Wexler Surgical	AL2150.1
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Servator B UW (University of Wisconsin)	Global Transplant Solutions	JFISERB10A r2
Single Collection Unit Prefilled CPDA-1, 450 mL	Jorgensen Laboratories	JO520
Sofsilk Suture Tie, 2-0, Black, 18"	Covidien	S-195
Surgical Scalpel Blade No. 10	World Precision Instruments	500239
Surgipro II Suture, 6-0, Blue, 30", Double Armed, CV-22 Needle	Covidien	VP-733-X
Three-Quarter Surgical Drape	Medline	DYNJP2414
Valleylab Electrosurgical Pencil with Stainless Steel Electrodes	Covidien	CVNE2516H
Valleylab Force FXc Electrosurgical Generator	Covidien	MFI-MDT-FORCE-FXC
Valleylab Polyhesive Adult Patient Return Electrode	Covidien	E7507-SD
Xylazine Hydrochloride Injectable Solution	NexGen Pharmaceuticals	NC-0334