Approvvigionamento di rene in un modello preclinico di grandi animali

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo che descrive in dettaglio un modello chirurgico per l'approvvigionamento del rene in un modello suino preclinico per la successiva perfusione meccanica o trapianto.

Abstract

La perfusione meccanica si è evoluta come una strategia praticabile per la valutazione, il monitoraggio, il trattamento, l'ottimizzazione degli organi ex vivo , nonché per prolungare i tempi di conservazione. I modelli di animali di grandi dimensioni sono stati fondamentali per lo sviluppo e l'ottimizzazione di queste tecnologie. Tuttavia, al fine di garantire la qualità dell'innesto e la riproducibilità dei dati, è necessario seguire tecniche chirurgiche standardizzate e clinicamente traducibili per l'approvvigionamento di organi e tessuti. Pertanto, qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per l'approvvigionamento del rene in un modello suino preclinico. Il recupero dei reni viene eseguito utilizzando suini di razza mista (Yorkshire cross/mix). In breve, dopo la disinfezione sterile e il drappeggio del campo chirurgico, viene eseguita un'incisione completa della linea mediana per ottenere un accesso ottimale a entrambi i reni. L'uretere, la vena renale e l'arteria vengono sezionati fino alla loro origine rispettivamente dalla vena cava inferiore e dall'aorta. Dopo la dissezione renale completa, l'uretere viene legato e tagliato distalmente. L'animale donatore viene quindi completamente eparinizzato con 100 UI per kg/peso corporeo. Successivamente, l'arteria renale viene bloccata vicino all'aorta e la vena renale viene bloccata vicino alla vena cava utilizzando una pinza vascolare Satinsky. L'innesto renale viene quindi resecato e l'arteria renale viene immediatamente incannulata sul retro. Il rene verrà quindi lavato con una soluzione di conservazione ghiacciata e conservato su ghiaccio fino alla perfusione meccanica o al trapianto. Infine, il moncone dell'arteria renale viene legato con una legatura di seta 2-0 e la vena cava viene chiusa con una sutura in polipropilene 6-0. Questa tecnica recupera i reni e simula un ambiente di donatore vivente (rene singolo) o deceduto (doppio rene). Il recupero di un singolo rene offre il vantaggio di eseguire un successivo autotrapianto. Nel modello di donatore deceduto, il sangue può essere raccolto prima dell'eutanasia inserendo gli aghi della sacca di sangue direttamente nell'aorta, dissanguando così l'animale e fornendo sangue per la perfusione meccanica ex vivo .

Introduzione

Il trapianto di rene è il trattamento ottimale per la malattia renale allo stadio terminale (ESRD), in quanto fornisce una migliore qualità della vita e risultati a lungo termine rispetto alla dialisi¹. Nonostante i progressi nella conservazione degli organi, dozzine di persone muoiono ogni giorno di ESRD mentre sono in lista d'attesa per un trapianto di rene². La perfusione meccanica è un campo in crescita che aumenta i tempi di conservazione, consentendo reti di donatori estese e un'allocazione più efficiente degli organi. Questa tecnologia consente inoltre il monitoraggio e l'ottimizzazione degli organi ex vivo, riducendo così al minimo gli effetti del danno da ischemia-riperfusione (IRI). Rispetto alle celle frigorifere statiche (SCS), è stato dimostrato che la perfusione meccanica riduce significativamente l'incidenza della funzione ritardata dell'innesto ^3,4. La perfusione meccanica ha anche dimostrato la rivitalizzazione di innesti marginali, che altrimenti non avrebbero soddisfatto i criteri per il trapianto⁵. Nonostante i progressi tecnologici, la tecnica di conservazione più comune rimane l'SCS su ghiaccio. Ulteriori esperimenti e dati preclinici possono contribuire a rendere la perfusione meccanica un pilastro della conservazione dei reni.

Il modello suino per il trapianto di rene è ben consolidato ed è stato parte integrante dello sviluppo della tecnologia di conservazione del rene, in particolare della perfusione meccanica. A differenza dei reni unilobulari dei roditori, i reni suini e umani sono entrambi multilobulari, di dimensioni simili e condividono un'analoga anatomia arteriosa, venosa e urinaria ^6,7. Pertanto, il rene suino facilita una traduzione diretta in ambito clinico, soprattutto in termini di dispositivi medici e terapie farmacologiche. Inoltre, i reni suini mostrano una fisiopatologia simile all'IRI dei reni umani⁸, rendendoli ideali per gli studi di conservazione dei reni.

Al fine di garantire la qualità dell'innesto e la riproducibilità dei dati, è necessario seguire tecniche chirurgiche standardizzate e clinicamente traducibili per l'approvvigionamento di organi e tessuti. Pertanto, qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per l'approvvigionamento del rene in un modello suino preclinico. Questo protocollo consente il recupero dei reni e simula un ambiente di donatore vivente (rene singolo) o deceduto (doppio rene). Il recupero di un singolo rene offre il vantaggio di eseguire un successivo autotrapianto. Nel modello a doppio recupero renale, la raccolta del sangue prima dell'eutanasia è possibile inserendo gli aghi della sacca di sangue direttamente nell'aorta, dissanguando così l'animale e fornendo sangue per la perfusione meccanica ex vivo .

Protocollo

Tutte le procedure descritte sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso istituzionale della Johns Hopkins University, da un Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) autorizzato, dall'Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW) e dall'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Gli animali sono stati mantenuti in conformità con l'Animal Welfare Act del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti, la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e la Politica del Servizio di sanità pubblica degli Stati Uniti sulla cura e l'uso umano degli animali da laboratorio.

1. Animali e stabulazione

1. Per questo protocollo, utilizzare maiali Yorkshire di 3-6 mesi, clinicamente sani e di 20-40 kg (Sus scrofa domesticus), o simili.
2. Ospita gli animali in recinti a maglie di catena con pavimento a doghe.

2. Procedura preoperatoria e anestesia

1. Digiunare l'animale almeno 12 ore prima del tempo di sedazione.
2. Somministrare simeticone orale (20 mg/kg) almeno 12 ore prima dell'intervento chirurgico e ripetere la somministrazione almeno 1 ora prima della sedazione per ridurre la dilatazione intestinale.
3. Somministrare ketamina (20-30 mg/kg) e xilazina (2-3 mg/kg) in un'unica siringa per via intramuscolare per evitare iniezioni multiple.
4. Trasferire il maiale nell'area di stadiazione preoperatoria. Posizionare un catetere endovenoso in una vena marginale dell'orecchio. Somministrare 3-10 mg/kg/h di soluzione salina allo 0,9% o di soluzione di Ringer lattato durante tutta la procedura.
5. Una volta che il suino è stato adeguatamente sedato, posizionare un tubo endotracheale (tubo endotracheale cuffiato da 6,0-6,5 mm per animali da 20-30 kg; cuffiato da 6,5-7,0 mm per 30-40 kg) per l'erogazione dell'anestesia gassosa e della ventilazione meccanica. Se necessario, facilitare con una dose di propofol (0,8-1,66 mg/kg) per via endovenosa, somministrata per effetto.
6. Rimuovere i peli sopra e intorno al sito chirurgico utilizzando un tagliaunghie, nonché uno scrub sporco del sito chirurgico, prima di spostare l'animale in sala operatoria.
7. Trasferire l'animale sul tavolo operatorio. Somministrare cefazolina (20-22 mg/kg) per via endovenosa 10 minuti prima dell'inizio dell'intervento chirurgico e di nuovo ogni 90 minuti durante l'intervento intraoperatorio. Somministrare pantoprazolo (0,5-1 mg/kg) per via endovenosa all'inizio dell'intervento chirurgico.
8. Somministrare un blocco locale per via sottocutanea con lidocaina (fino a 2 mg/kg) per facilitare l'aggiunta di analgesia prima dell'incisione.
9. Preparare asetticamente il sito chirurgico, alternando clorexidina o betadina e etanolo o soluzione fisiologica al 70%, almeno tre volte.
10. Monitora continuamente il volume dei liquidi, la frequenza cardiaca, la pressione sanguigna, la pulsossimetria, la capnografia, l'elettrocardiografia e la temperatura rettale. Registrare questi valori ogni 10-15 minuti. Utilizzare un sottoscocca riscaldato e una coperta ad aria calda per prevenire l'ipotermia.
11. Prima dell'inizio dell'intervento chirurgico, confermare che l'animale si trovi all'interno del piano appropriato dell'anestesia chirurgica utilizzando una combinazione di tono mascellare, riflesso palpebrale e parametri elencati nel passaggio precedente.

3. Procedura di prelievo del rene

1. Preparare l'animale per l'intervento chirurgico, seguendo i passaggi descritti nella Sezione 2.
2. Dopo la disinfezione sterile e il drappeggio del campo chirurgico, eseguire una laparotomia mediana (25-30 cm) per ottenere un accesso ottimale a entrambi i reni. Inserire un divaricatore addominale standard.
3. Copri il colon e l'intestino tenue con asciugamani imbevuti di soluzione salina calda. Ritrarre l'intestino sul lato destro per l'accesso al rene sinistro o sul lato sinistro per l'accesso al rene destro.
4. Aprire il peritoneo sovrastante il rene e sezionarlo intorno al rene per liberare eventuali aderenze. Sezionare l'uretere fino ad ottenere 10-12 cm di lunghezza.
5. Sezionare la vena renale e l'arteria fino alla loro origine rispettivamente dalla vena cava inferiore e dall'aorta.
6. Dopo la dissezione renale completa, legare l'uretere distalmente con una legatura di seta 2-0 e tagliarlo prossimalmente alla legatura. Lasciare aperta l'estremità prossimale dell'uretere per consentire il drenaggio dell'urina.
7. Eparinizzare l'animale con eparina per via endovenosa (100 UI/kg) e attendere 2 minuti per garantire un'adeguata eparinizzazione del rene. Questo passaggio deve essere ripetuto prima della resezione di ciascun rene.
8. Bloccare l'arteria renale e la vena renale vicino all'aorta e alla vena cava inferiore, rispettivamente, con due pinze vascolari Satinsky. Rimuovere l'innesto di rene tagliando l'arteria renale e la vena vicino alle pinze.
9. Incannulare immediatamente l'arteria renale con una cannula di perfusione a punta smussata da 3 mm. Lavare il rene con una soluzione ghiacciata dell'Università del Wisconsin (UW) o con la soluzione di conservazione Custodiol Istidina-triptofano-chetoglutarato (HTK).
10. Rimuovere la cannula di perfusione dopo il lavaggio con UW o HTK e posizionare il rene in una sacca d'organo sterile riempita con la stessa soluzione di conservazione ghiacciata utilizzata per il lavaggio del rene. Posizionare questa sacca all'interno di una seconda sacca sterile per organi. Successivamente conservare l'organo o avviare la perfusione dell'apparecchio.
11. Legare il moncone dell'arteria renale con una legatura di seta 2-0. Chiudere il moncone della vena renale con una sutura a due strati con polipropilene 6-0.

4. Procedura di prelievo del sangue

1. Se la procedura è terminale e tutti gli altri interventi chirurgici sono stati eseguiti, procedere con il prelievo di sangue per la perfusione meccanica e l'eutanasia per dissanguamento.
2. Ritrarre l'intestino sul lato destro e identificare l'aorta addominale infrarenale. Libera eventuali grandi aderenze o tessuto che copre il vaso.
3. Inserire l'ago della sacca di raccolta del sangue direttamente nell'aorta. Appendere il sacchetto sotto l'animale per facilitarne il riempimento. Una volta che la sacca è piena (circa 450 ml di sangue), rimuovere l'ago dall'aorta e mantenere la pressione sul sito di puntura.
4. Per una seconda sacca di sangue, inserire il nuovo ago 1-2 cm prossimalmente al sito di puntura precedente. Ripetere con più sacche di sangue secondo necessità, muovendosi di 1-2 cm prossimalmente con ciascun ago.
5. Dopo che tutto il sangue necessario è stato raccolto, indurre l'arresto cardiaco con iniezione endovenosa di pentobarbital sodico/fenitoina sodica alla dose di almeno 78 mg/kg del componente pentobarbital. Se si teme che il pentobarbital interferisca con i successivi dosaggi del rene, utilizzare il cloruro di potassio (KCl) (75-100 mg/kg EV) come metodo alternativo di eutanasia chimica se viene somministrato ai suini in anestesia. Verificare la morte per mancanza di battito cardiaco, assenza di riflesso corneale e una significativa diminuzione della temperatura corporea.
   NOTA: Gli organi e i tessuti rimanenti del maiale sacrificato possono essere utilizzati per altri scopi di ricerca o educativi in conformità con i principi delle 3R.

Risultati

Il nostro gruppo di ricerca ha una vasta esperienza di quasi 15 anni con modelli suini sia di trapianto di organi solidi che di allotrapianto composito vascolarizzato 9,10,11,12,13,14,15,16,17 ^<...

Discussione

Il modello suino per il trapianto di rene è stato fondamentale per lo sviluppo e l'ottimizzazione della tecnologia di perfusione meccanica. Date le somiglianze anatomiche, immunologiche e fisiopatologiche con i reni umani ^6,7,8, i reni suini offrono una traduzione facilitata ai test clinici e alla pratica.

Il modello di approvvigionamento...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol Solution	Fisher Scientific	04-355-122
Adson Tissue ForceA2:D30ps, 4.75", 1 x 2 Teeth	Wexler Surgical	FL0081.1
Bair Hugger Animal Health Overbody Blanket	3M	53777
Bair Hugger Warming Unit	3M	77500
Balfour Abdominal Retractor w/ Fixed Side Blades, 4" Deep, 10" Maximum Spread	MPM Medical Supply	124-7017
Betadine Solution (5% Providone-iodine)	MWI Animal Health	NDC-67618-155-01
Cefazolin for Injection, USP	MWI Animal Health	NDC-63323-237-10
Chlorhexidine Solution	MWI Animal Health	NDC-30798-624-31
Custodial HTK Organ Preservation Solution	Essential Pharmaceuticals	25767073545
DeBakey Tissue Forceps, 7.75", 2 mm Tips	Wexler Surgical	FL0789.1
EUTHASOL (pentobarbital sodium and phenytoin sodium)	Virbac	NDC-051311-050-01
Heparin Sodium Injection, USP	MWI Animal Health	NDC-71288-402-10
Hot Dog Temperature Management Controller	Augustine Surgical Inc.	WC71V
Hot Dog Veterinary Underbody Warming Mattress	Augustine Surgical Inc.	V106
Invisishield Isolation Bag, 20" x 20"	Medline	DYNJSD1003
Jacobson Micro Needle Holder, Straight Jaws, Round Handle, 7.25"	Wexler Surgical	NL0729.11
Ketamine Hydrochloride Injectable Solution	NexGen Pharmaceuticals	NC-0256
Lap Sponges 18" x 18"	Medline	MDS231318LF
Metzenbaum Dissection Scissors, 7" Curved	Wexler Surgical	SL5011.1S
Non-Conductive Suction Tubing with Scalloped Connectors, 1/4" x 10'	Medline	DYND50251
Pantoprazole Sodium for Injection	MWI Animal Health	NDC-55150-202-00
Perfusion Cannula, Free-Flow, 3 mm Blunt Tip	MED Alliance Solutions	PER-3003S
Rigid Bulb Tip Yankauer	Medline	DYND50130
Satinsky Clamp, 30 mm Angled DeBakey Atraumatic Jaws, Curved Shanks, 10"	Wexler Surgical	AL2150.1
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Servator B UW (University of Wisconsin)	Global Transplant Solutions	JFISERB10A r2
Single Collection Unit Prefilled CPDA-1, 450 mL	Jorgensen Laboratories	JO520
Sofsilk Suture Tie, 2-0, Black, 18"	Covidien	S-195
Surgical Scalpel Blade No. 10	World Precision Instruments	500239
Surgipro II Suture, 6-0, Blue, 30", Double Armed, CV-22 Needle	Covidien	VP-733-X
Three-Quarter Surgical Drape	Medline	DYNJP2414
Valleylab Electrosurgical Pencil with Stainless Steel Electrodes	Covidien	CVNE2516H
Valleylab Force FXc Electrosurgical Generator	Covidien	MFI-MDT-FORCE-FXC
Valleylab Polyhesive Adult Patient Return Electrode	Covidien	E7507-SD
Xylazine Hydrochloride Injectable Solution	NexGen Pharmaceuticals	NC-0334