MEFS I Matrigel: MEFS Durum Pasajlanması hESC

Özet

Bu video fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyici hücreler insan embriyonik kök hücreleri (hESC) nasıl büyümeye göstermektedir. Part 1 3.

Özet

Bu video fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyici hücreler insan embriyonik kök hücreleri (hESC) nasıl büyümeye göstermektedir.

Protokol

Yarma insan embriyonik kök hücreleri (hESC) fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) kaplanmıştır.

Genellikle konfluent hESC plaka özel hESC hattı bağlı, 1:10 1:6 bölünmüş olabilir. Split plaka bölme 5-7 gün sonra tekrar konfluent olacak.

1. Bölme iki gün önce,% 0,1 jelatin çözüm kullanarak plakaları jelatinleştirmeye. 6 plaka için, bir gecede 37 ° C,% 5 CO ₂ doku kültürü inkübatör her iyi ve inkübe plaka içine 2ml ekleyin.
2. Levha MEFS gün jelatinize 6-kuyucuğu bölünmesi üzerine hESC planı önce. (NOT: MEFS 3 gün önceki gerekirse birçok kaplama olması. ~ 3 gün sonra, MEFS düz ve yayılması-dışı fazla ve MEFS. HESC yanı sıra taze sürdürmek değil. Haline..) G-ışınlanmış veya mitomisin bir flakon atın C 37 ° C su banyosunda 2 dakika için sıvı azot ve çözülme, 5-6 x 10 ⁶ hücre içeren, CF1 MEFS tedavi. 50ml şahin tüp sıcak MEF Kültür Medya ile bir kez hücreleri yıkayın ve sıcak MEF Kültür Medya nihai hacmi tekrar süspansiyon haline getirin. 5-6 x 10 ⁶ hücre, bu yeterli plaka, iki ya da üç 6 kuyucuğu .
3. MEFS yıkanmış olmasına rağmen, galveniz plakaları kuyulardan tüm çözüm kaldırmak ve de ortalama MEF Kültür Medya 2.5 ml.
4. Her iyi bir son hacim olarak 3ml ulaşmak için de her MEF süspansiyon 0,5 ml ekleyin. MEFS inkübatör yerleşmek için bir gecede eşit dağınık ve yer plakaları emin olun.
5. HESC bölme gününde, 1mg/ml az <2 hafta eski steril kollajenaz IV çözüm taze hazırlamak veya kullanmayın. HESC kuyulardan bölmek istediğiniz tüm medya çıkarın 2ml ortalama sıcak 1 × PBS, pH 7.4 ile bir kez yıkayın ve kollajenaz IV çözümü 1ml ekleyin. 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe edin. Kuluçka 6-iyi hESC plaka alın ve her bir kuyunun ES medya (bFGF olmadan) 1ml ekleyin. 1 ml pipet ile, her bir kuyu çözümü kullanarak medya emmek ve plaka kök hücreler kapalı darbe. Bu her bir kuyu için yaklaşık 5 ila 10 tekrar alacaktır. Sonra, askıya hESC 50ml şahin tüp içine aktarın. Bölünmüş olan bütün kuyuları için bunu yapın ve bir 50ml şahin tüp birleştirmek. Pelet 5 dakika boyunca 200 gr oda sıcaklığında hESC ve bFGF eksik ES medya ile bir kez yıkayın.
6. HESC yıkanmış edilirken, MEF plakaları almak kuyulardan tüm medyayı çıkartın ve bir kez yıkayın steril, ılık 1 × PBS, pH 7.4 ES medya 2.5 ml (şimdi 10 ng / ml bFGF ile desteklenmiş) başına eklemek iyi.
7. 10 ng bFGF ile desteklenmiş ES medya uygun bir hacim pelet hESC, tekrar (NOT:. HESC yeniden süspanse zaman, kabaca tekdüze koloni boyutu ve şekli olmalıdır tabanda hacmi bölme oranı bağlıdır) pipet hESC süspansiyon yukarı ve aşağı koloniler daha küçük ve daha düzgün yapmak için birkaç kez dikkatlice ama o kadar çok tek hücre ya da çok küçük koloniler üretilir. Her iyi bir son hacim olarak 3 ml ulaşmak için MEF plakaları hESC süspansiyon de ortalama 0,5 ml ekleyin. Görme hESC gecede yerleşmek için inkübatör plakaları yerleştirerek önce eşit olarak dağıtılmış olduğu emin olmak için kontrol edin. Kaplama sonra, genellikle karakteristik şekil ve sınır görünümünü almaya sömürgeler için bir kaç gün sürecektir.

Tartışmalar

Bu video fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyici hücreler insan embriyonik kök hücreleri (hESC) nasıl büyümeye göstermektedir. Kaplama öncesi son adım, hESC yeniden süspanse, kabaca tekdüze koloni boyutu ve şekli olmalıdır. HESC süspansiyon dikkatlice pipet ve bir kaç kez koloniler daha küçük ve daha düzgün yapmak için, ama o kadar çok tek hücre ya da çok küçük koloniler gibi Eki-hESC pluripotency belirteçleri, generated.Immunofluorescence boyama ve mikroskobu veya flow sitometri 4 ve SSEA-4, kültür sıras?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout Serum Replacer (KSR)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828-028
DMEM/F12	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330-057
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140-050
GlutaMax	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	35050-061
DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11995-065
FBS	Reagent	Clontech Laboratories	631107
L-glutamine	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030-081
BME	Reagent	Fisher Scientific	BP176-100
bFGF	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Collagenase IV	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	17104-019
Dispase	Reagent	Stem Cell Technologies	17105-041
Penicillin / Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Gelatin	Reagent	Chemicon International	ES-006-B
Matrigel	Reagent	BD Biosciences	354277
Oct-4 antibody	Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9081
anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3	Reagent	R&D Systems	FAB1435P
FITCI-conjugated antirabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch	715-095-152