Dal MEF per Matrigel I: hESC Passaging in presenza di MEF

Riepilogo

Questo video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) sulle cellule dei fibroblasti del mouse (MEF) le cellule di alimentazione. Parte 1 di 3.

Abstract

Questo video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) sulle cellule dei fibroblasti del mouse (MEF) le cellule di alimentazione.

Protocollo

Dividere le cellule staminali embrionali umane (hESC) placcato al passaggio del mouse fibroblasti embrionali (MEF)

Di solito un piatto hESC confluenti possono essere divisi 1:06-1:10, a seconda della linea hESC particolare. Il piatto sarà diviso confluenti ancora 5-7 giorni dopo la divisione.

1. Due giorni prima della scissione, gelatinizzare piatti utilizzando una soluzione 0,1% di gelatina. Per un 6-pozzetti, aggiungere 2 ml in ogni piatto e incubare a 37 ° C, 5% CO ₂ colture di tessuti incubatore durante la notte.
2. Piastra MEF sul gelatinizzato 6-pozzetti il ​​giorno prima si pensa di dividere la hESC. (NOTA: MEF può essere placcato fino a 3 giorni prima, se necessario, dopo ~ 3 giorni, MEF si appiattiscono e più diffusa-out e non possono sostenere hESC e più fresca MEF può..) Prendere un flacone di g-irradiati o mitomicina C trattati CF1 MEF, contenente 5-6 x 10 ⁶ cellule, da azoto liquido e scongelare per 2 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C. Lavare le cellule una volta con Media caldo Cultura MEF in un tubo da 50 ml falco e risospendere nel volume finale di Media caldo Cultura MEF. A 5-6 x 10 ⁶ cellule, questo è sufficiente per due o tre piastre da 6 pozzetti.
3. Mentre il MEF sono stati lavati, togliere i piatti gelatinizzati, rimuovere tutti soluzione dai pozzetti e aggiungere 2,5 ml di Media Cultura MEF per bene.
4. Aggiungere 0,5 ml di sospensione MEF per bene per ottenere 3 ml come un volume finale di ogni bene. Assicurarsi MEF non è completamente disperso e piastre posto indietro nella notte per risolvere incubatrice.
5. Il giorno della scissione hESC, preparare freschi o utilizzare <2 settimane di età soluzione sterile collagenasi IV a 1mg/ml. Rimuovere tutti i media dai pozzetti hESC si desidera dividere, lavare una volta con 2 ml per pozzetto di caldo 1 × PBS, pH 7,4, e aggiungere 1 ml di soluzione di collagenasi IV. Incubare a 37 ° C per 5-10 min. Prendere il 6-pozzetti hESC fuori dell'incubatore e aggiungere 1 ml di ES media (senza bFGF) in ciascun pozzetto. Utilizzando la soluzione in ogni pozzetto, con una pipetta 1 ml aspirare i media e far saltare le cellule staminali al largo della piastra. Per ogni bene ci vorranno circa 5 a 10 ripetizioni. Poi, il trasferimento hESC sospeso in un tubo da 50 ml falco. Fate questo per tutti i pozzi di essere per tagliare e unire in un unico tubo falcon da 50ml. Agglomerare le hESC a temperatura ambiente a 200 g per 5 minuti e lavare una volta con i media ES manca bFGF.
6. Mentre i hESC vengono lavati, togliere i piatti MEF, rimuovere tutti i supporti dai pozzetti e lavare una volta con sterile, caldo 1 × PBS, pH 7,4 quindi aggiungere 2,5 ml di ES media (ora integrato con 10 ng / ml bFGF) per bene.
7. Risospendere il pellet hESC in un volume adeguato di mezzi di ES, integrato con 10ng/ml bFGF. (NOTA:.. Quando le hESC sono risospesi, dovrebbero essere di dimensioni della colonia o meno uniforme e la forma, il volume risospensione dipende dal rapporto di splittaggio) pipetta con attenzione la sospensione hESC su e giù per un paio di volte a rendere le colonie più piccole e più uniformi, ma non così tanto che le singole cellule o colonie molto piccole sono generati. Aggiungere 0,5 ml di sospensione hESC per bene le piastre MEF per ottenere 3 ml come un volume finale di ogni bene. Controllare visivamente per assicurarsi che le hESC sono distribuiti in modo uniforme prima di mettere le piastre indietro nell'incubatore durante la notte per risolvere. Dopo la placcatura, di solito necessari alcuni giorni per le colonie ad assumere la loro forma caratteristica e l'aspetto di confine.

Discussione

Questo video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) sulle cellule dei fibroblasti del mouse (MEF) le cellule di alimentazione. Nell'ultimo passaggio prima della placcatura, quando le hESC sono risospesi, dovrebbero essere di dimensioni della colonia o meno uniforme e la forma. Con attenzione pipetta la sospensione hESC su e giù per un paio di volte a fare le colonie più piccole e più uniformi, ma non così tanto che le singole cellule o colonie sono molto piccole macchie generated.Immunofluorescence e ci...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout Serum Replacer (KSR)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828-028
DMEM/F12	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330-057
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140-050
GlutaMax	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	35050-061
DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11995-065
FBS	Reagent	Clontech Laboratories	631107
L-glutamine	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030-081
BME	Reagent	Fisher Scientific	BP176-100
bFGF	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Collagenase IV	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	17104-019
Dispase	Reagent	Stem Cell Technologies	17105-041
Penicillin / Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Gelatin	Reagent	Chemicon International	ES-006-B
Matrigel	Reagent	BD Biosciences	354277
Oct-4 antibody	Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9081
anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3	Reagent	R&D Systems	FAB1435P
FITCI-conjugated antirabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch	715-095-152