Von MEFs auf Matrigel I: Die Passage hESCs in Gegenwart von MEFs

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt, wie menschliche embryonale Stammzellen (hES) am embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder-Zellen wachsen.

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt, wie menschliche embryonale Stammzellen (hES) am embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder-Zellen wachsen.

Protokoll

Splitting humanen embryonalen Stammzellen (hES) am embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) ausplattiert

Normalerweise wird eine konfluente hESC Platte kann von 1.06 bis 01.10 Uhr aufgeteilt werden, abhängig von der jeweiligen hESC Linie. Die Split-Platte wird konfluenten wieder 5-7 Tage nach der Trennung.

1. Zwei Tage vor der Spaltung, verkleistern-Platten mit einer 0,1% igen Gelatinelösung. Für eine 6-Well-Platte, fügen 2ml in jede Vertiefung und inkubieren Platte in einem 37 ° C, 5% CO ₂ Gewebekultur-Inkubator über Nacht.
2. Platte MEFs auf verkleistert 6-well Platten am Tag, bevor Sie planen Aufspaltung der HES. (HINWEIS: MEFs können bis zu 3 Tage vorher bei Bedarf beschichtet werden nach ~ 3 Tage, MEFs flacher und spread-out und kann nicht aufrechterhalten hESCs sowie frischer MEFs werden kann..) Nehmen Sie ein Fläschchen mit g-bestrahlt oder Mitomycin C behandelt CF1 MEFs, mit 5-6 x 10 ⁶ Zellen, aus flüssigem Stickstoff und Auftauen für 2 min in einem 37 ° C Wasserbad. Wash Zellen einmal mit warmem MEF Nährmedien in einem 50ml Falcon-Röhrchen und resuspendieren in das endgültige Volumen des warmen MEF Culture Media. Bei 5-6 x 10 ⁶ Zellen, das ist genug, um Platte zwei oder drei 6-well Platten.
3. Während die MEFs gewaschen werden, nehmen Sie die verkleistert Platten, entfernen Sie alle Lösungen aus den Vertiefungen und 2,5 ml des MEF Kultur Medien pro Vertiefung.
4. 0,5 ml Suspension pro MEF gut zu erreichen 3ml als letzte Band in jedes Well. Stellen Sie sicher, MEFs gleichmäßig verteilt sind und legen Platten wieder in den Inkubator über Nacht zu begleichen.
5. Am Tag der hESC Splitting, bereiten Sie frisches oder <2 Wochen alte sterile Kollagenase IV Lösung 1mg/ml. Entfernen Sie alle Medien aus dem Brunnen hESC Sie teilen möchten, einmal abwaschen mit 2ml pro well warm 1 × PBS, pH 7,4, und fügen Sie 1 ml Collagenase IV-Lösung. Bei 37 ° C für 5-10 min. Nehmen Sie die 6-well hESC Platte aus dem Inkubator und 1ml von ES-Medien (ohne bFGF) in jede Vertiefung. Mit der Lösung in jede Vertiefung, mit einer 1 ml Pipette saugen die Medien und blasen die Stammzellen aus der Platte. Für jeden gut das dauert ca. 5 bis 10 Wiederholungen. Dann überweisen Sie den suspendierten hESCs in ein 50ml Falcon-Röhrchen. Tun Sie dies für alle Brunnen, die geteilt und kombinieren in ein 50ml-Falcon-Röhrchen. Pellet der hESCs bei Raumtemperatur bei 200g für 5 min und waschen einmal mit ES Medien fehlt bFGF.
6. Während die hESCs gewaschen werden, nehmen Sie die MEF-Platten, entfernen Sie alle Medien aus dem Brunnen und waschen einmal mit steriler, warm 1 x PBS, pH 7,4 fügen Sie dann 2,5 ml ES Medien (jetzt mit 10 ng / ml bFGF ergänzt) pro gut.
7. Resuspendieren der pelletierten hESCs in einem geeigneten Volumen ES Medien, mit 10ng/ml bFGF ergänzt. (Hinweis:.. Wenn die hESCs resuspendiert sind, sollten sie von rund einheitlichen Kolonie Größe und Form werden die Resuspension Volumen hängt vom Teilungsverhältnis) vorsichtig pipettieren hESC Aufhängung oben und unten ein paar Mal um die Kolonien kleiner und gleichmäßiger, aber nicht so viel, dass einzelne Zellen oder sehr kleine Kolonien erzeugt werden. 0,5 ml Suspension pro hESC gut an die MEF-Platten bis 3 ml als ein Endvolumen in jeder Vertiefung zu erreichen. Sichtprüfung sicherstellen, dass die hESCs gleichmäßig, bevor die Platten wieder in den Inkubator über Nacht absetzen verteilt. Nach dem Plattieren, wird es in der Regel ein paar Tage dauern um die Kolonien auf ihre charakteristische Form und Grenze Aussehen.

Diskussion

Dieses Video zeigt, wie menschliche embryonale Stammzellen (hES) am embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder-Zellen wachsen. In den letzten Schritt vor dem Plattieren, wenn die hESCs resuspendiert sind, sollten sie von rund einheitlichen Kolonie Größe und Form sein. Sorgfältig Pipette die hESC Aufhängung oben und unten ein paar Mal um die Kolonien kleiner und gleichmäßiger, aber nicht so viel, dass einzelne Zellen oder sehr kleine Kolonien generated.Immunofluorescence Färbung und Mikroskopie oder Durchflusszytometrie für hESC Plur...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout Serum Replacer (KSR)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828-028
DMEM/F12	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330-057
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140-050
GlutaMax	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	35050-061
DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11995-065
FBS	Reagent	Clontech Laboratories	631107
L-glutamine	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030-081
BME	Reagent	Fisher Scientific	BP176-100
bFGF	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Collagenase IV	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	17104-019
Dispase	Reagent	Stem Cell Technologies	17105-041
Penicillin / Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Gelatin	Reagent	Chemicon International	ES-006-B
Matrigel	Reagent	BD Biosciences	354277
Oct-4 antibody	Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9081
anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3	Reagent	R&D Systems	FAB1435P
FITCI-conjugated antirabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch	715-095-152