De MEFs para Matrigel I: hESCs Passaging na Presença de MEFs

Resumo

Este vídeo demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em células embrionárias de rato de fibroblastos (MEF) alimentador. Parte 1 de 3.

Resumo

Este vídeo demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em células embrionárias de rato de fibroblastos (MEF) alimentador.

Protocolo

Dividir células estaminais embrionárias humanas (hESCs) semeadas em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs)

Normalmente uma placa CTEh confluentes podem ser divididos 01:06 - 01:10, dependendo da linha CTEh particular. A placa vai se tornar confluentes dividir novamente 5-7 dias após a divisão.

1. Dois dias antes de se separarem, gelatinizar placas usando uma solução 0,1% de gelatina. Para uma placa de 6 poços, adicionar 2 ml em cada placa bem e incubar a 37 ° C, 5% CO ₂ de cultura de tecidos incubadora durante a noite.
2. Placa MEFs em 6-gelatinizado bem pratos do dia antes de o plano de dividir o hESCs. (NOTA: MEFs pode ser banhado até 3 dias antes, se necessário Após a 3 dias, MEFs-se mais planas e mais espalhadas, e não pode sustentar hESCs bem como calouro MEFs pode..) Pegue um frasco de g-irradiado ou mitomicina C tratados CF1 MEFs, contendo 5-6 x 10 ⁶ células, a partir de nitrogênio líquido e descongelamento por 2 min em banho-maria a 37 ° C. Lave as células uma vez com o Media MEF quente Cultura em um tubo falcon de 50ml e ressuspenda no volume final de Meios de Cultura quente MEF. Em 5-6 x 10 ⁶ células, isso é suficiente para placa de duas ou três placas de 6-bem.
3. Enquanto o MEFs estão sendo lavados, retire as placas gelatinizado, remover toda a solução dos poços e adicionar 2,5 ml de Meios de Cultura MEF por poço.
4. Adicionar 0,5 ml de suspensão por poço MEF para alcançar 3ml como um volume final em cada poço. Certifique-se de MEFs são uniformemente dispersas e placas lugar de volta na incubadora durante a noite para resolver.
5. No dia da divisão CTEh, prepare frescos ou use <2 semanas de idade estéril colagenase solução IV em 1mg/ml. Remova toda a mídia dos poços CTEh você quer dividir, lave uma vez com 2 ml por poço de 1 × quente PBS, pH 7,4, e adicionar 1 ml de solução de colagenase IV. Incubar a 37 ° C por 5-10 min. Pegue a placa CTEh 6-bem fora da incubadora e adicionar 1 ml de ES mídia (sem bFGF) a cada poço. Usando a solução em cada poço, com uma pipeta de 1ml sugar até a mídia e soprar as células-tronco fora da placa. Para cada bem isso vai levar cerca de 5 a 10 repetições. Em seguida, transfira a hESCs suspenso em um tubo falcon 50ml. Faça isso para todos os poços, sendo dividido e se combinam em um tubo falcon 50ml. Pellet o hESCs a uma temperatura de 200g por 5 min e lave uma vez com a mídia ES faltando bFGF.
6. Enquanto o hESCs estão sendo lavados, retire as placas MEF, remova toda a mídia dos poços e lavar uma vez com estéril, morna 1 × PBS, pH 7,4, em seguida, adicionar 2,5 ml de ES mídia (agora suplementado com 10 ng / ml bFGF) por também.
7. Ressuspender o hESCs peletizadas em um volume adequado de mídia ES, suplementado com 10ng/ml bFGF. (NOTA:.. Quando o hESCs são ressuspenso, eles devem ser do tamanho das colônias mais ou menos uniforme e forma o volume de ressuspensão depende da relação de divisão) cuidadosamente pipeta suspensão CTEh cima e para baixo algumas vezes para fazer as colônias menores e mais uniformes, mas não tanto que as células individuais ou colônias muito pequenas são gerados. Adicionar 0,5 ml de suspensão CTEh por poço para as placas MEF para atingir 3 ml como volume final em cada poço. Visualmente certifique-se que o hESCs são distribuídas uniformemente, antes de colocar as placas de volta na incubadora durante a noite para resolver. Após o plaqueamento, ele geralmente levam alguns dias para colônias de assumir a sua forma característica e aparência fronteira.

Discussão

Este vídeo demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em células embrionárias de rato de fibroblastos (MEF) alimentador. Na última etapa antes do plaqueamento, quando o hESCs são ressuspenso, eles devem ser do tamanho das colônias mais ou menos uniforme e forma. Pipeta com cuidado a suspensão CTEh cima e para baixo algumas vezes para fazer as colônias menores e mais uniforme, mas não tanto que as células individuais ou colônias são muito pequenas manchas generated.Immunofluorescence e citometria de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout Serum Replacer (KSR)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828-028
DMEM/F12	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330-057
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140-050
GlutaMax	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	35050-061
DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11995-065
FBS	Reagent	Clontech Laboratories	631107
L-glutamine	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030-081
BME	Reagent	Fisher Scientific	BP176-100
bFGF	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Collagenase IV	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	17104-019
Dispase	Reagent	Stem Cell Technologies	17105-041
Penicillin / Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Gelatin	Reagent	Chemicon International	ES-006-B
Matrigel	Reagent	BD Biosciences	354277
Oct-4 antibody	Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9081
anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3	Reagent	R&D Systems	FAB1435P
FITCI-conjugated antirabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch	715-095-152