MEFs부터를 Matrigel하기 : MEFs의 면전에서 Passaging hESCs를

요약

이 동영상은 마우스 배아 fibroblast (MEF) 피더 세포에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다. 3 부 1.

초록

이 동영상은 마우스 배아 fibroblast (MEF) 피더 세포에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

분리 인간의 배아 줄기 세포 (hESCs)는 마우스 배아 섬유아 세포의 (MEFs)에 도금

일반적으로 합류 hESC 접시는 특정 hESC 라인에 따라 1시 10분에서 1시 6분까지을 분할 수 있습니다. 분할 플레이트는 분리 후 다시 5-7일 합류하게 될 것입니다.

1. 분할 이틀 전에는 0.1 % 젤라틴 용액을 사용하여 번호판을 아교 질로 만들다. 6 - 잘 접시, 야간 37 ° C 5 % CO ₂ 조직 문화 인큐베이터의 각 잘하고 품어 플레이트에 2ml를 추가합니다.
2. 플레이트 MEFs는 gelatinized 6 잘 접시에 하루는 분할에 hESCs를 계획하기 전에. (참고 : MEFs 3 일 전에 필요한 경우 많은처럼 도금 수 있습니다 ~ 3 일 후, MEFs은 아첨 확산 아웃 더 MEFs 수 hESCs뿐만 아니라 최신을​​ 유지 수 없습니다된다..) G - 반구 또는 mitomycin의 약병을 가지고 C는 37 ° C의 물 목욕 2 분 액체 질소와 해동에서, 5-6 X 10 ⁶ 세포를 포함, CF1 MEFs 치료. 50ml 팰컨 튜브에 따뜻한 MEF 문화 미디어로 한 번 세포를 씻고 따뜻한 MEF 문화 미디어의 마지막 볼륨 resuspend. 5-6 X 10 ⁶ 세포에서이 정도면 충분 접시 두 개 또는 세 6 - 잘 접시입니다.
3. MEFs 세차되고 있지만, gelatinized 접시를 꺼내 우물에서 모든 솔루션을 제거하고 잘 따라 MEF 문화 미디어 2.5 ML를 추가합니다.
4. 각 우물에 최종 볼륨으로 3ml 달성하기 위해 잘 당 MEF 서스펜션의 0.5 ML를 추가합니다. MEFs가 고르게 정착 하룻밤 인큐베이터에 다시 분산과 장소 플레이트 있는지 확인합니다.
5. hESC 분리의 날, 1mg/ml의 <이주 된 무균 collagenase IV 솔루션을 새로운 준비하거나 사용합니다. 당신은 분할하려는 hESC의 우물에서 모든 미디어를 제거 2ml 당 잘 따뜻한 1 × PBS, pH를 7.4로 한번 씻어 및 collagenase IV 솔루션 1ml 추가할 수 있습니다. 37 ° C 50-10 분 알을 품다. 인큐베이터 밖으로 6 잘 hESC 판을 가지고 각 잘하는 ES 미디어 (bFGF없이)의 1ml를 추가합니다. 1ml 피펫으로 각 우물에 솔루션을 사용하면 미디어를 빨아하고 접시의 줄기 세포를 날려. 각 물론이 약 5-10 반복하게됩니다. 그런 다음, 50ml 팔콘 튜브에 정지 hESCs를 전송합니다. 분할되는 모든 우물에 대해이 작업을 수행 하나 50ml 팔콘 튜브에 결합. 펠렛은 5 분 200g에 실온에서 hESCs와 bFGF를 부족한 ES 매체와 한 번 씻으십시오.
6. hESCs 세차되고 있지만, MEF의 접시를 꺼내 우물에서 모든 미디어를 제거하고 함께 한번 씻어 살균, 따뜻한 1 × PBS, 산도 7.4 다음 ES 미디어 2.5 ML (지금은 10 NG / ML bFGF와 보충) 당을 추가 음.
7. 10ng/ml bFGF와 함께 보충 ES 미디어의 적절한 볼륨에 pelleted hESCs을 Resuspend. (참고 :.. hESCs가 resuspended 때, 그들은 대략 균일한 콜로니 크기와 모양이어야합니다 resuspension 볼륨 분할 비율에 따라 달라집니다) 조심스럽게 피펫은 hESC 중지 위아래로 몇 번 식민지가 더 작고 균일하게하기 위해, 하지만 정말 하나의 셀 또는 아주 작은 식민지가 생성됩니다. 각 우물에 최종 볼륨으로 3 ML을 달성하기 위해 MEF 플레이트에 잘 당 hESC 서스펜션의 0.5 ML를 추가합니다. 시각 hESCs가 밤새 해결하기 위해 인큐베이터에 다시 접시를 삽입하기 전에 균일하게 분산되어 있는지 확인합니다. 도금 후, 일반적으로 그들의 특성 모양과 테두리 모양을 맡을 식민지에 대한 몇 일 소요됩니다.

토론

이 동영상은 마우스 배아 fibroblast (MEF) 피더 세포에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다. 도금 전에 마지막 단계에서 hESCs가 resuspended 때, 그들은 약 균일 콜로니 크기와 모양을해야합니다. 조심스럽게 hESC의 정지를 피펫 아래 몇 번 식민지가 더 작고 균일하게하기 위해,하지만 너무 많은 단일 셀 또는 아주 작은 식민지 같은 월 hESC pluripotency 마커에 대한 generated.Immunofluorescence 염색법과 현미경...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout Serum Replacer (KSR)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828-028
DMEM/F12	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330-057
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140-050
GlutaMax	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	35050-061
DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11995-065
FBS	Reagent	Clontech Laboratories	631107
L-glutamine	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030-081
BME	Reagent	Fisher Scientific	BP176-100
bFGF	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Collagenase IV	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	17104-019
Dispase	Reagent	Stem Cell Technologies	17105-041
Penicillin / Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Gelatin	Reagent	Chemicon International	ES-006-B
Matrigel	Reagent	BD Biosciences	354277
Oct-4 antibody	Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9081
anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3	Reagent	R&D Systems	FAB1435P
FITCI-conjugated antirabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch	715-095-152