Yazarların Dr teşekkür etmek istiyorum. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till Matthew Hsu, Jehangir Mistry ve bu projeler ve protokoller geliştirilmesi sırasında destek Michele Hatler.

Cep Hazırlanışı: <ol><li> Büyüme ortamı içinde tahlil, kültür nöronlar / astrositler hücre ekim öncesinde ~% 70-80 kadar konfluent (hücre çözülme veya izolasyon doğrudan ekim sürece). </li><li> Ilgi hücre tipi için uygun yöntemi ile kültür şişeler / plakaları hücreleri ayırın. Gerekirse, poli-D-lizin veya ekstrasellüler matriks protein ile kat tahlil plaka kuyu hücre yapışmasını geliştirmek için. Astrositler ve nöronlar Co-kültürler, aynı anda veya sırayla numaralı seribaşı olabilir. Sıralı turlar için, &quot;bazal&quot; katmanı olarak ilk astrositler kaplama, gerekirse nöronal kaplama ve farklılaşma takip önerilir. , Hücre tipi, daha sonraki kültür, ilgi parametreleri uygun olarak hücre yoğunluğunu ayarlayın vb kültür yaşına bağlı olarak, hücre kaynağı ve ekim yoğunluğu, birincil kültürlerin çoğalması, GFAP ifade veya neurite akıbet oranı büyük ölçüde değişebilir önemlidir karakterize ve deneysel model için en biyolojik önemi yanı sıra, HCS (bkz. Şekil 1) kullanarak etkili görüntüleme, segmentasyon ve analiz sağlamak için sağlamak için hücre sisteminizi optimize. Plaka (hücrelerin toksin tedavisi kolaylaştırmak için, aşağıda Adım 3 açıklandığı gibi 90 mcL medya numaralı seribaşı olabilir) hücreler ekledikten sonra, hatta hücre dağılımı sağlayarak, plaka, 15-30 dakika süreyle oda sıcaklığında düz bir yüzey üzerinde oturmak için izin verir. Bu dönemin ardından, en az 24 saat inkübe hücreler için büyüme ortamı (37 ° C /% 5 CO 2), daha sonra farklılaşma kültür koşullarına geçiş (örneğin, PC12 hücreleri düşük serum / NGF), uygun şekilde. Hücreleri, hücre tipi için uygun aralıklarla değişen medya, izdiham ya da farklılaşma istenilen seviyeye ulaşıncaya kadar kültür devam edin. </li><li> Hücre tedavileri (kontrol bileşikler, test bileşikleri, vb.) Ilgi tedavi süresi kurs uygun olarak, bu kültürün döneminde herhangi bir noktada tanıtıldı olabilir. Akrilamid, hidrojen peroksit ve K-252a, nörotoksik kontrolü bileşikler olarak verilmektedir. Yeterli reaktifler, beş 96-kuyucuğu yinelenen 12-nokta doz cevap eğrileri (doz cevabı içinde bir dH 2 O veya DMSO kontrol seti de dahil olmak üzere) sağlanır. Bileşikler 250X konsantrasyonu (K-252a için, 1 mcM maksimum tedavi varsayarak) veya 10X (akrilamid ve hidrojen peroksit, sırasıyla 100 mM ve 10 mM, maksimum tedavi varsayarak) verilmektedir. Önerilen tedavi hazırlık yarım günlük içerir: (1 √ 10) Bileşik Sulandırma Tamponu seyreltme tarafından takip DMSO 250X bileşik seri seyreltme, 10X 10X kontrolü bileşikler (dH 2 O menşeli seri steril dH 2 O doğrudan seyreltilmiş olabilir veya Bileşik Sulandırma Tamponu). 10 mcL her tedavinin ardından nihai 1X konsantrasyonu (% 0.4 DMSO veya% 10 dH 2 O) için, her bir kuyunun zaten mevcut kültür ortamı 90 mcL eklenebilir . Örnek veri az 37 ° C fiksasyon için önce 24 ya da 96 saat boyunca bileşik tedavi sağlanır. </li></ol> Hücre Fiksasyon ve Immunofluorescent Boyama: Not: Boyama süresi ~ 2.5 saat sonrası fiksasyon. Kuyu boyama adımları arasında kurumasına izin vermeyin. Aspirasyon ve muafiyet reaktifler, sıvı kayma nedeniyle herhangi bir hücreyi kaybını azaltmak için, düşük akış hızlarında yapılmalıdır. Önerilen tüm birimlerinin yanı başına &#39;96-iyi mikroplak iyi tek bir bakın. Hacimleri &#39;96-plaka başına&#39; tüm önerilen sıvı taşıma hacim kaybı% 25 fazla. Tüm boyama adımları oda sıcaklığında (RT) yapılmaktadır. Tüm tamponları ve antikor çözümleri RT en az 24 saat süreyle stabildir. <ol start="4"><li> Kültür dönemi sonunda, oda sıcaklığında (RT) veya 37 º C ön sıcak HCS Fixation Çözüm (2X) istenirse (12 mL/96-well plaka). De, doğrudan / kültür ortamı kimyasal bir davlumbaz, 100 mcL ekleyin ve 30 dakika oda sıcaklığında düzeltmek için izin. (MSDS) fiksatif / toksin içeren medya çıkarın ve tehlikeli atıkların yönetmeliklere uygun olarak bertaraf. Boyamadan hemen geçmeden, HCS İmmünofloresan Tampon 200 mcL ile iki kez iyice durulayın. Alternatif olarak, plakalar daha sonraki bir zamanda boyanmış isteniyorsa, kuyu ve boyama kadar 4 º C&#39;de sıkıca mühürlenmiş plakları ikinci durulama hacmi bırakın, daha sonra iki kez 200 Wash Buffer mcL ile durulayın. </li><li> Boyamadan önce 4 ° C sabit örnekleri saklanan varsa, 200 mcL HCS İmmünofloresan Tampon boyama protokol ile devam etmeden önce iki kez yıkayın. </li><li> Tavşan anti-βIII tubulin / Fare Anti-GFAP HCS Primer Antikorlar (6 mL/96-well plaka) çözümü şu şekilde hazırlayın: 5.88 mL HCS İmmünofloresan Tampon her çözülmüş birincil antikor 60 mcL ekleyin. İyice karıştırın. Önceki İmmünofloresan Tampon durulama çıkarın. İlköğretim Antikor çözüm iyi 50 mcL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> İlköğretim Antikor çıkarınçözüm. 200 mcL HCS İmmünofloresan Tampon ile üç kez durulayın. </li><li> HCS İkincil Antikor / Hoechst HCS Nükleer Leke (6 mL/96-well plaka) çalışma çözüm aşağıdaki gibi hazırlayın: 30 mcL her çözülmüş ikincil antikor ve çözülmüş Hoechst HCS Nükleer 30 mcL HCS İmmünofloresan Tampon 5.91 mL Leke ekleyin. Çözüm ışıktan korunması, iyice karıştırın. Önceki HCS İmmünofloresan Tampon durulama çıkarın. HCS İkincil Antikor / Hoechst HCS Nükleer Leke çözüm 50 mcL ekleyin ve ışıktan korumalı RT, 1 saat boyunca inkübe edin. </li><li> HCS İkincil Antikor / Hoechst HCS Nükleer Leke çözüm çıkarın. 200 mcL HCS İmmünofloresan Tampon ile iki kez durulayın. </li><li> Önceki HCS İmmünofloresan Tampon durulama çıkarın. Kuyularda ikinci durulama hacmi bırakarak, HCS Yıkama Tamponu 200 mcL ile iki kez durulayın. </li><li> 4 º C&#39;de hemen Seal plaka ve görüntü veya mağaza plaka görüntüleme için hazır olana kadar ışıktan korunmalıdır. </li></ol> Görüntü Alma ve Analiz: <ol start="12"><li> Hücre Analyzer IN (GE Healthcare) dahil olmak üzere mevcut HCS platformlar, ArrayScan (ThermoFisher Bilimsel) veya Opera (Perkin Elmer) çeşitli üzerine lekeli plakaların görüntüleme ve analiz yapılabilir. Görüntüleme ve analiz için bazı kurallar Tablo 1&#39;de verilmiştir: </li></ol><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4"> HCS222 Görüntü Toplama Kuralları </td></tr><tr><td> Algılama Reaktif </td><td> Objektif </td><td> Uyarıcı filtre Aralığı [pik / bant genişliği (nm)] </td><td> Emisyon Filtre Aralığı [tepe / bant genişliği (nm) ] </td></tr><tr><td> Hoechst HCS Nükleer Leke </td><td> 20X </td><td> 360/40 </td><td> 460/40 (veya gerekirse 535 / 50) </td></tr><tr><td> HCS İkincil antikor FITC-Eşek, anti-tavşan IgG </td><td> 20X </td><td> 480/40 </td><td> 535/50 </td></tr><tr><td> HCS İkincil Antikor Cy3-Eşek, anti-fare IgG </td><td> 20X </td><td> 535/50 </td><td> 600/50 </td></tr></tbody></table> <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4" width="545"> HCS222 Görüntü Analiz Rehberi </td></tr><tr><td> Hücre Parametre </td><td> Bulma </td><td> Segmentasyon / Ölçme </td><td> Gerekçe </td></tr><tr><td> Hücre sayısı, Nükleer Özellikleri </td><td> Hoechst HCS Nükleer Leke </td><td> Nükleer bölge (460 nm emisyon kanal). Çekirdeklerin sayısını sayın. DNA içeriği (nükleer yoğunluğu) ya da nükleer alan analizler de mümkündür. </td><td> ΒIII-tubulin veya GFAP ifade ile ilişkili ayrı nöronal ve astrositik hücre sayımı / karakterizasyonları (şiddetle önerilir) elde etmek için bu çekirdekleri &quot;filtre&quot; hücre sayısı, nükleer özellikleri, hücre kaybı, toksisite fenotipleri, vb belirlemek için kullanın. </td></tr><tr><td> βIII tubulin İfade, Neurite akıbet </td><td> HCS İkincil antikor FITC-konjuge </td><td> Sitoplazmik bölgesi (535 nm emisyon kanal). FITC sinyali neurites (örneğin, asgari / ortalama hücre vücut bölgeleri, minimum / maksimum neurite uzunlukları ve genişlikleri ile) nöronal hücre gövdeleri ayırmak için kullanılan olabilir. Toplam neurite uzunluğu, neurite sayar / hücre, vb gibi parametreleri belirleyin </td><td> Neurite akıbet ölçümler nöronal farklılaşma sırasında veya kimyasal yaralanma, hastalık durumları, vb. Bir sonucu olarak modüle olabilir farklı nöronal karakterizasyonu (şiddetle önerilir) elde etmek için βIII-tubulin ekspresyonu ile ilişkili olanlar için &quot;filtre&quot; hücre gövdeleri. </td></tr><tr><td> GFAP İfade, Astrosit Hücre Alanı </td><td> HCS İkincil Antikor, Cy3-konjuge </td><td> Sitoplazmik bölge (600 nm emisyon kanal). Cy3 sinyal astrositik sitoplazmik segmentasyon tanımlamak için kullanılan olabilir. Ortalama sitoplazmik sinyal yoğunluğu, hücre alanı, vs gibi parametreleri belirleyin </td><td> GFAP ifade ve astrosit hücre alanı astrosit gelişimi sırasında ya da kimyasal yaralanma, hastalık durumlarının bir sonucu olarak modüle olabilir, vb hücre gövdeleri farklı astrositik karakterizasyonu (şiddetle önerilir) elde etmek için GFAP ifade ile ilişkili olanlar için &quot;filtre&quot;. </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Resim Alma ve Analiz Yönergeleri - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (Co-Culture) Testi Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/1173/figure31173.png" alt="Şekil 3" /> Şekil 1. βIII-tubulin ve GFAP immunofluorekarışık sıçan sinir hücre kültürleri scence. Birincil sıçan hipokampal nöron veya sıçan PC12 hücreleri ya primer sıçan hipokampal astrositler Co-kültürler nöronal tohumlama kültür birkaç gün ön-kaplama astrositler tarafından üretildi. PC12s farklılaşma koşulları (düşük serum / NGF) altında ek bir 2 gün süreyle kültüre iken primer nöronlar, ek bir 11 gün kültüre edildi. Hücre işleme, fiksasyon ve immün HCS222 tahlil protokollere göre yapılmıştır. Hücreler Hücre Analyzer 1000 (3.3) 20X (primer nöronların) veya 10X (PC12) amacı büyütme IN GE görüntülü ve GE IN Hücre Analyzer 1000 İstasyonu (3.4) Neurite üremeyi ve Çoklu Hedef Analizi algoritmaları kullanılarak analiz Üst panel. Hoechst HCS Leke Nükleer (mavi), βIII-tubulin (yeşil) ve GFAP (kırmızı) floresan Sigortalı görüntüler. (Mavi (birincil nöronların hücre gövdeleri özetlendiği gibi) ve sarı (PC12), yeşil (birincil nöronların) ya da açık mavi (PC12) neurites orta panel) βIII tubulin floresan kanalı ayrı ayrı analiz neurite akıbet segmentasyon için izin verir. GFAP kanal analizi astrosit segmentasyon (yeşil çekirdekleri mavi, sitoplazma ana hatlarıyla alt panel) sağlar. Için ayrı hücre sayımı sağlayan, (kırmızı) (-) birincil sıçan hipokampal nöron / astrosit ortak kültür GFAP segmentasyon çekirdekleri / hücre GFAP (+) (yeşil özetliyor) organları ve GFAP olduğunu ayırt etmek yeteneğini gösteriyor nöronlar ve karışık bir kültür ortamda astrositler. <img src="/files/ftp_upload/1173/figure41173.png" alt="Şekil 4" /> <img src="/files/ftp_upload/1173/figure4.51173.png" alt="Şekil 4 part2" /> Şekil 2. Doz yanıtları birincil sıçan hipokampal nöron / toksik streslere karşı ortak kültürler astrosit. İlköğretim sıçan hipokampal astrositler büyüme ortamı (P6) 96-kuyucuğu kaplama ve 6 gün boyunca kültüre edildi. İlköğretim sıçan hipokampal nöron (çözülme doğrudan) daha sonra ön kaplama astrositler üstüne numaralı seribaşı ve 11 gün boyunca büyüme medyada kültüre edildi. Hücreler seri dilüsyonları kültürünün son 24 saat akrilamid ya da hidrojen peroksit (maksimum konsantrasyonları = 100 mM ve 10mM, sırasıyla) ile tedavi edildi. Hücre işleme, fiksasyon ve immün HCS222 tahlil protokollere göre yapılmıştır. Hücreler Hücre Analyzer 20X (10 alanlar / iyi) 1000 (3.3) GE IN görüntülü ve Hücre Analyzer 1000 İstasyonu (3.4) Neurite üremeyi ve Çoklu Hedef Analizi algoritmaları GE IN (sitoplazmik / / nükleer neurite segmentasyon) analiz edildi. Sunulan veriler ortalama ± SEM, n = 3. Çoklu parametreleri (neurite akıbet, GFAP yoğunluğu, astrosit alan ve nöronal veya astrositik hücre sayımı) doza bağımlı eğilimleri araştırıldı.

<ol>
	<li>Radio, N. M., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+neurotoxicity+testing+in+vitro:+models+for+assessing+chemical+effects+on+neurite+outgrowth.">Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth.</a> Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).</li><li>Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphology-+and+kinetics-based+cascade+for+human+neural+cell+high+content+screening.">A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening.</a> Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).</li><li>Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta(1-42)+reduces+synapse+number+and+inhibits+neurite+outgrowth+in+primary+cortical+and+hippocampal+neurons:+A+quantitative+analysis.">Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis.</a> J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).</li><li>Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+screening+assay+for+chemical+effects+on+proliferation+and+viability+of+immortalized+human+neural+progenitor+cells.">Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells.</a> Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).</li><li>Radio, N. M., Breier, J. M., Shafer, T. J., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+chemical+effects+on+neurite+outgrowth+in+PC12+cells+using+high+content+screening.">Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening.</a> Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).</li><li>Harry, G. J., Tiffany-Castiglioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+neurotoxic+potential+by+use+of+in+vitro+systems.">Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).</li><li>Prockop, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allegory+of+a+mountain:+an+environmental+introduction+to+neurotoxicology.">The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology.</a> J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).</li><li>Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+neurotoxicity+test-system,+using+human+post-mitotic,+astrocytic+and+neuronal+cell+lines+in+co-culture.">Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture.</a> Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).</li><li>Holden, L. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+astrogliotic+responses+of+three+human+astrocytoma+cell+lines+to+ethanol,+trimethyltin+chloride+and+acrylamide.">Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide.</a> Toxicology. 241, 75-83 (2007).</li><li>R&#246;hl, C., Lucius, R., Sievers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+activated+microglia+on+astrogliosis+parameters+in+astrocyte+cultures.">The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures.</a> Brain Res. 1129, 43-52 (2007).</li><li>Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein:+GFAP-thirty-one+years+(1969-2000).">Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000).</a> Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).</li><li>Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+regulates+astrocyte+proliferation+and+reactive+gliosis+via+a+JNK/c-Jun+signaling+pathway.">Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway.</a> J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).</li><li>O'Callaghan, J. P., Sriram, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein+and+related+glial+proteins+as+biomarkers+of+neurotoxicity.">Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity.</a> Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).</li><li>Mead, C., Pentreath, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+toxicity+indicators+in+rat+primary+astrocytes,+C6+glioma+and+human+1321N1+astrocytoma+cells:+can+gliotoxicity+be+distinguished+from+cytotoxicity?.">Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity?.</a> Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).</li><li>Balls, M., Walum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11:+towards+the+acceptance+of+in+vitro+neurotoxicity+tests.">Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests.</a> Neurotoxicology In Vitro. , 269-283 (1999).</li><li>Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+and+environmental+estrogenic+chemicals+exert+developmental+effects+on+rat+hypothalamic+neurons+and+glias.">Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias.</a> Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).</li><li>Weible, M. W., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+neural+stem+cells+from+human+fetal+spinal+cord:+synergistic+effect+of+LIF+and+BMP4+to+generate+astrocytes.">Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes.</a> Glia. 55, 1156-1168 (2007).</li><li>Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+released+by+rat+type+1+astrocytes+exert+different+effects+on+the+proliferation+of+human+neuroblastoma+cells+(SH-SY5Y)+in+vitro.">Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro.</a> Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).</li><li>Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+metabolism+in+brain+metabolic+interaction+between+astrocytes+and+neurons+in+the+defense+against+reactive+oxygen+species.">Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species.</a> Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).</li><li>Crist&#242;fol, R. M., Gass&#243;, S., V&#237;lchez, D., Rodr&#237;guez-Farr&#233;, E., Sanfeliu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxic+effects+of+trimethyltin+and+triethyltin+on+human+fetal+neuron+and+astrocyte+cultures:+a+comparative+study+with+rat+neuronal+cultures+and+human+cell+lines.">Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines.</a> Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).</li></ol>

Yazarlar Millipore Corporation&#39;ın tüm çalışanların.

Bugüne kadar astrositler nöronlar ve karışık kültürlerin kullanıldığı nörotoksisite risk değerlendirme çalışması için tasarlanmış, in vitro deneyler sınırlı kalmıştır. Glial hücreleri nöronlar için mekansal ve metabolik destek sağlayan ayrılmaz bir parçasıdır ve nöronal göç, farklılaşma ve sinaptik aktivite de dahil olmak üzere modüle birçok nöronal fonksiyonları, kritik bir rol oynadığı iyi kabul edilir. Glial astrositler birçok toksinler de nöronal doku çevresindeki olumsuz tepkiler inducing yanı sıra teşvik nöronal hoşgörü yeteneğine sahiptir sitokinler ve diğer çözünür faktörlerin de bırakın. Antioksidan savunma bakım ve hücresel enerji düzeyleri gibi astrositik fonksiyonları, değer düşüklüğü görülmüştür ise nöronal-glial etkileşimleri derinliği gösterilmesi, ko-kültür çalışmaları, astrositler nöronlar oksidatif stres toksisite karşı korumak için gösterilen edilmiştir eleştirel nöronal hayatta kalma etkiler. Son çalışmalar, in vitro nörotoksisite test sistemi bir astrositler kullanımı tek başına nöronal hücrelerin daha insan merkezi sinir sisteminin yapısı ve fonksiyonu için daha uygun ispat edebilir ileri sürmüşlerdir. Nöronal astrositik etkileşimleri fizyolojik önemi artan farkındalık rağmen, daha önce sağlam hücreleri bu etkileşimlerin kantitatif analizleri gerçekleştirmek için zor olmuştur. Yüksek İçerik Tarama gelişiyle yeni ve güçlü testlerinin geliştirilmesi bu adrese sağlar. Bu çalışmada, kantitatif analizleri tek bir tahlil içinde birden çok nöronal ve astrositik fenotipleri HCA ile mümkün olduğunu göstermiştir. Primer nöronlar, nöron sayısı, neurite sayısı ve neurite uzunluk olarak nörotoksisite belirteçlerin kantitatif ölçümler gerçekleştirdik. Astrositler, reaktif gliozis nörotoksisite bilinen bir biyomarker, GFAP ifade astrosit numarası ve astrosit morfolojisi değişiklikler ile karakterizedir. Biz bu uç noktalarının her biri kolay HCA ile değerlendirilebilir göstermiştir. Bu çalışmalar, sinir-özgü biyobelirteçlerin HCA nörotoksik uç noktaları kimyasalların hızla çok sayıda ekrana in vitro testler bir pil parçası olarak kullanılan olabilir bu kavramı destekler . Millipore astrositler nöronlar ve ortak kültür HCS222 Yüksek İçerik Analizi kiti yüksek kaliteli algılama reaktifler ve aynı anda nörotoksisite cep telefonu modelleri çok çeşitli βIII-tubulin ve glial fibriller asidik protein (GFAP) profil için protokolleri oluşur. Bu kit ile sağlanan yüksek geçerliliği reaktifler kullanıcı testleri standardize tahlil-tahlil değişkenliği en aza indirmek ve tekrarlanabilir yüksek bir sinyal-zemin oranı ile görüntü oluşturmak için izin verir.

<table><tbody><tr><td>Rabbit Anti-&amp;#946;III-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X</td><td></td><td>Part No. CS201672</td><td>1 vial containing 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X</td><td></td><td>Part No. CS201649</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X</td><td></td><td>Part No. CS201671</td><td>1 vial containing 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X</td><td></td><td>Part No. CS200437</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst HCS Nuclear Stain, 200X</td><td></td><td>Part No. CS200438</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X</td><td></td><td>Part No. CS200434</td><td>1 bottle containing 100 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Immunofluorescence Buffer, 1X</td><td></td><td>Part No. CS200435</td><td>1 bottle containing 1000 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Wash Buffer, 1X</td><td></td><td>Part No. 2007643</td><td>1 bottle containing 500 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>Acrylamide (Control Compound), 10X</td><td></td><td>Part No. CS201679</td><td>1 vial containing 500 &amp;#x03BC;L of 1M acrylamide in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X</td><td></td><td>Part No. CS201730</td><td>1 vial containing 500 &amp;#x03BC;L of 100 mM hydrogen peroxide in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>K-252a (Control Compound), 250X</td><td></td><td>Part No. CS201741</td><td>1 vial containing 100 &amp;#x03BC;L of 250 &amp;#x03BC;M K-252a in DMSO&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>DMSO for Compound Serial Dilution</td><td></td><td>Part No. CS200441</td><td>1 bottle containing 10 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Compound Dilution Buffer</td><td></td><td>Part No. CS200442</td><td>1 bottle containing 25 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Plate Sealers</td><td></td><td>Part No. CS200443</td><td>10 each&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>tissue culture-treated black/clear bottom microplates </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCS imaging/analysis system</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity

Yüksek İçerik Analizi (HCA) testleri tek bir tahlil içinde birden çok hücre fenotipleri ölçümü sağlayan hücreleri ve algılama reaktifleri otomatik görüntüleme ve güçlü görüntü analizi algoritmaları ile birleştirir. Bu çalışmada, nörotoksisite için yeni bir tahlil geliştirmek için HCA kullandı. Nörotoksisite değerlendirme, önemli bir ilaç güvenliği değerlendirmesi bir parçası olarak, çevre koruma çabalarının önemli bir odak olmanın yanı sıra temsil eder. Ayrıca, nörotoksisite de iyi kabul edilir<em&gt; In vitro</emAlzheimer ve Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların gelişimi&gt; belirteç. Son zamanlarda, HCA nöronal tarama uygulaması bildirilmiştir. ΒIII-tubulin nöronal hücrelerin etiketleme, HCA deneyleri nöron sayısı, neurite sayısı ve neurite uzunluğu, nörotoksik etkileri olduğunu göstermemektedir bütün bunlar gibi parametrelerin yüksek verimli olmayan öznel, nicel ölçümleri sağlayabilir. Ancak, astrositler rolü bu modellerin keşfedilmemiş kalır. Astrositler, merkezi sinir sistemi (MSS) homeostazının bakım tamamlayıcı bir rol var ve bunlar toksik maddeler veya hastalık durumlarında tepki aktive nöro ve neurodegradation ile ilişkilidir. GFAP CNS astrositler ağırlıklı olarak ifade bir ara filament proteindir. Astrositik aktivasyonu (gliozis) yaygın astrosit proliferasyon ve hipertrofi eşlik GFAP upregülasyonunun yol açar. Reaktif gliozis Bu işlem, sinir sistemi hasarı erken belirteci olarak öne sürülmüştür. Immunoassay ile GFAP kantitatif için geleneksel yöntem. Bu yaklaşım, hücresel lokalizasyonu, morfolojisi ve hücre sayısı hakkında bilgi sağlamak için bir yetersizlik ile sınırlıdır. Biz HCA bu sınırlamaları aşmak için, ve aynı anda birden çok özellik gliozis ile ilişkili ölçmek için kullanılan olabilir tespit GFAP ifade değişiklikleri, astrosit hipertrofisi ve astrosit proliferasyonu - tek bir tahlil içinde. Ko-kültür çalışmaları, astrositler nöronlar çeşitli toksik hakaret karşı korumak ve eleştirel nöronal hayatta kalma etkisi görülmüştür. Son çalışmalar önerilen olduğunu bir astrositler kullanımı<em&gt; In vitro</em&gt; Nörotoksisite test sistemi sadece nöronal hücrelerin daha insan MSS yapısı ve fonksiyonu için daha uygun ispat edebilir. ΒIII-tubulin ve glial fibriller asidik protein (GFAP) profil Dolayısıyla, biz, bir HCA testi astrositler nöronlar ve ortak kültürü için geliştirilen protokolleri oluşan ve valide, hedef özel algılama reaktifleri. Bu testte, nörotoksisite değerlendirmesi olmayan öznel, yüksek verimli test bir roman temsil nörotoksisite aynı anda analiz, neurite akıbet, gliozis, cep modelleri çok çeşitli nöronal ve astrositik morfoloji ve nöronal ve astrositik gelişim sağlar. Testi, nörolojik araştırma ve ilaç keşfi nörotoksisite ve geliştirilmiş verimlilik gelişmiş algılama için büyük bir potansiyele sahiptir.

Watch this Scientific Journal Video about A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity at JoVE.com

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Bu makale, bir roman protokol ve reaktif bileşikler ve tedavilerin yüksek içerik analizi kullanarak nöronlar ve astrositler ortak kültürleri üzerinde nörotoksik etkileri hassas ölçümü için tasarlanmıştır ayarlamak açıklamaktadır. Sonuçlar yüksek bir içerik analizi nörotoksisite değerlendirmesi için heyecan verici yeni bir teknoloji temsil ettiğini göstermektedir.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

a-neuronal-astrocyte-co-culture-assay-for-high-content-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

25.1K Görüntüleme.  Millipore Inc.  日本語 

Video: A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is very poor 1. The failure of axon regeneration is a combined result of several factors including the hostile glial cell environment, inhibitory myelin related molecules and decreased intrinsic neuron regenerative capacity 2. Astrocytes are the most predominant glial cell type in central nervous system and play important role in axon functions under physiology and pathology conditions 3. Contrast to the homologous oligodendrocytes, astrocytes are a heterogeneous cell population composed by different astrocyte subpopulations with diverse morphologies and gene expression 4. The functional significance of this heterogeneity, such as their influences on axon growth, is largely unknown.
To study the glial cell, especially the function of astrocyte heterogeneity in neuron behavior, we established a new method by co-culturing high purified dorsal root ganglia neurons with glial cells obtained from the rat cortex. By this technique, we were able to directly compare neuron adhesion and axon growth on different astrocytes subpopulations under the same condition.
In this report, we give the detailed protocol of this method for astrocytes isolation and culture, dorsal root ganglia neurons isolation and purification, and the co-culture of DRG neurons with astrocytes. This method could also be extended to other brain regions to study cellular or regional specific interaction between neurons and glial cells.

In this protocol, we described a new method to study the influence of glial cell heterogeneity on axon growth with an in vitro co-culture system. Rat cortical glial cells were cultured to confluence and cocultured with highly purified rat dorsal root ganglia neurons. Different glial cell influence on neurons adhesion and axon growth was compared directly in the same culture. This method provides a new way to directly study the glial cell heterogeneity influence on neuron adhesion and axon growth.

Axon Büyüme, Yeni Bir Coculture Yöntemle Çalışması Glial Hücre heterojenite Etkisi

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

Nörobilim

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

Çok bölmesi MSS Nöron glia Co-kültür mikroakışkan Platformu

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Biyoloji

A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides reliable analysis of neuronal morphology together with quantitative measurements of modifications on neurite length and synaptic protein localization and abundance upon treatment with small molecule compounds. In addition to the application of the presented method in neurite outgrowth studies, neurotoxicity assessment can be performed to assess, distinguish and rank commercial chemical compounds based on their potential developmental neurotoxicity effect.
Even though cell lines are nowadays widely used in compound screening assays in neuroscience, they often differ genetically and phenotypically from their tissue origin. Primary cells, on the other hand, maintain important markers and functions observed in vivo. Therefore, due to the translation potential and physiological relevance that these cells could offer neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment can considerably benefit from using human neural progenitor cells (hNPCs) as the primary human cell model.
The presented method herein can be utilized to screen for the ability of compounds to induce neurite outgrowth and neurotoxicity by taking advantage of the human neural progenitor cell-derived neurons, a cell model closely representing human biology.&#34;

The presented protocol describes a method for a neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment of small molecule compounds.

İnsan Nöral Progenitor Hücre Kaynaklı Nöronlar ile Bir Neurite Outgrowth Assa ve Nörotoksisite Değerlendirmesi

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides ...

Gelişim Biyolojisi

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to study the process of neuronal survival upon cytotoxic stress. Most methods are based on biochemical approaches that do not allow single-cell resolution or involve complex and costly methodologies. Presented here is a versatile, inexpensive, and effective experimental paradigm to study neuronal survival. This method takes advantage of sparse fluorescent labeling of the neurons followed by live imaging and automated quantification. To this aim, the neurons are electroporated to express fluorescent markers and co-cultured with non-electroporated neurons to easily regulate cell density and increase survival. 
Sparse labeling by electroporation allows a simple and robust automated quantification. In addition, fluorescent labeling can be combined with the co-expression of a gene of interest to study specific molecular pathways. Here, we present a model of stroke as a neurotoxic model, namely, the oxygen-glucose deprivation (OGD) assay, which was performed in an affordable and robust homemade hypoxic chamber. Finally, two different workflows are described using IN Cell Analyzer 2200 or the open-source ImageJ for image analysis for semi-automatic data processing. This workflow can be easily adapted to different experimental models of toxicity and scaled up for high-throughput screening. In conclusion, the described protocol provides an approachable, affordable, and effective in vitro model of neurotoxicity, which can be suitable for testing the roles of specific genes and pathways in live imaging and for high-throughput drug screening.

Here, we present a simple, potent, and versatile methodology to investigate neuronal survival upon cytotoxic stress in primary cortical neurons with cellular resolution in real time or in fixed material.

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to ...

 CNS Etkileşim Çalışmaları için Primer Mikroglia ve Nöron Ko-Kültür Protokolü

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

Yazar Spotlight: Hastalık Koşullarında Mikroglia-Nöronal Etkileşimleri İncelemek için İn Vitro Ko-Kültür Modeli

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

Transkript

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Axon Büyüme, Yeni Bir Coculture Yöntemle Çalışması Glial Hücre heterojenite Etkisi

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Çok bölmesi MSS Nöron glia Co-kültür mikroakışkan Platformu

İnsan Nöral Progenitor Hücre Kaynaklı Nöronlar ile Bir Neurite Outgrowth Assa ve Nörotoksisite Değerlendirmesi

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir

İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi