Os autores gostariam de agradecer as Dras. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till, Matthew Hsu, Jehangir Mistry e Michele Hatler de apoio durante o desenvolvimento desses projetos e protocolos.

Preparação de células: <ol><li> Antes da semeadura de células para o ensaio, a cultura de neurônios / astrócitos em meios de crescimento até confluentes ~ 70-80% (a menos de células semeadura diretamente do degelo ou isolamento). </li><li> Separar as células dos frascos de cultura / placas através do método apropriado para o tipo de células de interesse. Se necessário, os poços casaco ensaio de placa com poli-D-lisina ou proteína de matriz extracelular para melhorar a adesão celular. Co-culturas de astrócitos e neurônios pode ser semeado simultaneamente ou seqüencialmente. Para seedings seqüencial, chapeamento de astrócitos primeiro como uma camada de &quot;basal&quot; é recomendado, seguido por plaqueamento neuronal e diferenciação, se necessário. Ajustar a densidade de células, conforme apropriado para o tipo de célula, o tempo da cultura subseqüente, os parâmetros de interesse, etc Dependendo da idade da cultura, fonte de células e densidade de semeadura, culturas primárias podem variar muito em taxa de proliferação, GFAP expressão ou crescimento de neuritos - é importante caracterizar e otimizar seu sistema de célula para fornecer a relevância biológica mais para o seu modelo experimental, bem como para fornecer para geração de imagens eficaz, segmentação e análise usando HCS (ver Figura 1). Depois de adicionar células a placa (células podem ser semeadas em 90 mL de mídia, para facilitar o tratamento com toxina, como descrito no Passo 3 abaixo), permitir que a placa se sentar sobre uma superfície plana em temperatura ambiente por 15-30 min, permitindo distribuição uniforme de células. Após este período, as células se desenvolvem em meios de crescimento (37 ° C / 5% CO 2) por pelo menos 24 horas, em seguida, mudar as condições de cultura de diferenciação (por exemplo, soro baixo / NGF de PC12 células), conforme o caso. Continue cultura até atingir o nível desejado células de confluência ou diferenciação, mudando media em intervalos apropriados para o tipo de célula. </li><li> Tratamentos com células (compostos de controle, compostos de teste, etc) pode ser introduzido em qualquer momento durante este período da cultura, conforme apropriado para o tempo-curso de tratamento de interesse. Acrilamida, peróxido de hidrogênio e K-252 são fornecidas como compostos neurotóxicos controle. Reagentes suficientes são fornecidos para duplicar de 12 pontos curvas dose-resposta (incluindo uma dH 2 O DMSO ou de controle situado no dose-resposta) para todas as cinco placas de 96 poços. Os compostos são fornecidos em concentração 250X (para K-252a, assumindo um tratamento máximo de 1 mM) ou 10X (para acrilamida e peróxido de hidrogênio, supondo que tratamentos máximo de 100 mm e 10 mm, respectivamente). Preparação tratamento recomendado envolve meia-log (1: √ 10) diluição em série do composto 250X em DMSO, seguido de diluição em tampão de diluição Composto de 10X (compostos controle 10X originários de dH 2 O pode ser serialmente diluída diretamente em dH 2 O estéril ou tampão de diluição Compound). 10 L de cada tratamento podem então ser adicionados ao mL 90 de meios de cultura já está presente em cada poço, para uma concentração final de 1X (0,4% DMSO ou 10% dH 2 O). De dados de exemplo é fornecido por 24 ou 96 horas de tratamento composto de 37 ° C antes da fixação. </li></ol> Fixação de células e coloração de imunofluorescência: Nota: O tempo de coloração é de aproximadamente 2,5 horas pós-fixação. Não permitir que os poços a secar entre as etapas de coloração. Aspiração e dispensação de reagentes devem ser realizadas a taxas de fluxo baixo para diminuir a perda de células devido ao cisalhamento de fluidos. Todos os recomendados &quot;por bem&quot; volumes referem-se a um único poço de uma microplaca de 96 poços. Todos os recomendados &#39;por 96 poços da placa&#39; volumes incluem excesso de 25% as perdas de líquido manipulação de volume. Todas as etapas são realizadas coloração à temperatura ambiente (RT). Todos os tampões e soluções de anticorpos são estáveis ​​por pelo menos 24 horas à temperatura ambiente. <ol start="4"><li> No final do período de cultivo, pré-aquecido solução de fixação HCS (2X) a temperatura ambiente (RT) ou 37 º C, se desejar (12 placa mL/96-well). Em uma Cobertura de vapores químicos, adicionar 100 mL / poço diretamente para meios de cultura e permitir que a correção para 30 min em temperatura ambiente. Remover fixador / toxina contendo mídia e eliminar de acordo com os regulamentos para resíduos perigosos (ver MSDS). Se proceder imediatamente à coloração, lavar cada poço duas vezes com 200 mL de tampão de imunofluorescência HCS. Alternativamente, se as placas devem ser manchado em um momento posterior, lavar duas vezes com 200 mL de tampão de lavagem, enxágüe em seguida, deixar o volume segundo em poços e as placas loja hermeticamente fechado a 4 º C até coloração. </li><li> Se as amostras fixas foram armazenadas a 4 º C antes da coloração, lavar duas vezes com 200 mL de buffer HCS Imunofluorescência antes de prosseguir com protocolo de coloração. </li><li> Prepare solução de trabalho de Coelho Anti-βIII tubulina / Mouse Anticorpos Anti-GFAP HCS primária (6 placa mL/96-well) como segue: Adicionar 60 mL de cada anticorpo primário para 5,88 descongelado mL de tampão de imunofluorescência HCS. Misture bem. Remover o tampão de imunofluorescência anterior enxaguar. Adicionar 50 mL de solução de anticorpo primário a cada poço e incubar por 1 hora em temperatura ambiente. </li><li> Remover o anticorpo primáriosolução. Enxaguar três vezes com 200 mL de buffer de imunofluorescência HCS. </li><li> Preparar a solução de trabalho de HCS Anticorpo secundário / HCS Hoechst Nuclear Stain (6 placa mL/96-well) como segue: Adicionar 30 mL de cada anticorpo secundário descongelados e 30 mL de descongelado Hoechst HCS Nuclear Stain para 5,91 mL de tampão de imunofluorescência HCS. Misture bem, protegendo solução da luz. Remover anterior HCS buffer de imunofluorescência enxaguar. Adicionar 50 mL de HCS Anticorpo secundário / HCS Hoechst solução Nuclear Stain e incubar por 1 hora a RT, protegido da luz. </li><li> Remover HCS Secundária Antibody / Hoechst HCS solução Nuclear Stain. Enxágüe duas vezes com 200 mL de buffer de imunofluorescência HCS. </li><li> Remover anterior HCS buffer de imunofluorescência enxaguar. Enxágüe duas vezes com 200 mL de tampão de lavagem HCS, deixando o volume enxágüe segundo poços. </li><li> Placa de vedação e de imagem de imediato, armazenar ou placa a 4 º C protegido da luz até que esteja pronto para geração de imagens. </li></ol> Aquisição e Análise de Imagem: <ol start="12"><li> De imagem e análise de lâminas coradas pode ser realizada de uma variedade de plataformas disponíveis HCS, incluindo a IN Analyzer Cell (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher Científica) ou o Opera (Perkin Elmer). Algumas diretrizes para a imagem e análise são apresentadas na Tabela 1: </li></ol><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4"> HCS222 Aquisição Diretrizes Imagem </td></tr><tr><td> Reagente de detecção </td><td> Lente objetiva </td><td> Faixa de excitação Filtro [pico / largura de banda (nm)] </td><td> Emissão Faixa de filtro [pico / largura de banda (nm)] </td></tr><tr><td> Hoechst HCS Nuclear Stain </td><td> 20X </td><td> 360/40 </td><td> 460/40 (ou 535/50, se necessário) </td></tr><tr><td> HCS Anticorpo secundário, FITC-Donkey anti-IgG de coelho </td><td> 20X </td><td> 480/40 </td><td> 535/50 </td></tr><tr><td> HCS Anticorpo secundário, Cy3-Donkey anti-rato IgG </td><td> 20X </td><td> 535/50 </td><td> 600/50 </td></tr></tbody></table> <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4" width="545"> HCS222 Análise Diretrizes Imagem </td></tr><tr><td> Parâmetro celular </td><td> Detecção </td><td> Segmentação / Medição </td><td> Fundamentação </td></tr><tr><td> Número de células, características nucleares </td><td> Hoechst HCS Nuclear Stain </td><td> Região nuclear (460 canais de emissão nm). Contar o número de núcleos. Conteúdo de DNA (intensidade nuclear) ou análises área nuclear também são possíveis. </td><td> Use o número de células, características nucleares para determinar a perda de células, fenótipos toxicidade, etc Can &quot;filtro&quot; para aqueles núcleos associados βIII-tubulina ou expressão GFAP para obter em separado contagem de células neuronais e astrocitária / caracterizações (fortemente recomendado). </td></tr><tr><td> βIII-tubulina Expressão, crescimento de neuritos </td><td> HCS Anticorpo secundário, FITC-conjugado </td><td> Região citoplasmática (535 nm de emissão do canal). FITC sinal pode ser usado para distinguir os corpos celulares neuronais de neurites (por exemplo, através de áreas de célula mínima / média do corpo, comprimentos neurite mínimo / máximo e largura). Determinar parâmetros como o comprimento neurite total, contagem de neurite / celular, etc </td><td> Medições de crescimento de neuritos pode ser modulada durante a diferenciação neuronal ou como resultado de uma lesão química, estados de doença, etc, podem &quot;filtrar&quot; os corpos celulares para aqueles associados com βIII-tubulina expressão para obter a caracterização neuronal distintos (fortemente recomendado). </td></tr><tr><td> GFAP Expressão, Área astrocitária </td><td> HCS Anticorpo secundário, Cy3-conjugados </td><td> Região citoplasmática (600 canais de emissão nm). Cy3 sinal pode ser usado para definir a segmentação do citoplasma de astrócitos. Determinar parâmetros como a intensidade de sinal média citoplasmática, área da célula, etc </td><td> GFAP expressão e área de células astrócitos pode ser modulada durante o desenvolvimento de astrócitos ou como resultado de uma lesão química, estados de doença, etc, podem &quot;filtrar&quot; os corpos celulares para aqueles associados com a expressão GFAP astrocitária para obter a caracterização distintos (fortemente recomendado). </td></tr></tbody></table> . Tabela 1 Imagem Diretrizes de Aquisição e Análise - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP Assay (Co-Cultura) Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/1173/figure31173.png" alt="Figura 3" /> Figura 1. βIII-tubulina e GFAP immunofluorescence de rato misturado culturas de células neurais. Co-culturas de astrócitos do hipocampo de ratos primária com neurônios de rato, quer primária ou hipocampo de ratos células PC12 foram gerados por placas pré-astrócitos durante vários dias em cultura, seguido de semeadura neuronal. Neurônios primários foram cultivadas por mais 11 dias, enquanto PC12s foram cultivadas por mais dois dias sob condições de diferenciação (soro baixo / NGF). Manipulação de células fixação e imunomarcação foram realizadas de acordo com protocolos HCS222 ensaio. As células foram fotografadas no GE IN celular Analyzer 1000 (3.3) a 20X (neurônios primários) ou de ampliação objetiva de 10X (PC12) e analisados ​​com o GE IN celular Workstation 1000 Analyzer (3.4) crescimento de neuritos e algoritmos de análise multi-alvo Painel superior.: imagens fundidas de Hoechst HCS Nuclear Stain (azul), βIII-tubulina (verde) e GFAP fluorescência (vermelho). Análise em separado do canal de fluorescência βIII-tubulina permite a segmentação crescimento de neuritos (painel do meio: corpos celulares descritos no azul (neurônios primários) ou amarelo (PC12), neurites em verde (neurônios primários) ou azul claro (PC12)). Análise do canal de GFAP permite a segmentação de astrócitos (painel inferior: núcleos delineados em azul, o citoplasma em verde). GFAP segmentação para o primário do hipocampo de ratos neurônio / astrócitos co-cultura demonstra a capacidade de distinguir entre os núcleos / célula corpos que são GFAP (+) (verde contornos) e aqueles que são GFAP (-) (vermelho), permitindo a contagem de células separadas para neurônios e astrócitos em uma configuração de cultura mista. <img src="/files/ftp_upload/1173/figure41173.png" alt="Figura 4" /> <img src="/files/ftp_upload/1173/figure4.51173.png" alt="Figura 4 part2" /> Figura 2. Respostas dose de rato principal do hipocampo neurônio / astrócitos co-culturas a estresses tóxicos. Astrócitos do hipocampo de ratos primária (P6) foram semeadas em placas de 96 poços em meio de crescimento e cultivadas por 6 dias. Neurônios de rato principal do hipocampo (direto de descongelar) foram semeadas em cima do pré-plated astrócitos e cultivadas em meio de crescimento por 11 dias. As células foram tratadas com diluições seriadas de acrilamida ou peróxido de hidrogénio (máx. = concentração 100mM e 10mM, respectivamente) para as últimas 24 horas de cultura. Manipulação de células fixação e imunomarcação foram realizadas de acordo com protocolos HCS222 ensaio. As células foram fotografadas no GE IN celular Analyzer 1000 (3.3) a 20X (10 campos / poço) e analisadas (nuclear / cytoplasmic / neurite segmentação) usando o GE IN celular Workstation 1000 Analyzer (3.4) crescimento de neuritos e algoritmos de análise multi-alvo. Os dados apresentados são média ± EPM, n = 3. Vários parâmetros (crescimento de neuritos, intensidade GFAP, área de astrócitos e contagem de células neuronais ou astrocitária) foram investigados por dose-dependente tendências.

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Os autores são todos os funcionários da Millipore Corporation.

Até o momento, experimentos in vitro concebido para estudo de avaliação do risco de neurotoxicidade utilizando culturas mistas de neurônios e astrócitos têm sido limitados. É bem aceito que as células gliais são essenciais na prestação de apoio espacial e metabólico para os neurônios, e desempenham um papel crítico na modulação neuronal várias funções, incluindo a migração neuronal, diferenciação e atividade sináptica. Astrócitos gliais também liberam citocinas e outros fatores solúveis que são capazes de induzir ambos os tolerância respostas adversas no tecido circundante neuronal, bem como promover neuronal de muitas toxinas. Demonstrando a profundidade da neuronal-glial interações, em co-cultura estudos, os astrócitos foram mostrados para proteger os neurônios contra a toxicidade do estresse oxidativo, enquanto comprometimento das funções astrocíticos, tais como manutenção de defesa antioxidante e os níveis de energia celular, tem se mostrado influenciam criticamente a sobrevivência neuronal. Estudos recentes têm sugerido que o uso de astrócitos em um sistema de teste in vitro-neurotoxicidade pode ser mais relevantes para a estrutura do sistema nervoso central humano e função de células neuronais sozinho. Apesar da crescente conscientização da importância fisiológica do neuronal-astrocíticos interações, tem sido difícil de executar análises quantitativas dessas interações em células intactas. O advento de Triagem de conteúdo de alta possibilita o desenvolvimento de novos testes poderosa para lidar com isso. Neste estudo, nós demonstramos que as análises quantitativas de vários fenótipos neuronais e astrocitária dentro de um único ensaio são possíveis por HCA. Em neurônios primários temos realizado medições quantitativas dos marcadores neurotoxicidade, como o número de neurônios, a contagem de neurite e comprimento neurite. Em astrócitos, gliose reativa é um biomarcador conhecido da neurotoxicidade, caracterizada por alterações na expressão de GFAP, o número de astrócitos e morfologia de astrócitos. Nós demonstramos que cada um destes parâmetros podem ser facilmente avaliada através de HCA. Estes estudos suportam o conceito de que HCA de neural específico biomarcadores poderiam ser usados ​​como parte de uma bateria de ensaios in vitro para tela rapidamente um grande número de produtos químicos para endpoints neurotóxicos. HCS222 Millipore do kit de análise de conteúdo de alta para o co-cultura de neurônios e astrócitos é composto de reagentes de alta qualidade e protocolos para a detecção simultânea de perfis βIII-tubulina e proteína fibrilar glial ácida (GFAP) em uma ampla variedade de modelos celulares de neurotoxicidade. Os reagentes altamente validado, desde que com este kit permite que o usuário para padronizar os ensaios, minimize-ensaio para ensaio-variabilidade, e reproduzível gerar imagens com uma relação sinal-background-alta.

<table><tbody><tr><td>Rabbit Anti-&amp;#946;III-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X</td><td></td><td>Part No. CS201672</td><td>1 vial containing 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X</td><td></td><td>Part No. CS201649</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X</td><td></td><td>Part No. CS201671</td><td>1 vial containing 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X</td><td></td><td>Part No. CS200437</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst HCS Nuclear Stain, 200X</td><td></td><td>Part No. CS200438</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X</td><td></td><td>Part No. CS200434</td><td>1 bottle containing 100 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Immunofluorescence Buffer, 1X</td><td></td><td>Part No. CS200435</td><td>1 bottle containing 1000 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Wash Buffer, 1X</td><td></td><td>Part No. 2007643</td><td>1 bottle containing 500 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>Acrylamide (Control Compound), 10X</td><td></td><td>Part No. CS201679</td><td>1 vial containing 500 &amp;#x03BC;L of 1M acrylamide in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X</td><td></td><td>Part No. CS201730</td><td>1 vial containing 500 &amp;#x03BC;L of 100 mM hydrogen peroxide in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>K-252a (Control Compound), 250X</td><td></td><td>Part No. CS201741</td><td>1 vial containing 100 &amp;#x03BC;L of 250 &amp;#x03BC;M K-252a in DMSO&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>DMSO for Compound Serial Dilution</td><td></td><td>Part No. CS200441</td><td>1 bottle containing 10 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Compound Dilution Buffer</td><td></td><td>Part No. CS200442</td><td>1 bottle containing 25 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Plate Sealers</td><td></td><td>Part No. CS200443</td><td>10 each&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>tissue culture-treated black/clear bottom microplates </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCS imaging/analysis system</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity

Alta Content Analysis (HCA) ensaios de combinar células e reagentes de detecção com imagem automatizada e poderosos algoritmos de análise de imagem, permitindo a medição de múltiplos fenótipos celulares dentro de um único ensaio. Neste estudo, utilizamos HCA para desenvolver um teste de novela para neurotoxicidade. Neurotoxicidade avaliação representa uma parte importante da avaliação de segurança de medicamentos, bem como sendo um foco significativo dos esforços de protecção ambiental. Além disso, neurotoxicidade é também um bem aceita<em&gt; In vitro</em&gt; Marcador do desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, como Alzheimer e Parkinson. Recentemente, a aplicação de HCA para triagem neuronal tem sido relatada. Por rotulagem com células neuronais βIII-tubulina, ensaios de HCA pode proporcionar alto rendimento, não-subjetivo, medidas quantitativas de parâmetros como o número de neurônios, a contagem de neurite e comprimento dos neuritos, que podem indicar efeitos neurotóxicos. No entanto, o papel dos astrócitos permanece inexplorada nesses modelos. Astrócitos têm um papel fundamental na manutenção do sistema nervoso central (SNC) homeostase, e estão associados com as duas neuroproteção e neurodegradation quando elas são ativadas em resposta a substâncias tóxicas ou de estados de doença. GFAP é uma proteína de filamento intermediário expressa predominantemente nos astrócitos do SNC. Ativação astrocitária (gliose) leva à regulação alta de GFAP, comumente acompanhada de proliferação de astrócitos e hipertrofia. Este processo de gliose reativa tem sido proposta como um marcador precoce de danos ao sistema nervoso. O método tradicional para quantificação GFAP é por imunoensaio. Esta abordagem é limitada pela incapacidade de fornecer informações sobre a localização celular, morfologia e número de celular. Nós determinamos que o HCA pode ser usado para superar essas limitações e, simultaneamente, medir características múltiplos associados com gliose - mudanças na expressão GFAP, a hipertrofia de astrócitos, e proliferação de astrócitos - dentro de um único ensaio. Em co-cultura estudos, os astrócitos foram mostrados para proteger os neurônios contra vários tipos de insultos tóxicos e influenciam criticamente a sobrevivência neuronal. Estudos recentes têm sugerido que o uso de astrócitos em um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de teste de neurotoxicidade pode ser mais relevantes para a estrutura e função do SNC humano do que as células neuronais sozinho. Assim, desenvolvemos um ensaio HCA para co-cultura de neurônios e astrócitos, composto por protocolos e validados, dirigidas a públicos específicos reagentes de detecção para perfil βIII-tubulina e glial fibrilar proteína ácida (GFAP). Este ensaio permite a análise simultânea de neurotoxicidade, crescimento de neuritos, gliose, morfologia neuronal e astrocitária e desenvolvimento neuronal e astrocitária em uma grande variedade de modelos de celulares, o que representa um romance, não-subjetiva, teste de alto rendimento para a avaliação de neurotoxicidade. O ensaio tem um grande potencial para a detecção aprimorada de neurotoxicidade e maior produtividade em pesquisa em neurociência e descoberta de drogas.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Este artigo descreve um protocolo de romance e de reagente conjunto projetado para a medição sensível de efeitos neurotóxicos de compostos e tratamentos em co-culturas de neurônios e astrócitos usando análise de conteúdo de alta. Resultados demonstram que a análise de conteúdo de alta tecnologia representa um romance empolgante para a avaliação de neurotoxicidade.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

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Research

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Biology

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Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is very poor 1. The failure of axon regeneration is a combined result of several factors including the hostile glial cell environment, inhibitory myelin related molecules and decreased intrinsic neuron regenerative capacity 2. Astrocytes are the most predominant glial cell type in central nervous system and play important role in axon functions under physiology and pathology conditions 3. Contrast to the homologous oligodendrocytes, astrocytes are a heterogeneous cell population composed by different astrocyte subpopulations with diverse morphologies and gene expression 4. The functional significance of this heterogeneity, such as their influences on axon growth, is largely unknown.
To study the glial cell, especially the function of astrocyte heterogeneity in neuron behavior, we established a new method by co-culturing high purified dorsal root ganglia neurons with glial cells obtained from the rat cortex. By this technique, we were able to directly compare neuron adhesion and axon growth on different astrocytes subpopulations under the same condition.
In this report, we give the detailed protocol of this method for astrocytes isolation and culture, dorsal root ganglia neurons isolation and purification, and the co-culture of DRG neurons with astrocytes. This method could also be extended to other brain regions to study cellular or regional specific interaction between neurons and glial cells.

In this protocol, we described a new method to study the influence of glial cell heterogeneity on axon growth with an in vitro co-culture system. Rat cortical glial cells were cultured to confluence and cocultured with highly purified rat dorsal root ganglia neurons. Different glial cell influence on neurons adhesion and axon growth was compared directly in the same culture. This method provides a new way to directly study the glial cell heterogeneity influence on neuron adhesion and axon growth.

Estudo Influência Heterogeneidade células gliais no crescimento Axon Usando um método de co-cultura New

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

Neurociência

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

Análise de imagens de Neuron Glia para Interação em Plataforma Cultura microfluídicos (MCP) baseado Axon Neuronal e Sistema Glia co-cultura

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

Um compartimento Multi-glia do SNC Neuron-Co-cultura plataforma microfluídica

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Biologia

A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides reliable analysis of neuronal morphology together with quantitative measurements of modifications on neurite length and synaptic protein localization and abundance upon treatment with small molecule compounds. In addition to the application of the presented method in neurite outgrowth studies, neurotoxicity assessment can be performed to assess, distinguish and rank commercial chemical compounds based on their potential developmental neurotoxicity effect.
Even though cell lines are nowadays widely used in compound screening assays in neuroscience, they often differ genetically and phenotypically from their tissue origin. Primary cells, on the other hand, maintain important markers and functions observed in vivo. Therefore, due to the translation potential and physiological relevance that these cells could offer neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment can considerably benefit from using human neural progenitor cells (hNPCs) as the primary human cell model.
The presented method herein can be utilized to screen for the ability of compounds to induce neurite outgrowth and neurotoxicity by taking advantage of the human neural progenitor cell-derived neurons, a cell model closely representing human biology.&#34;

The presented protocol describes a method for a neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment of small molecule compounds.

Um ensaio de crescimento de neurita e avaliação de neurotoxicidade com neurônios derivados de células progenitoras neugenitoras humanas

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides ...

Biologia do Desenvolvimento

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up para a investigação detalhada da Relação Neuron-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

Um modelo de cultura celular para estudar o papel das interações neurônio-glia na isquemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to study the process of neuronal survival upon cytotoxic stress. Most methods are based on biochemical approaches that do not allow single-cell resolution or involve complex and costly methodologies. Presented here is a versatile, inexpensive, and effective experimental paradigm to study neuronal survival. This method takes advantage of sparse fluorescent labeling of the neurons followed by live imaging and automated quantification. To this aim, the neurons are electroporated to express fluorescent markers and co-cultured with non-electroporated neurons to easily regulate cell density and increase survival. 
Sparse labeling by electroporation allows a simple and robust automated quantification. In addition, fluorescent labeling can be combined with the co-expression of a gene of interest to study specific molecular pathways. Here, we present a model of stroke as a neurotoxic model, namely, the oxygen-glucose deprivation (OGD) assay, which was performed in an affordable and robust homemade hypoxic chamber. Finally, two different workflows are described using IN Cell Analyzer 2200 or the open-source ImageJ for image analysis for semi-automatic data processing. This workflow can be easily adapted to different experimental models of toxicity and scaled up for high-throughput screening. In conclusion, the described protocol provides an approachable, affordable, and effective in vitro model of neurotoxicity, which can be suitable for testing the roles of specific genes and pathways in live imaging and for high-throughput drug screening.

Here, we present a simple, potent, and versatile methodology to investigate neuronal survival upon cytotoxic stress in primary cortical neurons with cellular resolution in real time or in fixed material.

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to ...

 Protocolo de co-cultura primária de microglia e neurônio para estudos de interação do SNC

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

Autor em destaque: Modelo de co-cultura in vitro para estudar interações microglia-neuronais em condições de doença

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

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Estudo Influência Heterogeneidade células gliais no crescimento Axon Usando um método de co-cultura New

Análise de imagens de Neuron Glia para Interação em Plataforma Cultura microfluídicos (MCP) baseado Axon Neuronal e Sistema Glia co-cultura

Um compartimento Multi-glia do SNC Neuron-Co-cultura plataforma microfluídica

Um ensaio de crescimento de neurita e avaliação de neurotoxicidade com neurônios derivados de células progenitoras neugenitoras humanas

A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An

Um modelo de cultura celular para estudar o papel das interações neurônio-glia na isquemia

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

Geração e co-cultura de microglia primária murina e neurônios corticais

Geração e co-cultura de microglia primária murina e neurônios corticais

Geração e co-cultura de microglia primária murina e neurônios corticais