Gli autori desiderano ringraziare Drs. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till, Matteo Hsu, Jehangir Mistry e Michele Hatler per il supporto durante lo sviluppo di questi progetti e protocolli.

Preparazione delle cellule: <ol><li> Prima della semina delle cellule per i neuroni cultura saggio, / astrociti in terreni di crescita fino a ~ confluente 70-80% (a meno che la semina di cellule direttamente dal disgelo o isolamento). </li><li> Staccare le cellule da fiaschi cultura / piastre tramite metodo appropriato per il tipo di cellule di interesse. Se necessario, cappotto pozzetti piastra con poli-D-lisina o di proteine ​​della matrice extracellulare per migliorare l&#39;adesione delle cellule. Co-colture di astrociti e neuroni possono essere seminate contemporaneamente o in sequenza. Per le teste di serie sequenziali, placcatura di astrociti prima come livello &quot;basale&quot; è consigliato, seguito da placcatura neuronale e la differenziazione, se necessario. Regolare la densità cellulare come appropriato per il tipo di cellule, il tempo della cultura successiva, i parametri di interesse, ecc A seconda dell&#39;età della cultura, fonte di cellule e la densità di semina, colture primarie possono variare notevolmente in velocità di proliferazione, espressione di GFAP o crescita dei neuriti - è importante caratterizzare e ottimizzare il sistema cellulare ea garantire la rilevanza biologica per il modello sperimentale, così come per fornire efficaci per l&#39;imaging, la segmentazione e l&#39;analisi utilizzando HCS (vedi Figura 1). Dopo aver aggiunto le cellule a piastra (cellule possono essere seminate in 90 microlitri mezzi di comunicazione, di semplificare il trattamento tossina come descritto nel passaggio 3 di seguito), permettono di sedere piatto su una superficie piana a temperatura ambiente per 15-30 minuti, consentendo una distribuzione uniforme delle celle. Dopo questo periodo, le cellule incubare in terreni di coltura (37 ° C / 5% CO 2) per almeno 24 ore, quindi passare a condizioni di coltura differenziazione (per esempio, bassi livelli sierici / NGF per cellule PC12), a seconda dei casi. Continuare la cultura fino cellule raggiungere il livello desiderato di confluenza o di differenziazione, la sostituzione del supporto ad intervalli appropriati per il tipo di cellule. </li><li> Trattamenti con le cellule (composti di controllo, composti di prova, ecc) può essere introdotto in qualsiasi momento durante questo periodo la cultura, come appropriato per il tempo-ciclo di trattamento di interesse. Acrilamide, perossido di idrogeno e K-252bis sono forniti come composti controllo neurotossici. Reagenti siano sufficienti per le curve di duplicare la dose di 12 punti risposta (di cui uno dH 2 O o DMSO-control trova all&#39;interno del dose-risposta) per tutte e cinque le piastre a 96 pozzetti. I composti sono forniti concentrazione 250X (per K-252bis, assumendo una terapia massima di 1 microM) o 10X (di acrilamide e perossido di idrogeno, assumendo trattamenti massima di 100 mm e 10 mm, rispettivamente). Preparazione trattamento raccomandato coinvolge mezza log (1: √ 10) diluizione seriale del composto 250X in DMSO, seguita da diluizione in tampone di diluizione Compound a 10 volte (10 volte composti controllo originari dH 2 O può essere diluito in serie direttamente in sterili dH 2 O o di diluizione Compound). 10 L di ogni trattamento può poi essere aggiunto al 90 microlitri di terreni di coltura già presenti in ciascun pozzetto, per una concentrazione finale 1X (0,4% o al 10% DMSO dH 2 O). Dati di esempio viene fornito per 24 o 96 ore di trattamento composto a 37 ° C prima della fissazione. </li></ol> Fissazione e colorazione delle cellule immunofluorescenza: Nota: il tempo di colorazione è ~ 2,5 ore dopo la fissazione. Non permettere pozzetti si asciughino tra i passaggi colorazione. Aspirazione e dispensazione dei reagenti deve essere condotta a basse portate a diminuire la perdita di cellule dovuta al taglio del fluido. Tutti raccomandati &#39;per bene&#39; i volumi si riferiscono a un singolo pozzetto di una micropiastra a 96 pozzetti. Tutti raccomandati &#39;per 96 pozzetti&#39; volumi includono il 25% la perdita di liquido in eccesso di volume di movimentazione. Tutte le fasi di colorazione vengono eseguite a temperatura ambiente (RT). Tutti i tamponi e le soluzioni di anticorpi sono stabili per almeno 24 ore a temperatura ambiente. <ol start="4"><li> Alla fine del periodo di coltura, pre-riscaldare Soluzione Fissazione HCS (2X) a temperatura ambiente (RT) o di 37 º C se lo si desidera (12 piastra mL/96-well). In una cappa, aggiungere 100 l / pozzetto direttamente ai terreni di coltura e consentono di fissare per 30 minuti a RT. Rimuovere fissativo / tossina contenenti i media e smaltire in conformità alle norme per i rifiuti pericolosi (vedi scheda di sicurezza). Se procedere immediatamente alle macchie, lavare ogni pozzetto due volte con 200 ml di tampone HCS immunofluorescenza. In alternativa, se le targhe devono essere colorati in un secondo momento, lavare due volte con 200 ml di soluzione di lavaggio, quindi lasciare secondo risciacquo volume in pozzi e piastre di conservare ben chiusi a 4 ° C fino a colorazione. </li><li> Se i campioni sono stati conservati fisso a 4 ° C prima della colorazione, lavare due volte con 200 microlitri Buffer HCS immunofluorescenza prima di procedere con il protocollo di colorazione. </li><li> Preparare soluzione di lavoro di coniglio anti-tubulina βIII / Mouse anti-GFAP Anticorpi HCS primaria (6 piastra mL/96-well) come segue: Aggiungere 60 ml di ogni anticorpo primario scongelati a 5,88 ml di tampone HCS immunofluorescenza. Mescolare bene. Rimuovere precedenti Buffer immunofluorescenza risciacquare. Aggiungere 50 ml di soluzione di anticorpo primario in ciascun pozzetto e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere Anticorpo primariosoluzione. Lavare tre volte con 200 ul Buffer HCS immunofluorescenza. </li><li> Preparare la soluzione di lavoro di anticorpi HCS secondaria / Hoechst HCS nucleare Stain (6 piastra mL/96-well) come segue: aggiungere 30 ml di ogni anticorpo secondario scongelati e 30 ml di scongelato Hoechst HCS nucleare Stain a 5,91 ml di tampone HCS immunofluorescenza. Mescolare bene, proteggendo la soluzione dalla luce. Rimuovere precedenti HCS Buffer immunofluorescenza risciacquare. Aggiungere 50 ml di anticorpo HCS secondaria / Hoechst HCS soluzione nucleare Stain e incubare per 1 ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. </li><li> Rimuovere HCS secondaria Anticorpo / Hoechst HCS soluzione nucleare Stain. Sciacquare due volte con 200 ul Buffer HCS immunofluorescenza. </li><li> Rimuovere precedenti HCS Buffer immunofluorescenza risciacquare. Sciacquare due volte con 200 ml di tampone HCS lavaggio, lasciando secondo risciacquo volume in pozzi. </li><li> Piatto di tenuta e di immagine subito, o conservare a 4 ° C al riparo dalla luce fino al momento per l&#39;imaging. </li></ol> Acquisizione di immagini e analisi: <ol start="12"><li> Imaging e analisi di piatti colorati possono essere eseguite su una varietà di piattaforme disponibili HCS, tra cui il IN Analyzer Cell (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher scientifico) o Opera (Perkin Elmer). Alcune linee guida per l&#39;imaging e di analisi sono riportati nella Tabella 1: </li></ol><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4"> HCS222 Image Acquisition Linee guida </td></tr><tr><td> Rilevazione dei reagenti </td><td> Obiettivo obiettivo </td><td> Intervallo di eccitazione Filter [picco / larghezza di banda (nm)] </td><td> Intervallo di emissione Filtro [picco / larghezza di banda (nm)] </td></tr><tr><td> Hoechst HCS nucleare Stain </td><td> 20X </td><td> 360/40 </td><td> 460/40 (o 535/50 se necessario) </td></tr><tr><td> HCS anticorpo secondario, coniugati con Donkey anti-IgG </td><td> 20X </td><td> 480/40 </td><td> 535/50 </td></tr><tr><td> HCS anticorpo secondario, Cy3-Donkey anti-mouse IgG </td><td> 20X </td><td> 535/50 </td><td> 600/50 </td></tr></tbody></table> <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4" width="545"> HCS222 Image Analysis Linee guida </td></tr><tr><td> Cella di </td><td> Rivelazione </td><td> Segmentazione / misurazione </td><td> Fondamento logico </td></tr><tr><td> Numero di cellulare, Caratteristiche nucleare </td><td> Hoechst HCS nucleare Stain </td><td> Regione nucleare (460 nm di emissione del canale). Contare il numero di nuclei. Contenuto di DNA (intensità nucleare) o analisi settore nucleare sono inoltre possibili. </td><td> Usa numero cellulare, caratteristiche nucleari per determinare la perdita di cellule, fenotipi tossicità, ecc Può nuclei &quot;filtro&quot; per quelli associati βIII-tubulina o espressione GFAP di ottenere separare conta delle cellule neuronali e astrocitaria / caratterizzazioni (fortemente consigliato). </td></tr><tr><td> βIII-tubulina di espressione, neuriti escrescenza </td><td> HCS anticorpo secondario, coniugato FITC </td><td> Regione citoplasmatica (535 nm di emissione del canale). Segnale FITC possono essere utilizzati per distinguere corpi cellulari neuronali da neuriti (ad esempio, attraverso le zone delle cellule minimo / medio corpo, la lunghezza dei neuriti minimo / massimo e larghezza). Determinare parametri quali la lunghezza dei neuriti totale, conta neuriti / cellulari, ecc </td><td> Misure crescita dei neuriti può essere modulata durante la differenziazione neuronale o come risultato di danno chimico, stati di malattia, ecc Can &quot;filtro&quot; corpi cellulari per quelli associati βIII-tubulina espressione di ottenere distinte caratterizzazione neuronale (fortemente consigliato). </td></tr><tr><td> GFAP Espressione, Area astrociti </td><td> HCS anticorpo secondario, coniugato con Cy3- </td><td> Regione citoplasmatica (600 nm di emissione del canale). Cy3 segnale può essere utilizzato per definire astrocitaria segmentazione citoplasmatica. Determinare parametri come intensità media del segnale citoplasmatici, area delle celle, ecc </td><td> Espressione di GFAP e la zona delle cellule astrociti possono essere modulata durante lo sviluppo degli astrociti o come risultato di danno chimico, stati di malattia, ecc Can &quot;filtro&quot; corpi cellulari per quelli associati con l&#39;espressione di GFAP di ottenere distinte caratterizzazione astrocitaria (fortemente consigliato). </td></tr></tbody></table> . Tabella 1 Immagine Linee guida acquisizione e l&#39;analisi - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (Co-Cultura) Assay Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/1173/figure31173.png" alt="Figura 3" /> Figura 1. βIII-tubulina e GFAP immunofluoreScence misti di colture di cellule neuronali di ratto. Co-colture di astrociti primari di ratto sia con i neuroni dell&#39;ippocampo di ratto primaria dell&#39;ippocampo di ratto o cellule PC12 sono state generate dalla pre-placcatura astrociti per diversi giorni di cultura, seguito da semina neuronale. Neuroni primari sono state coltivate per altri 11 giorni, mentre PC12s sono stati coltivati ​​per altri 2 giorni in condizioni di differenziazione (bassi livelli sierici / NGF). Manipolazione delle cellule, la fissazione e immunostaining sono stati eseguiti secondo protocolli HCS222 test. Le cellule sono state proietta sulla GE IN cella Analyzer 1000 (3.3) a 20X (neuroni primario) o 10X (PC12) ingrandimento obiettivo e analizzati utilizzando il GE IN Workstation cellulare Analyzer 1000 (3.4) crescita dei neuriti e algoritmi di analisi multi target Pannello superiore.: immagini fuse di Hoechst HCS Stain nucleare (blu), βIII-tubulina (verde) e GFAP (rosso) fluorescenza. Analisi separata dei βIII-tubulina canale di fluorescenza permette di segmentazione crescita dei neuriti (al centro del pannello: corpi cellulari delineate nel blu (neuroni primari) o giallo (PC12), neuriti in verde (neuroni primario) o azzurro (PC12)). Analisi del canale GFAP permette di segmentazione astrociti (pannello di fondo: i nuclei in blu, citoplasma in verde). Segmentazione GFAP per il primario dei neuroni dell&#39;ippocampo di ratto / astrociti co-coltura dimostra la capacità di distinguere tra nuclei / celle corpi che sono GFAP (+) (verde contorni) e quelli che sono GFAP (-) (rosso), che consente la conta delle cellule separate per neuroni e astrociti in un ambiente cultura mista. <img src="/files/ftp_upload/1173/figure41173.png" alt="Figura 4" /> <img src="/files/ftp_upload/1173/figure4.51173.png" alt="Figura 4 part2" /> Figura 2. Risposte dose di primari di ratto neurone dell&#39;ippocampo / astrociti co-colture agli stress tossico. Astrociti primari di ratto dell&#39;ippocampo (P6) sono stati placcati in piastre a 96 pozzetti in terreni di coltura e coltura per 6 giorni. Neuroni dell&#39;ippocampo di ratto primario (diretto da disgelo) sono poi stati seminati in cima alla pre-plated astrociti e coltivate in terreni di coltura per 11 giorni. Le cellule sono state trattate con diluizioni seriali di perossido di idrogeno o acrilamide (concentrazione max = 100mm e 10mm, rispettivamente) per le ultime 24 ore di cultura. Manipolazione delle cellule, la fissazione e immunostaining sono stati eseguiti secondo protocolli HCS222 test. Le cellule sono state proietta sulla GE IN cella Analyzer 1000 (3.3) a 20X (10 campi / pozzetto) ed analizzati (nucleare / citoplasma / segmentazione dei neuriti) utilizzando il cellulare di GE IN Workstation Analyzer 1000 (3.4) crescita dei neuriti e algoritmi di analisi multi target. I dati presentati sono media ± SEM, n = 3. Più parametri (crescita dei neuriti, intensità GFAP, zona astrociti e conta delle cellule neuronali o astrociti) sono stati indagati per dose-dipendente tendenze.

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Gli autori sono tutti i dipendenti di Millipore Corporation.

Fino ad oggi, in esperimenti in vitro progettato per studiare la valutazione del rischio di neurotossicità utilizzando colture miste di neuroni e astrociti sono stati limitati. E &#39;ben accettato che le cellule gliali sono parte integrante nel fornire supporto spaziale e metabolico ai neuroni, e svolgono un ruolo cruciale nel modulare diverse funzioni neuronali, compresa la migrazione neuronale, la differenziazione e l&#39;attività sinaptica. Astrociti gliali anche rilascio di citochine e altri fattori solubili, che sono in grado di indurre sia tolleranza effetti avversi su tessuti circostanti neuronale, oltre a promuovere neuronale di molte tossine. Dimostrare la profondità dei neuroni-gliali interazioni, in co-coltura studi, gli astrociti hanno dimostrato di proteggere i neuroni contro la tossicità di stress ossidativo, mentre l&#39;alterazione delle funzioni astrociti, come la manutenzione di difesa antiossidante ed i livelli di energia cellulare, è stato dimostrato che criticamente influenzano la sopravvivenza neuronale. Recenti studi hanno suggerito che l&#39;uso di astrociti in una neurotossicità in vitro di test del sistema può rivelarsi più rilevanti per la salute umana struttura del sistema nervoso centrale e la funzione di cellule neuronali da solo. Nonostante la crescente consapevolezza del significato fisiologico di neuroni, astrociti interazioni, è già stato difficile effettuare analisi quantitative di queste interazioni in cellule intatte. L&#39;avvento di screening ad alta Contenuto consente lo sviluppo di potenti nuove analisi per affrontare questo. In questo studio, abbiamo dimostrato che le analisi quantitative di più fenotipi neuronali e astrociti all&#39;interno di un singolo test sono rese possibili da HCA. Nei neuroni primari abbiamo effettuato misurazioni quantitative dei marcatori di neurotossicità quali il numero dei neuroni, il conteggio dei neuriti e la lunghezza dei neuriti. Negli astrociti, gliosi reattiva è un biomarker noto di neurotossicità, caratterizzata da alterazioni nell&#39;espressione GFAP, il numero di astrociti e la morfologia degli astrociti. Abbiamo dimostrato che ognuno di questi endpoint possono facilmente essere valutata tramite HCA. Questi studi supportano il concetto che HCA di neurali specifici biomarcatori potrebbe essere utilizzato come parte di una batteria di test in vitro per lo screening rapidamente un gran numero di sostanze chimiche per gli endpoint neurotossici. Millipore HCS222 Alta kit Content Analysis per co-coltura di neuroni e astrociti si compone di alta qualità, reagenti e protocolli per il rilevamento simultaneo profilazione βIII-tubulina e proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) in una vasta gamma di modelli cellulari di neurotossicità. La altamente convalidato reagenti forniti con questo kit consentono all&#39;utente di standardizzare i test, ridurre al minimo dosaggio a dosaggio variabilità, riproducibile e per generare immagini con un elevato rapporto segnale-background rapporto.

<table><tbody><tr><td>Rabbit Anti-&amp;#946;III-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X</td><td></td><td>Part No. CS201672</td><td>1 vial containing 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X</td><td></td><td>Part No. CS201649</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X</td><td></td><td>Part No. CS201671</td><td>1 vial containing 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X</td><td></td><td>Part No. CS200437</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst HCS Nuclear Stain, 200X</td><td></td><td>Part No. CS200438</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X</td><td></td><td>Part No. CS200434</td><td>1 bottle containing 100 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Immunofluorescence Buffer, 1X</td><td></td><td>Part No. CS200435</td><td>1 bottle containing 1000 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Wash Buffer, 1X</td><td></td><td>Part No. 2007643</td><td>1 bottle containing 500 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>Acrylamide (Control Compound), 10X</td><td></td><td>Part No. CS201679</td><td>1 vial containing 500 &amp;#x03BC;L of 1M acrylamide in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X</td><td></td><td>Part No. CS201730</td><td>1 vial containing 500 &amp;#x03BC;L of 100 mM hydrogen peroxide in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>K-252a (Control Compound), 250X</td><td></td><td>Part No. CS201741</td><td>1 vial containing 100 &amp;#x03BC;L of 250 &amp;#x03BC;M K-252a in DMSO&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>DMSO for Compound Serial Dilution</td><td></td><td>Part No. CS200441</td><td>1 bottle containing 10 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Compound Dilution Buffer</td><td></td><td>Part No. CS200442</td><td>1 bottle containing 25 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Plate Sealers</td><td></td><td>Part No. CS200443</td><td>10 each&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>tissue culture-treated black/clear bottom microplates </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCS imaging/analysis system</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity

Alta Content Analysis (HCA) saggi combinano le cellule e reagenti di rilevamento automatico e con immagini potenti algoritmi di analisi delle immagini, consente la misurazione di diversi fenotipi cellulari all&#39;interno di un singolo test. In questo studio, abbiamo utilizzato HCA per sviluppare un nuovo metodo di analisi di neurotossicità. Neurotossicità di valutazione rappresenta una parte importante della valutazione sulla sicurezza dei farmaci, oltre ad essere un focus significativo degli sforzi di protezione ambientale. Inoltre, la neurotossicità è anche ben accettato<em&gt; In vitro</emMarker&gt; dello sviluppo di malattie neurodegenerative come l&#39;Alzheimer e di Parkinson. Recentemente, l&#39;applicazione di HCA allo screening neuronale è stata riportata. Mediante l&#39;etichettatura cellule neuronali con βIII-tubulina, saggi di HCA in grado di fornire high-throughput, non soggettivo, misurazioni quantitative dei parametri quali il numero dei neuroni, il conteggio dei neuriti e la lunghezza dei neuriti, che può indicare effetti neurotossici. Tuttavia, il ruolo degli astrociti rimane inesplorato in questi modelli. Astrociti ha un ruolo fondamentale nel mantenimento del sistema nervoso centrale (SNC) omeostasi, e sono associati con entrambi neuroprotezione e neurodegradation quando sono attivati ​​in risposta a sostanze tossiche o stati di malattia. GFAP è una proteina filamenti intermedi espressi prevalentemente astrociti del sistema nervoso centrale. Attivazione degli astrociti (gliosi) porta alla upregulation di GFAP, comunemente accompagnato da proliferazione degli astrociti e ipertrofia. Questo processo di gliosi reattiva è stata proposta come marker precoce di danni al sistema nervoso. Il metodo tradizionale per la quantificazione GFAP è da immunologico. Questo approccio è limitato dalla incapacità di fornire informazioni sulla localizzazione cellulare, la morfologia e il numero di cellulare. Abbiamo determinato che HCA potrebbero essere utilizzati per superare queste limitazioni e per misurare simultaneamente molteplici funzionalità associate a gliosi - cambiamenti nell&#39;espressione GFAP, ipertrofia astrociti, e la proliferazione degli astrociti - all&#39;interno di un singolo test. In co-coltura studi, gli astrociti hanno dimostrato di proteggere i neuroni contro diversi tipi di insulto tossico e di influenzare in modo critico la sopravvivenza neuronale. Recenti studi hanno suggerito che l&#39;uso di astrociti in<em&gt; In vitro</emNeurotossicità&gt; sistema di test possono rivelarsi più rilevanti per la struttura umana SNC e la funzione di cellule neuronali da solo. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un saggio HCA per co-coltura di neuroni e astrociti, composto di protocolli e validati, target-specifici reagenti di rilevamento per il profiling βIII-tubulina e proteina acida gliale fibrillare (GFAP). Questo test consente l&#39;analisi simultanea di neurotossicità, crescita dei neuriti, gliosi, morfologia neuronale e astrociti e lo sviluppo neuronale e astrociti in una vasta gamma di modelli cellulari, che rappresentano un romanzo, non soggettivo, high-throughput test per la valutazione neurotossicità. Il saggio ha un grande potenziale per il rilevamento di neurotossicità maggiore e una migliore produttività della ricerca nel campo delle neuroscienze e la scoperta della droga.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Questo articolo descrive un nuovo protocollo e reagenti impostare progettato per la misura sensibile degli effetti neurotossici di composti e trattamenti sulla co-culture di neuroni e astrociti utilizzando l&#39;analisi ad alto contenuto. Risultati dimostrano che l&#39;analisi ad alto contenuto rappresenta una tecnologia entusiasmante romanzo per la valutazione neurotossicità.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Video: A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is very poor 1. The failure of axon regeneration is a combined result of several factors including the hostile glial cell environment, inhibitory myelin related molecules and decreased intrinsic neuron regenerative capacity 2. Astrocytes are the most predominant glial cell type in central nervous system and play important role in axon functions under physiology and pathology conditions 3. Contrast to the homologous oligodendrocytes, astrocytes are a heterogeneous cell population composed by different astrocyte subpopulations with diverse morphologies and gene expression 4. The functional significance of this heterogeneity, such as their influences on axon growth, is largely unknown.
To study the glial cell, especially the function of astrocyte heterogeneity in neuron behavior, we established a new method by co-culturing high purified dorsal root ganglia neurons with glial cells obtained from the rat cortex. By this technique, we were able to directly compare neuron adhesion and axon growth on different astrocytes subpopulations under the same condition.
In this report, we give the detailed protocol of this method for astrocytes isolation and culture, dorsal root ganglia neurons isolation and purification, and the co-culture of DRG neurons with astrocytes. This method could also be extended to other brain regions to study cellular or regional specific interaction between neurons and glial cells.

In this protocol, we described a new method to study the influence of glial cell heterogeneity on axon growth with an in vitro co-culture system. Rat cortical glial cells were cultured to confluence and cocultured with highly purified rat dorsal root ganglia neurons. Different glial cell influence on neurons adhesion and axon growth was compared directly in the same culture. This method provides a new way to directly study the glial cell heterogeneity influence on neuron adhesion and axon growth.

Studio gliali eterogeneità Influenza sulla crescita cellulare Axon Utilizzando un nuovo metodo co-coltura

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

Ricerca

Neuroscienze

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

Un multi-vano SNC Neuron-glia Co-cultura Microfluidic piattaforma

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Biologia

A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides reliable analysis of neuronal morphology together with quantitative measurements of modifications on neurite length and synaptic protein localization and abundance upon treatment with small molecule compounds. In addition to the application of the presented method in neurite outgrowth studies, neurotoxicity assessment can be performed to assess, distinguish and rank commercial chemical compounds based on their potential developmental neurotoxicity effect.
Even though cell lines are nowadays widely used in compound screening assays in neuroscience, they often differ genetically and phenotypically from their tissue origin. Primary cells, on the other hand, maintain important markers and functions observed in vivo. Therefore, due to the translation potential and physiological relevance that these cells could offer neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment can considerably benefit from using human neural progenitor cells (hNPCs) as the primary human cell model.
The presented method herein can be utilized to screen for the ability of compounds to induce neurite outgrowth and neurotoxicity by taking advantage of the human neural progenitor cell-derived neurons, a cell model closely representing human biology.&#34;

The presented protocol describes a method for a neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment of small molecule compounds.

Un saggio di escrescenza Neurite e una valutazione della neurotossicità con neuroni derivati dalla cellula del progenitore neurale umano

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides ...

Biologia dello sviluppo

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up per l&#39;indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

Un modello di coltura cellulare per studiare il ruolo delle interazioni Neuron-Glia in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to study the process of neuronal survival upon cytotoxic stress. Most methods are based on biochemical approaches that do not allow single-cell resolution or involve complex and costly methodologies. Presented here is a versatile, inexpensive, and effective experimental paradigm to study neuronal survival. This method takes advantage of sparse fluorescent labeling of the neurons followed by live imaging and automated quantification. To this aim, the neurons are electroporated to express fluorescent markers and co-cultured with non-electroporated neurons to easily regulate cell density and increase survival. 
Sparse labeling by electroporation allows a simple and robust automated quantification. In addition, fluorescent labeling can be combined with the co-expression of a gene of interest to study specific molecular pathways. Here, we present a model of stroke as a neurotoxic model, namely, the oxygen-glucose deprivation (OGD) assay, which was performed in an affordable and robust homemade hypoxic chamber. Finally, two different workflows are described using IN Cell Analyzer 2200 or the open-source ImageJ for image analysis for semi-automatic data processing. This workflow can be easily adapted to different experimental models of toxicity and scaled up for high-throughput screening. In conclusion, the described protocol provides an approachable, affordable, and effective in vitro model of neurotoxicity, which can be suitable for testing the roles of specific genes and pathways in live imaging and for high-throughput drug screening.

Here, we present a simple, potent, and versatile methodology to investigate neuronal survival upon cytotoxic stress in primary cortical neurons with cellular resolution in real time or in fixed material.

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to ...

 Protocollo di co-coltura primaria di microglia e neuroni per studi di interazione con il SNC

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

Autore in primo piano: Modello di co-coltura in vitro per lo studio delle interazioni microglia-neuroni in condizioni di malattia

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l'analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

Trascrizione

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Studio gliali eterogeneità Influenza sulla crescita cellulare Axon Utilizzando un nuovo metodo co-coltura

Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Un multi-vano SNC Neuron-glia Co-cultura Microfluidic piattaforma

Un saggio di escrescenza Neurite e una valutazione della neurotossicità con neuroni derivati dalla cellula del progenitore neurale umano

La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An

Un modello di coltura cellulare per studiare il ruolo delle interazioni Neuron-Glia in Ischemia

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

Generazione e co-coltura di microglia primarie murine e neuroni corticali

Generazione e co-coltura di microglia primarie murine e neuroni corticali

Generazione e co-coltura di microglia primarie murine e neuroni corticali