著者は、博士に感謝します。これらのプロジェクトとプロトコルの開発中に支援のためのリックライアン、Umesh Patelさん、ジェフティル、マシュースー、JehangirミストリーとミケーレHatler。

細胞の準備： <ol><li>増殖培地のアッセイは、培養ニューロン/アストロサイトのための細胞播種の前になるまで〜70-80％のコンフルエント（細胞が融解または分離から直接シードでない限り）。 </li><li>目的の細胞の種類に適したメソッドを介して培養フラスコ/プレートから細胞を剥離する。必要に応じて、ポリ- D -リジン又は細胞外マトリックス蛋白質とコートのアッセイプレートのウェルに細胞接着を強化する。アストロサイトとニューロンの共培養は、同時または逐次にシードされる可能性があります。シーケンシャルseedingsの場合は、&quot;基底&quot;レイヤーとして最初のアストロサイトのメッキは、必要に応じて神経細胞のプレーティングと分化が続く、推奨されます。文化の時代、セルのソースおよび播種密度に応じて他のセルのタイプ、その後の培養時間、目的のパラメータ、に応じて細胞密度を調整し、初代培養は、増殖の速度、GFAPの発現や神経突起の伸長に大きく異なる場合があります - それは重要です特徴づけ、最適化して細胞のシステムをほとんどの生物学あなたの実験モデルの妥当性だけでなく、HCSを使用して効果的な画像処理、セグメンテーションと分析を提供するを提供する（図1参照）。プレート（細胞は以下のステップ3で説明したように毒素の治療を容易にするために、90μLメディアでシードされる可能性があります）にセルを追加した後、プレートをさらにcell配布を可能にする、15〜30分間室温温度でレベルの表面に座ってできます。増殖培地で、培養するには（37℃/ 5％CO 2）、分化の培養条件（例えば、PC12細胞の低血清/ NGF）に切り替えてから、少なくとも24時間はこの期間、必要に応じて、次の。細胞は細胞のタイプに適切な間隔でメディアを変更して、合流または分化の目的のレベルに達するまで培養を継続。 </li><li>細胞治療は、（制御化合物、試験化合物、等）興味の治療の時間経過に応じて、この培養期間中の任意の時点で導入することができる。アクリルアミド、過酸化水素とK - 252Aは、神経毒性の制御化合物として提供されています。十分な試薬は、5つすべてを96ウェルプレート用の重複した12ポイントの用量反応曲線（用量反応内の一つのdH 2 OまたはDMSO -コントロールのセットを含む）のために用意されています。化合物は、250倍濃度（K - 252A用、1μMの最大の治療を想定）や10X（アクリルアミドおよび過酸化水素のため、それぞれ100 mMおよび10 mMの、最大の治療を想定）で提供されています。推奨される治療の準備には、ハーフログが含まれます：の化合物希釈緩衝液で希釈し、次いで（1√10）DMSO中の250X化合物の希釈系列を、10X（のdH 2 Oに起因10X制御化合物は、連続的滅菌のdH 2 Oで直接希釈してもよいまたは化合物の希釈バッファー）。各治療の10μLを、最終的な1X濃度（0.4％DMSOまたは10％のdH 2 O）のために、各ウェル内にすでに存在する培養培地90μLを加えてもよい。サンプルデータは、° C固定前に37℃で化合物の治療の24または96時間のために提供されています。 </li></ol>細胞の固定と免疫蛍光染色： 注：染色時間は約2.5時間後に固定です。井戸は、染色のステップ間を乾燥させないようにしてください。試薬の吸引と摂理は、流体の剪断に起因する任意のセルの損失を減少させるために低流量で実施されるべきである。すべての&quot;ウェルあたりの推奨量は96ウェルマイクロプレートの1ウェルを参照してください。推奨されるすべての&quot;当たり96 ​​ウェルプレート&quot;のボリュームは、液体の取扱量の損失の25％の超過などがあります。すべての染色ステップは室温（RT）で実行されます。すべてのバッファと抗体溶液を室温で少なくとも24時間安定です。 <ol start="4"><li>培養期間の終了時に、室温（RT）または37℃に予熱するHCSの固定液（2X）（12 mL/96-wellプレート）必要に応じて。化学煙フードでは、直接培地に100μl/ウェルを追加し、室温で30分間固定することができます。 （MSDSを参照）固定/毒素含有培地を取り除き、有害廃棄物規制に準拠して処分する。染色にすぐに進む場合、HCS免疫緩衝液200μlで二回の各ウェルを洗う。また、プレートはあとで染色される場合は、洗浄緩衝液200μlで二回リンス、2番目のしっかりと染色されるまで4℃で密封井戸や店舗のプレートでボリュームをすすぎ残す。 </li><li>固定試料は染色する前に、4℃で保存されている場合は、染色プロトコールに進む前に200μLHCS免疫緩衝液で2回すすいでください。 </li><li>次のように、ウサギ抗βIIIチューブリン/マウス抗GFAP HCS一次抗体（6 mL/96-wellプレート）のワーキング溶液を調製します：HCS免疫バッファの5.88 mLにそれぞれ解凍した一次抗体60μLを追加する。よく混ぜる。以前の免疫蛍光バッファリンス取り外します。各ウェルに一次抗体溶液50μLを追加し、室温で1時間インキュベートします。 </li><li>一次抗体を除去ソリューション。 200μLHCS免疫の緩衝液で3回リンス。 </li><li>次のようHCS二次抗体/ヘキストHCS核染色（6 mL/96-wellプレート）のワーキング溶液を調製します：それぞれの融解二次抗体30μLと融解ヘキストHCS核の30μLHCS免疫バッファの5.91 mLにステインを追加する。光からソリューションを保護する、よく混ぜる。すすぎ前のHCS免疫バッファを削除します。 HCS二次抗体/ヘキストHCS核染色液の50μLを追加し、光から保護RT、で1時間インキュベートする。 </li><li> HCS二次抗体/ヘキストHCS核染色溶液を除去。 200μLHCS免疫緩衝液で2回リンスします。 </li><li>すすぎ前のHCS免疫バッファを削除します。井戸第二リンスボリュームを残し、HCSの洗浄バッファーを200μLで二回リンスします。 </li><li> 4℃ですぐにシールプレートおよび画像、またはストアのプレートは、イメージングのための準備が整うまで、光から保護。 </li></ol>画像の収集と解析： <ol start="12"><li>ステンドグラスプレートのイメージングと解析は、Cell AnalyzerのIN（GEヘルスケア）、ArrayScan（ThermoFisherサイエンティフィック）やオペラ（パーキンエルマー社）を含む、利用可能なHCSプラットフォーム、様々な時に実行されることがあります。イメージングと解析のためのいくつかのガイドラインを表1に提供されています。 </li></ol><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4"> HCS222画像集録ガイドライン </td></tr><tr><td> 検出試薬 </td><td> 対物レンズ </td><td> 励起フィルタ範囲[ピーク/帯域幅（nm）の] </td><td> エミッションフィルターレンジ[ピーク/帯域幅（nm）の] </td></tr><tr><td>ヘキストHCS核は​​染色</td><td> 20X </td><td> 40分の360 </td><td> 40分の460（または必要に応じて50分の535） </td></tr><tr><td> HCS二次抗体、FITC -ロバ抗ウサギIgG </td><td> 20X </td><td> 40分の480 </td><td> 50分の535 </td></tr><tr><td> HCS二次抗体、Cy3でロバ抗マウスIgG </td><td> 20X </td><td> 50分の535 </td><td> 50分の600 </td></tr></tbody></table> <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4" width="545"> HCS222画像解析のガイドライン </td></tr><tr><td> セルのパラメータ </td><td> 検出 </td><td> セグメンテーション/測定 </td><td> 論理的根拠 </td></tr><tr><td>細胞数、核特性</td><td>ヘキストHCS核は​​染色</td><td>核領域（460nmの発光チャネル）。核の数をカウントします。 DNAの含有量（核強度）や核領域の解析も可能です。 </td><td>セル損失、毒性の表現型、などが別々の神経細胞およびアストロサイトの細胞数/特性評価を得るためにβIII-チューブリンまたはGFAPの発現に関連するものを&quot;フィルタ&quot;核缶（強く推奨）を決定する細胞数、核特性を使用してください。 </td></tr><tr><td> βIII-チューブリンの発現、神経突起伸長</td><td> HCS二次抗体、FITC結合</td><td>細胞質領域（535 nmの発光チャネル）。 FITCのシグナルは、神経突起（ 例えば 、最小値/平均細胞体領域を介して、最大値/最小神経突起の長さと幅）から神経細胞体を区別するために使用されることがあります。このような全体の神経突起の長さは、神経突起カウント/セル、などなどのパラメータを決定する</td><td>神経突起伸長の測定は、神経細胞分化の過程や化学傷害、疾患の状態、等の結果として変調された可能性があります異なる神経細胞の特性を（強く推奨）を取得するためにβIII-チューブリンの発現に関連するものを&quot;フィルタ&quot;細胞体できます。 </td></tr><tr><td> GFAPの発現、アストロサイトエリア </td><td> HCS二次抗体、Cy3結合 </td><td>細胞質領域（600 nm発光のチャネル）。 Cy3シグナルがアストロサイトの細胞質セグメンテーションを定義するために使用されることがあります。このような平均的な細胞質シグナル強度、セル面積、などのパラメータを決定する</td><td> GFAPの発現と星状細胞の面積は、アストロサイトの開発中または化学的傷害、疾患の状態の結果として変調された可能性がある、などが明確な星状膠細胞の特性を（強く推奨）を取得するためにGFAP発現と関連するもののために細胞体を&quot;フィルタリング&quot;することができます。 </td></tr></tbody></table> 表1画像取得と分析ガイドライン- HCS222βIII-Tubulin/GFAP（共培養）アッセイ代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/1173/figure31173.png" alt="図3" /> 図1。 βIII-チューブリン及びGFAP immunofluore混合ラットの神経細胞培養のscence。 PC12細胞は神経細胞の播種に続いて、培養中の数日間前めっきのアストロサイトによって生成された初代ラット海馬神経細胞またはラットのいずれかと初代ラット海馬アストロサイトの共培養。 PC12sが分化条件（低血清/ NGF）の下にさらに2日間培養しながら一次ニューロンは、追加の11日間培養した。セル処理、固定および免疫染色HCS222アッセイのプロトコールに従って実施した。細胞は20倍（一次ニューロン）や10X（PC12）客観的な倍率でセルアナライザー1000（3.3）でGE上に結像し、セルアナライザー1000ワークステーション（3.4）神経細胞とマルチターゲット分析のアルゴリズムではGEを用いて分析したトップパネルが。：ヘキストHCSステイン核（青）、βIII-チューブリン（緑）およびGFAP（赤）蛍光の融合画像。別βIII-チューブリンの蛍光チャネルの解析神経突起伸長のセグメンテーションを可能にする（ 中央のパネル：青（一次ニューロンに記載されている細胞体）や黄色（PC12）、緑（一次ニューロンの神経突起）や水色（PC12））。 GFAPのチャネルの分析は、アストロサイトセグメンテーション（：青、緑の細胞質に記載されている核下のパネル ）が可能になります。に別々のセルのカウントを可能にする、（赤） - （）ラット初代海馬ニューロン/アストロサイトの共培養のためのGFAPのセグメンテーションは、GFAP（+）（緑アウトライン）とGFAPされるものである核/細胞体を区別する能力を示しています混合培養設定のニューロンとアストロサイト。 <img src="/files/ftp_upload/1173/figure41173.png" alt="図4" /> <img src="/files/ftp_upload/1173/figure4.51173.png" alt="図4パート2" /> 図2。毒性ストレスに対するラット初代海馬ニューロン/アストロサイト共培養の用量が応答。 初代ラット海馬アストロサイトは、（P6）増殖培地で96ウェルプレートに播種し、6日間培養した。初代ラット海馬ニューロンを（解凍から直接）、事前メッキアストロサイトの上に播種し、11日間増殖培地で培養した。細胞は、培養の最後の24時間のアクリルアミドまたは過酸化水素（最大濃度= 100mMのと10mm、それぞれ）の連続希釈液で処理した。セル処理、固定および免疫染色HCS222アッセイのプロトコールに従って実施した。セルはセルアナライザー1000ワークステーション（3.4）神経細胞とマルチターゲット分析のアルゴリズムではGEを使用して（細胞質/核/神経突起セグメンテーション）20X（よく10フィールド/）でセルアナライザー1000（3.3）にGE上に結像し、分析した。提示されたデータは平均± SEM、n = 3のを。複数のパラメータを（神経突起伸長、GFAPの強度、アストロサイトの領域と神経やアストロサイトの細胞数）用量依存性の傾向を調べた。

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著者らは、ミリポア社の全従業員です。

日付に、ニューロンおよびアストロサイトの混合培養を用いた神経毒性のリスク評価を研究するために設計されたin vitroの実験では限定されている。それは、グリア細胞が神経細胞に空間的および代謝のサポートを提供するのに不可欠であり、神経細胞遊走、分化、シナプス活動を含む変調いくつかの神経機能に重要な役割を果たすことはよく受け入れられている。グリアアストロサイトはまた、サイトカインと神経組織の周囲に有害反応を誘発するだけでなく、多くの毒素の神経細胞寛容を促進するの両方が可能である他の可溶性因子を放出する。神経 - グリア相互作用の深さを実証する、共培養の研究において、アストロサイトはそのような抗酸化防御と細胞のエネルギーレベルの維持など、アストロサイトの機能、、の減損がすることが示されているのに対し、酸化的ストレスの毒性に対して神経細胞を保護することが示されている批判的にニューロンの生存に影響を与える。最近の研究では、in vitroでの神経毒性試験システムでのアストロサイトの使用は、単独で神経細胞よりも人間の中枢神経系の構造と機能に、より関連性の高い証明するかもしれないことを示唆している。神経 - アストロサイト相互作用の生理的意義の意識の高まりにもかかわらず、それは以前に、インタクトな細胞で、これらの相互作用の定量的な分析を実行することは困難であった。ハイコンテントスクリーニングの出現は、この問題に対処する強力な新しいアッセイの開発が可能になります。 本研究では、我々は、単一のアッセイ内の複数のニューロンとアストロサイトの表現型の定量分析はHCAにより可能にされていることを明らかにした。一次ニューロンでは、ニューロン数、神経突起の数や神経突起の長さなどの神経毒性マーカーの定量的測定を実施している。アストロサイトでは、反応性神経膠症はGFAPの発現、アストロサイト数とアストロサイトの形態の変化によって特徴付けられる神経毒性の既知のバイオマーカー、です。我々は、これらのエンドポイントの各々が容易にHCAを経由して評価することができることを実証した。これらの研究は、神経特異的なバイオマーカーのHCAが急速に神経毒性のエンドポイント用化学薬品を大量にスクリーニングするin vitro試験での電池の一部として使用することができるという概念をサポートしています。 ニューロンとアストロサイトの共培養のためのミリポアのHCS222ハイコンテンツ分析キットは、高品質の検出試薬と同時に神経の細胞モデルの様々なβIII-チューブリンとグリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP）をプロファイリングするためのプロトコルで構成されています。このキットに付属して高度に検証された試薬は、ユーザーは、アッセイの標準化アッセイ間アッセイのばらつきを最小限に抑え、かつ再現性の高い信号対バックグラウンド比を持つ画像を生成することができます。

<table><tbody><tr><td>Rabbit Anti-&amp;#946;III-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X</td><td></td><td>Part No. CS201672</td><td>1 vial containing 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X</td><td></td><td>Part No. CS201649</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X</td><td></td><td>Part No. CS201671</td><td>1 vial containing 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X</td><td></td><td>Part No. CS200437</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst HCS Nuclear Stain, 200X</td><td></td><td>Part No. CS200438</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X</td><td></td><td>Part No. CS200434</td><td>1 bottle containing 100 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Immunofluorescence Buffer, 1X</td><td></td><td>Part No. CS200435</td><td>1 bottle containing 1000 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Wash Buffer, 1X</td><td></td><td>Part No. 2007643</td><td>1 bottle containing 500 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>Acrylamide (Control Compound), 10X</td><td></td><td>Part No. CS201679</td><td>1 vial containing 500 &amp;#x03BC;L of 1M acrylamide in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X</td><td></td><td>Part No. CS201730</td><td>1 vial containing 500 &amp;#x03BC;L of 100 mM hydrogen peroxide in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>K-252a (Control Compound), 250X</td><td></td><td>Part No. CS201741</td><td>1 vial containing 100 &amp;#x03BC;L of 250 &amp;#x03BC;M K-252a in DMSO&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>DMSO for Compound Serial Dilution</td><td></td><td>Part No. CS200441</td><td>1 bottle containing 10 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Compound Dilution Buffer</td><td></td><td>Part No. CS200442</td><td>1 bottle containing 25 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Plate Sealers</td><td></td><td>Part No. CS200443</td><td>10 each&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>tissue culture-treated black/clear bottom microplates </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCS imaging/analysis system</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity

ハイコンテント分析（HCA）のアッセイは、単一のアッセイ内の複数の細胞の表現型の測定を可能にする、自動化されたイメージングと強力な画像解析アルゴリズムを持つ細胞と検出試薬を組み合わせる。本研究では、我々は神経毒性のための新しいアッセイを開発するためにHCAを利用。神経毒性評価は、重要な薬剤の安全性評価の一部だけでなく、環境保全活動の重要な焦点であることを表します。さらに、神経毒性にも広く受け入れられています<em&gt; in vitroで</emこのようなアルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患の開発の&gt;マーカー。最近、神経細胞のスクリーニングにHCAの応用が報告されている。 βIII-チューブリンとの神経細胞を標識することにより、HCAのアッセイは、神経毒性を示すことができるすべてがそのようなニューロンの数は、神経突起の数や神経突起の長さ、などのパラメータの高スループット、非主観的、定量的な測定を提供することができます。しかし、アストロサイトの役割は、これらのモデルでは未踏のままである。アストロサイトは、中枢神経系（CNS）恒常性の維持に不可欠な役割を持っており、それらが有毒物質または疾患状態に応答して活性化される神経保護およびneurodegradationの両方に関連付けられています。 GFAPは、CNSのアストロサイトで主に発現する中間径フィラメントタンパク質である。アストロサイトの活性化（グリオーシス）は、一般的に星状膠細胞の増殖や肥大を伴うGFAPのアップレギュレーション、につながる。反応性グリオーシスのこのプロセスは、神経系の損傷の早期マーカーとして提案されている。 GFAPの定量のための伝統的な方法は、イムノアッセイによってです。このアプローチは、細胞内局在、形態および細胞数に関する情報を提供できないことによって制限されます。我々は、HCAはこれらの制限を克服すると同時に、神経膠症に関連する複数の機能を測定するために使用されることが決定 - GFAP発現の変化、アストロサイト肥大、および星状細胞増殖 - 単一のアッセイ内を。共培養の研究では、星状膠細胞は有毒な侮辱のいくつかのタイプに対してニューロンを保護し、批判的にニューロンの生存に影響を及ぼすことが示されている。最近の研究では、中のアストロサイトの使用が示唆されている<em&gt; in vitroで</em&gt;神経毒性試験システムは、単独で神経細胞よりも人間の中枢神経系の構造と機能との関連性が高いことを証明することがあります。したがって、我々は、プロトコルおよびβIII-チューブリンとグリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP）をプロファイリングするための検証、ターゲット固有の検出試薬で構成されるニューロンとアストロサイトの共培養、用HCAアッセイを開発した。このアッセイは、神経毒性評価のための小説、非主観的、ハイスループットアッセイを表す、細胞モデルの多種多様な神経毒性、神経突起伸長、神経膠症、神経およびアストロサイトの形態と神経細胞とアストロサイトの開発の同時分析が可能になります。アッセイは、神経科学研究と創薬の神経毒性と生産性向上の強化を検出するための大きな可能性を秘めている。

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

この記事では、新規プロトコルと試薬の高いコンテンツの分析を用いてニューロンとアストロサイトの共培養での化合物および治療の神経毒性効果の感度測定のために設計されたセットを説明します。結果は、高含有量の分析は、神経毒性評価のためのエキサイティングな新技術を表すことを示している。

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is very poor 1. The failure of axon regeneration is a combined result of several factors including the hostile glial cell environment, inhibitory myelin related molecules and decreased intrinsic neuron regenerative capacity 2. Astrocytes are the most predominant glial cell type in central nervous system and play important role in axon functions under physiology and pathology conditions 3. Contrast to the homologous oligodendrocytes, astrocytes are a heterogeneous cell population composed by different astrocyte subpopulations with diverse morphologies and gene expression 4. The functional significance of this heterogeneity, such as their influences on axon growth, is largely unknown.
To study the glial cell, especially the function of astrocyte heterogeneity in neuron behavior, we established a new method by co-culturing high purified dorsal root ganglia neurons with glial cells obtained from the rat cortex. By this technique, we were able to directly compare neuron adhesion and axon growth on different astrocytes subpopulations under the same condition.
In this report, we give the detailed protocol of this method for astrocytes isolation and culture, dorsal root ganglia neurons isolation and purification, and the co-culture of DRG neurons with astrocytes. This method could also be extended to other brain regions to study cellular or regional specific interaction between neurons and glial cells.

In this protocol, we described a new method to study the influence of glial cell heterogeneity on axon growth with an in vitro co-culture system. Rat cortical glial cells were cultured to confluence and cocultured with highly purified rat dorsal root ganglia neurons. Different glial cell influence on neurons adhesion and axon growth was compared directly in the same culture. This method provides a new way to directly study the glial cell heterogeneity influence on neuron adhesion and axon growth.

新しい共培養法を用いた軸索の成長に関する研究グリア細胞の不均一性の影響

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

神経科学

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

マイクロ流体文化·プラットフォーム（MCP）ベースの神経軸索とグリア共培養系におけるグリア相互作用へのニューロンのイメージング解析

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

マルチコンパートメントのCNSニューロングリア共培養マイクロ流体プラットフォーム

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

生物学

A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides reliable analysis of neuronal morphology together with quantitative measurements of modifications on neurite length and synaptic protein localization and abundance upon treatment with small molecule compounds. In addition to the application of the presented method in neurite outgrowth studies, neurotoxicity assessment can be performed to assess, distinguish and rank commercial chemical compounds based on their potential developmental neurotoxicity effect.
Even though cell lines are nowadays widely used in compound screening assays in neuroscience, they often differ genetically and phenotypically from their tissue origin. Primary cells, on the other hand, maintain important markers and functions observed in vivo. Therefore, due to the translation potential and physiological relevance that these cells could offer neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment can considerably benefit from using human neural progenitor cells (hNPCs) as the primary human cell model.
The presented method herein can be utilized to screen for the ability of compounds to induce neurite outgrowth and neurotoxicity by taking advantage of the human neural progenitor cell-derived neurons, a cell model closely representing human biology.&#34;

The presented protocol describes a method for a neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment of small molecule compounds.

神経前駆細胞由来ニューロンを用いた神経突起増殖アッセイと神経毒性評価

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides ...

発生生物学

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

間接ニューロン、星状細胞共培養アッセイ：<em&gt;インビトロ</em&gt;ニューロングリアの相互作用の詳細な調査のためのセットアップ

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

虚血におけるニューロングリア相互作用の役割を研究するための細胞培養モデル

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to study the process of neuronal survival upon cytotoxic stress. Most methods are based on biochemical approaches that do not allow single-cell resolution or involve complex and costly methodologies. Presented here is a versatile, inexpensive, and effective experimental paradigm to study neuronal survival. This method takes advantage of sparse fluorescent labeling of the neurons followed by live imaging and automated quantification. To this aim, the neurons are electroporated to express fluorescent markers and co-cultured with non-electroporated neurons to easily regulate cell density and increase survival. 
Sparse labeling by electroporation allows a simple and robust automated quantification. In addition, fluorescent labeling can be combined with the co-expression of a gene of interest to study specific molecular pathways. Here, we present a model of stroke as a neurotoxic model, namely, the oxygen-glucose deprivation (OGD) assay, which was performed in an affordable and robust homemade hypoxic chamber. Finally, two different workflows are described using IN Cell Analyzer 2200 or the open-source ImageJ for image analysis for semi-automatic data processing. This workflow can be easily adapted to different experimental models of toxicity and scaled up for high-throughput screening. In conclusion, the described protocol provides an approachable, affordable, and effective in vitro model of neurotoxicity, which can be suitable for testing the roles of specific genes and pathways in live imaging and for high-throughput drug screening.

Here, we present a simple, potent, and versatile methodology to investigate neuronal survival upon cytotoxic stress in primary cortical neurons with cellular resolution in real time or in fixed material.

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to ...

 CNS相互作用研究のための一次ミクログリアとニューロン共培養プロトコール

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

著者スポットライト:疾患状態におけるミクログリアとニューロンの相互作用を研究するためのin vitro共培養モデル

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

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新しい共培養法を用いた軸索の成長に関する研究グリア細胞の不均一性の影響

マイクロ流体文化·プラットフォーム（MCP）ベースの神経軸索とグリア共培養系におけるグリア相互作用へのニューロンのイメージング解析

マルチコンパートメントのCNSニューロングリア共培養マイクロ流体プラットフォーム

神経前駆細胞由来ニューロンを用いた神経突起増殖アッセイと神経毒性評価

間接ニューロン、星状細胞共培養アッセイ：

虚血におけるニューロングリア相互作用の役割を研究するための細胞培養モデル

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

マウス初代ミクログリアと皮質ニューロンの作製と共培養

マウス初代ミクログリアと皮質ニューロンの作製と共培養

マウス初代ミクログリアと皮質ニューロンの作製と共培養