Die Autoren bedanken sich bei Dr. danken. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till, Matthew Hsu, Jehangir Mistry und Michele Hatler für die Unterstützung während der Entwicklung dieser Projekte und Protokolle.

Cell Preparation: <ol><li> Vor Zellaussaat für Test-, Kultur-Neuronen / Astrozyten in Nährmedien bis ~ 70-80% konfluent (es sei denn, Zellaussaat direkt vom Tauwetter oder Isolation). </li><li> Lösen Sie Zellen aus Kulturflaschen / Platten über geeignete Methode für Zelltyp von Interesse. Wenn nötig, zu beschichten Assayplatte Brunnen mit Poly-D-Lysin oder extrazellulären Matrix-Proteins zu verbessern Zelladhäsion. Co-Kulturen von Astrozyten und Neuronen können gleichzeitig oder nacheinander ausgesät werden. Für die sequentiellen Setzliste ist plating von Astrozyten zunächst als &quot;basal&quot; Schicht empfohlen, gefolgt von neuronalen Beschichtung und Differenzierung, wenn nötig. Passen Zelldichte gegebenenfalls für die Zell-Typ, nachfolgende Kultur der Zeit, Parameter von Interesse, etc. Je nach Kultur Alters-, Zell-Quelle und Aussaatdichte, können primäre Kulturen sehr unterschiedlich in Proliferationsrate, GFAP Ausdruck oder Neuritenwachstum - ist es wichtig, charakterisieren und optimieren Sie Ihre Zellsystem zu den biologischen Relevanz für Ihre experimentellen Modell, als auch für eine effektive Bildverarbeitung, Segmentierung und Analyse mit HCS (siehe Abbildung 1) bereitzustellen. Nach Hinzufügen von Zellen zu Platte (Zellen können in 90 ul Medien ausgesät werden, um Toxin-Behandlung zu erleichtern, wie in Schritt 3 beschrieben), ermöglichen Platte auf einer ebenen Fläche bei Raumtemperatur stehen lassen für 15-30 min, so dass auch Zellverteilung. Nach dieser Zeit inkubieren Zellen in Wachstumsmedium (37 ° C / 5% CO 2) für mindestens 24 Stunden, dann die Differenzierung Kulturbedingungen Schalter (zB niedrige Serum / NGF für PC12-Zellen), als angemessen. Weiter Kultur, bis die Zellen gewünschte Zusammenfluss oder Differenzierung zu erreichen, wechselnden Medien angemessenen Abständen Zelltyp. </li><li> Zell-Therapien (Kontrolle Verbindungen, Testverbindungen, etc.) können an jedem Punkt in dieser Kultur Frist eingeführt werden, je nach Zeit-Verlauf der Behandlung von Interesse. Acrylamid, Wasserstoffperoxid und K-252a als neurotoxische Kontrolle Verbindungen zur Verfügung gestellt. Ausreichende Reagenzien sind für die doppelte 12-Punkte-Dosis-Wirkungs-Kurven (einschließlich eines dH 2 O oder DMSO-Kontrolle gesetzt innerhalb der Dosis-Wirkungs-) für alle fünf 96-Well-Platten zur Verfügung gestellt. Die Verbindungen sind bei 250X-Konzentration (für K-252a, der Annahme einer maximalen Behandlung von 1 nM) oder 10X (für Acrylamid und Wasserstoffperoxid von einer maximalen Behandlungen von 100 mM und 10 mM bzw.) zur Verfügung gestellt. Empfohlene Behandlung Vorbereitung umfasst Halb-log (1: √ 10) Verdünnungsreihe des 250X Verbindung in DMSO, durch Verdünnung in Verbindung Verdünnungspuffer zu folgen 10X (10X Kontrolle Verbindungen mit Ursprung in dH 2 O kann seriell verdünnt direkt in sterile dH 2 O oder Compound Verdünnungspuffer). 10 ul jeder Behandlung kann dann die 90 ul von Kulturmedien bereits in jede Vertiefung gegeben werden, für eine endgültige 1X-Konzentration (0,4% DMSO oder 10% dH 2 O). Sample-Daten ist für 24 oder 96 Stunden der Verbindung der Behandlung bei 37 ° C vor der Fixierung zur Verfügung gestellt. </li></ol> Zellfixierung und Immunfluoreszenzfärbung: Hinweis: Die Färbung beträgt ~ 2,5 Stunden nach der Fixierung. Nicht in die Brunnen austrocknen zwischen Färbeschritte. Aspiration und Dispensation von Reagenzien sollten bei niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten durchgeführt werden, um eine beliebige Zelle Verlust durch Fluidscherung verringern. Alle empfohlenen &quot;pro Well &#39;Volumina beziehen sich auf einen einzigen Vertiefung einer 96-well Mikroplatten. Alle empfohlenen &quot;pro 96-Well-Platte &#39;Bände enthalten 25% Selbstbeteiligung für Liquid-Handling-Volumen Verlust. Alle Färbung Schritte sind bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt. Alle Puffer und Antikörper-Lösungen sind für mindestens 24 Stunden bei RT stabil. <ol start="4"><li> Am Ende der Kulturzeit, pre-warm HCS Fixation Solution (2X) auf Raumtemperatur (RT) oder 37 º C, falls gewünscht (12 mL/96-well Platte). In einem Laborabzug, 100 l / well direkt auf Nährböden und lassen Sie sie für 30 min bei RT fixieren. Entfernen Fixativ / Toxin-haltigen Medien und entsorgen unter Einhaltung von Vorschriften für gefährliche Abfälle (siehe Sicherheitsdatenblatt). Wenn Sie fortfahren sofort Färbung, die jeweils gut ausspülen zweimal mit 200 ul der HCS Immunfluoreszenz Buffer. Alternativ, wenn die Platten zu einem späteren Zeitpunkt gebeizt werden, zweimal gründlich mit 200 ul Waschpuffer, dann lassen Sie zweiten Spülung Volumen in Brunnen und speichern Platten dicht bei 4 º C bis Färbung versiegelt. </li><li> Wenn festen Proben bei 4 º C vor dem Färben gespeichert wurden, zweimal gründlich mit 200 ul HCS Immunfluoreszenz Buffer, bevor Sie mit Färbeprotokoll. </li><li> Bereiten Sie arbeiten Lösung von Kaninchen Anti-βIII Tubulin / Mouse Anti-GFAP HCS Primärantikörper (6 mL/96-well Platte) wie folgt: Fügen Sie 60 ul jeder aufgetaut Primärantikörper bis 5,88 ml HCS Immunfluoreszenz Buffer. Gut mischen. Entfernen Sie ältere Immunfluoreszenz Buffer spülen. Dann werden 50 ul der Primary Antibody-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren für 1 Stunde bei RT. </li><li> Entfernen des primären AntikörpersLösung. Spülen Sie dreimal mit 200 ul HCS Immunfluoreszenz Buffer. </li><li> Bereiten Sie arbeiten Lösung von HCS Sekundäre Antikörper / Hoechst HCS Kernfärbung (6 mL/96-well Platte) wie folgt: Fügen Sie 30 ul jeder aufgetaut sekundären Antikörper und 30 ul aufgetauten Hoechst HCS Kernfärbung zu 5,91 ml HCS Immunfluoreszenz Buffer. Gut mischen, Schutz-Lösung von Licht. Entfernen Sie ältere HCS Immunfluoreszenz Buffer spülen. Dann werden 50 ul der HCS Sekundäre Antikörper / Hoechst HCS Nuclear Stain-Lösung und Inkubation für 1 Stunde bei RT vor Licht geschützt. </li><li> Entfernen HCS Sekundäre Antikörper / Hoechst HCS Kernfärbung Lösung. Spülen Sie zweimal mit 200 ul HCS Immunfluoreszenz Buffer. </li><li> Entfernen Sie ältere HCS Immunfluoreszenz Buffer spülen. Spülen Sie zweimal mit 200 ul der HCS Waschpuffer, verlassen zweiten Spülung Volumen in Brunnen. </li><li> Seal Platte und Bild sofort oder zu speichern Platte bei 4 º C vor Licht, bis sie zur Bildgebung geschützt. </li></ol> Image Acquisition and Analysis: <ol start="12"><li> Imaging und Analyse von gefärbten Platten können von einer Vielzahl von verfügbaren HCS-Plattformen, einschließlich der IN Cell Analyzer (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher Scientific) oder Opera (Perkin Elmer) durchgeführt werden. Einige Leitlinien für die Bildgebung und Analyse sind in Tabelle 1 angegeben: </li></ol><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4"> HCS222 Image Acquisition Richtlinien </td></tr><tr><td> Nachweisreagenz </td><td> Objektivdurchmesser </td><td> Anregungsfilter Range [peak / Bandbreite (nm)] </td><td> Emission Filter Range [peak / Bandbreite (nm)] </td></tr><tr><td> Hoechst HCS Kernfärbung </td><td> 20X </td><td> 360/40 </td><td> 460/40 (oder 535/50 falls erforderlich) </td></tr><tr><td> HCS Sekundäre Antikörper, FITC-Donkey anti-Rabbit IgG </td><td> 20X </td><td> 480/40 </td><td> 535/50 </td></tr><tr><td> HCS Sekundäre Antikörper, Cy3-Donkey anti-Mouse IgG </td><td> 20X </td><td> 535/50 </td><td> 600/50 </td></tr></tbody></table> <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4" width="545"> HCS222 Image Analysis Richtlinien </td></tr><tr><td> Zellparameter </td><td> Erkennung </td><td> Segmentation / Measurement </td><td> Gründe </td></tr><tr><td> Zellzahl, Nuclear Eigenschaften </td><td> Hoechst HCS Kernfärbung </td><td> Nuclear Region (460 nm-Emission-Kanal). Count Anzahl der Kerne. DNA-Gehalt (nuclear Intensität) oder nuklearen Bereich Analysen sind ebenfalls möglich. </td><td> Verwenden Sie Zellzahl, nukleare Eigenschaften Zellverlust, Toxizität Phänotypen, etc. bestimmen kann &quot;Filter&quot; Kerne für Menschen mit βIII-Tubulin oder GFAP Expression assoziiert zu trennen neuronalen und astrozytären Zellzahlen / Charakterisierungen (dringend empfohlen) zu erhalten. </td></tr><tr><td> βIII-Tubulin Expression, Neuritenwachstum </td><td> HCS Sekundäre Antikörper, FITC-konjugierten </td><td> Cytoplasmatische Region (535 nm-Emission-Kanal). FITC-Signal kann verwendet werden, um neuronale Zellkörper von Neuriten (zB via Minimum / Durchschnitt Zellkörper Bereichen, Minimum / Maximum Neuriten Längen und Breiten) zu unterscheiden. Bestimmen Sie Parameter wie insgesamt Neuritenlänge, Neuriten counts / Zelle, etc. </td><td> Neuritenwachstum Messungen können während der neuronalen Differenzierung oder als Folge von chemischen Verletzungen, Erkrankungen, etc. moduliert Kann &quot;filtern&quot; Zellkörper für Menschen mit βIII-Tubulin-Expression assoziiert zu verschiedenen neuronalen Charakterisierung (dringend empfohlen) zu erhalten. </td></tr><tr><td> GFAP Expression, Astrocyte Bereich </td><td> HCS Sekundäre Antikörper, Cy3-konjugierten </td><td> Cytoplasmatische Region (600 nm-Emission-Kanal). Cy3-Signal kann verwendet werden, um astrozytären zytoplasmatische Segmentierung zu definieren. Bestimmen Sie Parameter wie mittlere zytoplasmatische Signalintensität, Zellfläche, etc. </td><td> GFAP Expression und Astrozyten Zellfläche kann während Astrozyten Entwicklung oder als Folge von chemischen Verletzungen, Erkrankungen moduliert, etc. Kann &quot;filtern&quot; Zellkörper für die mit GFAP-Expression assoziiert zu deutlichen astrozytären Charakterisierung (dringend empfohlen) zu erhalten. </td></tr></tbody></table> . Tabelle 1 Image Acquisition and Analysis Guidelines - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (Co-Kultur) Assay Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/1173/figure31173.png" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 1. βIII-Tubulin und GFAP immunofluoreScence gemischter Ratte neuronalen Zellkulturen. Co-Kulturen von primären Ratten-Hippocampus Astrozyten entweder mit primären Ratten-Neuronen im Hippocampus oder Ratte PC12 Zellen wurden durch Vor-Vernickelung Astrozyten für mehrere Tage in Kultur, durch neuronale Aussaat folgte generiert. Primäre Neuronen wurden für weitere 11 Tage kultiviert, während PC12s für weitere 2 Tage unter Differenzierung Bedingungen (niedrige Serum / NGF) kultiviert wurden. Handhabung von Zellen, Fixierung und Immunfärbung wurden nach HCS222 Assayprotokolle durchgeführt. Die Zellen wurden auf der GE IN Cell Analyzer 1000 (3.3) bei 20-fach (primären Neuronen) oder 10X (PC12) Objektivvergrößerung abgebildet und analysiert werden mit dem GE IN Cell Analyzer 1000 Workstation (3,4) Neuritenwachstum und Multi Target-Analyse-Algorithmen Top-Panel.: Fused Bilder von Hoechst HCS Kernfärbung (blau), βIII-Tubulin (grün) und GFAP (rot) Fluoreszenz. Eine getrennte Analyse der βIII-Tubulin-Fluoreszenz-Kanal ermöglicht Neuritenwachstum Segmentierung (mittlere Tafel: Zellkörper in blau (primären Neuronen beschrieben) oder gelb (PC12), Neuriten in grün (primären Neuronen) oder hellblau (PC12)). Die Analyse der GFAP-Kanal ermöglicht Astrozyten Segmentierung (unten: Kerne in blau, Zytoplasma in grün dargestellt). GFAP-Segmentierung für die primären Ratten-Hippocampus Neuronen / Astrozyten Co-Kultur zeigt die Fähigkeit, zwischen den Kernen / Zellkörper, dass GFAP (+) (Grün Umrisse) und diejenigen, die GFAP sind zu unterscheiden (-) (rot), so dass getrennte Zellzahlen für Neuronen und Astrozyten in einer Mischkultur Einstellung. <img src="/files/ftp_upload/1173/figure41173.png" alt="Abbildung 4" /> <img src="/files/ftp_upload/1173/figure4.51173.png" alt="Abbildung 4 part2" /> Abbildung 2. Dose Reaktionen der primären Ratten-Hippocampus Neuronen / Astrozyten Co-Kulturen zu toxischen Belastungen. Primäre Ratten-Hippocampus Astrozyten (P6) wurden auf 96-Well-Platten in Nährmedien ausgestrichen und kultiviert für 6 Tage. Primäre Ratten-Neuronen im Hippocampus (direkt von Tauwetter) wurden dann auf der Oberseite der zuvor abgeschiedenen Astrozyten ausgesät und kultiviert in Nährmedien für 11 Tage. Die Zellen wurden mit seriellen Verdünnungen von Acrylamid oder Wasserstoffperoxid (max. Konzentration = 100mm und 10mm bezeichnet) für die letzten 24 Stunden der Kultur behandelt. Handhabung von Zellen, Fixierung und Immunfärbung wurden nach HCS222 Assayprotokolle durchgeführt. Die Zellen wurden auf der GE IN Cell Analyzer 1000 (3.3) bei 20X (10 Felder / well) abgebildet und analysiert (nuklearen / cytoplasmatischen / Neuriten Segmentierung) mit der GE IN Cell Analyzer 1000 Workstation (3,4) Neuritenwachstum und Multi Target-Analyse-Algorithmen. Die vorgelegten Daten sind Mittelwert ± SEM, n = 3. Mehrere Parameter (Neuritenwachstum, GFAP Intensität, Astrozyten und neuronalen Bereich oder astrozytären Zellzahl) wurden für eine dosisabhängige Trends untersucht.

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	<li>Radio, N. M., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+neurotoxicity+testing+in+vitro:+models+for+assessing+chemical+effects+on+neurite+outgrowth.">Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth.</a> Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).</li><li>Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphology-+and+kinetics-based+cascade+for+human+neural+cell+high+content+screening.">A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening.</a> Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).</li><li>Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta(1-42)+reduces+synapse+number+and+inhibits+neurite+outgrowth+in+primary+cortical+and+hippocampal+neurons:+A+quantitative+analysis.">Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis.</a> J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).</li><li>Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+screening+assay+for+chemical+effects+on+proliferation+and+viability+of+immortalized+human+neural+progenitor+cells.">Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells.</a> Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).</li><li>Radio, N. M., Breier, J. M., Shafer, T. J., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+chemical+effects+on+neurite+outgrowth+in+PC12+cells+using+high+content+screening.">Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening.</a> Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).</li><li>Harry, G. J., Tiffany-Castiglioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+neurotoxic+potential+by+use+of+in+vitro+systems.">Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).</li><li>Prockop, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allegory+of+a+mountain:+an+environmental+introduction+to+neurotoxicology.">The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology.</a> J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).</li><li>Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+neurotoxicity+test-system,+using+human+post-mitotic,+astrocytic+and+neuronal+cell+lines+in+co-culture.">Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture.</a> Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).</li><li>Holden, L. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+astrogliotic+responses+of+three+human+astrocytoma+cell+lines+to+ethanol,+trimethyltin+chloride+and+acrylamide.">Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide.</a> Toxicology. 241, 75-83 (2007).</li><li>R&#246;hl, C., Lucius, R., Sievers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+activated+microglia+on+astrogliosis+parameters+in+astrocyte+cultures.">The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures.</a> Brain Res. 1129, 43-52 (2007).</li><li>Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein:+GFAP-thirty-one+years+(1969-2000).">Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000).</a> Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).</li><li>Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+regulates+astrocyte+proliferation+and+reactive+gliosis+via+a+JNK/c-Jun+signaling+pathway.">Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway.</a> J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).</li><li>O'Callaghan, J. P., Sriram, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein+and+related+glial+proteins+as+biomarkers+of+neurotoxicity.">Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity.</a> Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).</li><li>Mead, C., Pentreath, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+toxicity+indicators+in+rat+primary+astrocytes,+C6+glioma+and+human+1321N1+astrocytoma+cells:+can+gliotoxicity+be+distinguished+from+cytotoxicity?.">Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity?.</a> Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).</li><li>Balls, M., Walum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11:+towards+the+acceptance+of+in+vitro+neurotoxicity+tests.">Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests.</a> Neurotoxicology In Vitro. , 269-283 (1999).</li><li>Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+and+environmental+estrogenic+chemicals+exert+developmental+effects+on+rat+hypothalamic+neurons+and+glias.">Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias.</a> Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).</li><li>Weible, M. W., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+neural+stem+cells+from+human+fetal+spinal+cord:+synergistic+effect+of+LIF+and+BMP4+to+generate+astrocytes.">Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes.</a> Glia. 55, 1156-1168 (2007).</li><li>Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+released+by+rat+type+1+astrocytes+exert+different+effects+on+the+proliferation+of+human+neuroblastoma+cells+(SH-SY5Y)+in+vitro.">Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro.</a> Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).</li><li>Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+metabolism+in+brain+metabolic+interaction+between+astrocytes+and+neurons+in+the+defense+against+reactive+oxygen+species.">Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species.</a> Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).</li><li>Crist&#242;fol, R. M., Gass&#243;, S., V&#237;lchez, D., Rodr&#237;guez-Farr&#233;, E., Sanfeliu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxic+effects+of+trimethyltin+and+triethyltin+on+human+fetal+neuron+and+astrocyte+cultures:+a+comparative+study+with+rat+neuronal+cultures+and+human+cell+lines.">Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines.</a> Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).</li></ol>

Die Autoren sind alle Mitarbeiter der Millipore Corporation.

Bis heute wurden in vitro Experimente zur Neurotoxizität Risikobewertung mit gemischten Kulturen von Neuronen und Astrozyten Studie beschränkt. Es ist gut angenommen, dass Gliazellen integraler bei der Bereitstellung von Raum-und Stoffwechsel-Unterstützung Neuronen sind, und spielen eine entscheidende Rolle bei der Modulation der neuronalen mehrere Funktionen, einschließlich neuronalen Migration, Differenzierung und synaptische Aktivität. Gliazellen Astrozyten auch setzen Zytokine und andere lösliche Faktoren, die in der Lage sowohl induzieren unerwünschten Reaktionen in der Umgebung neuronales Gewebe, sowie die Förderung der neuronalen Toleranz vieler Giftstoffe. Demonstration der Tiefe des neuronal-glialen Interaktionen, in Co-Kultur-Studien haben gezeigt, dass Astrozyten Neuronen gegen die Toxizität von oxidativem Stress zu schützen, während Beeinträchtigung der Astrozyten-Funktionen, wie die Instandhaltung von antioxidativen Abwehr und zellulären Energie, hat sich gezeigt, entscheidend beeinflussen neuronale Überleben. Neuere Studien legen nahe, dass die Verwendung von Astrozyten in einem in vitro Neurotoxizität Testsystem kann sich als relevant für die menschliche Zentralnervensystem Struktur und Funktion neuronaler Zellen als allein. Trotz des wachsenden Bewusstseins über die physiologische Bedeutung der neuronalen-astrozytären Interaktionen, ist es bislang schwierig, quantitative Analysen dieser Interaktionen in intakten Zellen durchzuführen. Das Aufkommen von High Content Screening ermöglicht die Entwicklung von leistungsstarken neuen Assays an diese Adresse. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass quantitative Analysen von mehreren neuronalen und astrozytären Phänotypen in einem einzigen Assay ermöglicht werden, indem HCA. In primären Neuronen haben wir quantitative Messungen der Neurotoxizität Marker wie neuronale Zahl, Neuriten zählen und Neuritenlänge durchgeführt. In Astrozyten, ist reaktive Gliose einen bekannten Biomarker für Neurotoxizität, durch Veränderungen in GFAP-Expression, Astrozyten Anzahl und Astrozyten Morphologie charakterisiert. Wir haben gezeigt, dass jeder von diesen Endpunkten ohne weiteres über HCA beurteilt werden. Diese Studien unterstützen das Konzept, dass HCA von neural-spezifischen Biomarkern als Teil einer Batterie konnte in vitro-Tests verwendet werden, um schnell Bildschirm eine große Anzahl von Chemikalien für die neurotoxischen Endpunkte. Millipore ist HCS222 High Content Analyse-Kit für Co-Kultur von Neuronen und Astrozyten ist aus hochwertigem Nachweisreagenzien und Protokolle für die gleichzeitige Profilierung βIII-Tubulin und sauren Gliafaserproteins (GFAP) in einer Vielzahl von zellulären Modellen der Neurotoxizität zusammen. Die hoch-validierte Reagenzien dieses Kits erlauben dem Benutzer, Tests zu standardisieren, zu minimieren Assay-to-Assay-Variabilität und reproduzierbar zu erzeugen Bilder mit einem hohen Signal-zu-Untergrund-Verhältnis.

<table><tbody><tr><td>Rabbit Anti-&amp;#946;III-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X</td><td></td><td>Part No. CS201672</td><td>1 vial containing 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X</td><td></td><td>Part No. CS201649</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X</td><td></td><td>Part No. CS201671</td><td>1 vial containing 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X</td><td></td><td>Part No. CS200437</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst HCS Nuclear Stain, 200X</td><td></td><td>Part No. CS200438</td><td>1 vial containing 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X</td><td></td><td>Part No. CS200434</td><td>1 bottle containing 100 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Immunofluorescence Buffer, 1X</td><td></td><td>Part No. CS200435</td><td>1 bottle containing 1000 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>HCS Wash Buffer, 1X</td><td></td><td>Part No. 2007643</td><td>1 bottle containing 500 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>Acrylamide (Control Compound), 10X</td><td></td><td>Part No. CS201679</td><td>1 vial containing 500 &amp;#x03BC;L of 1M acrylamide in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X</td><td></td><td>Part No. CS201730</td><td>1 vial containing 500 &amp;#x03BC;L of 100 mM hydrogen peroxide in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>K-252a (Control Compound), 250X</td><td></td><td>Part No. CS201741</td><td>1 vial containing 100 &amp;#x03BC;L of 250 &amp;#x03BC;M K-252a in DMSO&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>DMSO for Compound Serial Dilution</td><td></td><td>Part No. CS200441</td><td>1 bottle containing 10 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Compound Dilution Buffer</td><td></td><td>Part No. CS200442</td><td>1 bottle containing 25 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Component</td></tr><tr><td>Plate Sealers</td><td></td><td>Part No. CS200443</td><td>10 each&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Components</td></tr><tr><td>tissue culture-treated black/clear bottom microplates </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCS imaging/analysis system</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity

High Content Analyse (HCA)-Assays kombinieren Zellen und Nachweisreagenzien mit Automated Imaging und leistungsfähige Bildanalyse-Algorithmen, so dass die Messung von mehreren zellulären Phänotypen in einem einzigen Assay. In dieser Studie verwendeten wir HCA eine neuartige Assays für Neurotoxizität zu entwickeln. Neurotoxicity Bewertung stellt einen wichtigen Teil der Bewertung der Arzneimittelsicherheit, wie auch als ein wichtiger Schwerpunkt der Bemühungen im Umweltschutz. Darüber hinaus ist Neurotoxizität auch ein gut angenommen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Marker für die Entwicklung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson. Vor kurzem hat die Anwendung von HCA zu neuronalen Screening berichtet worden. Durch die Kennzeichnung neuronalen Zellen mit βIII-Tubulin, können HCA Untersuchungen liefern hohen Durchsatz, nicht subjektiv, quantitative Messungen von Parametern wie neuronale Zahl, Neuriten zählen und Neuritenlänge, von denen alle neurotoxische Wirkungen hinweisen können. Allerdings bleibt die Rolle der Astrozyten in diesen Modellen unerforscht. Astrozyten sind eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung des zentralen Nervensystems (ZNS) Homöostase, und sind sowohl mit Neuroprotektion und neurodegradation, wenn sie als Reaktion auf toxische Substanzen oder Erkrankungen aktiviert sind verbunden. GFAP ist ein Zwischenprodukt Filament Protein vorwiegend in den Astrozyten des ZNS exprimiert. Astrozytäre Aktivierung (Gliose) führt zur Hochregulation von GFAP, häufig von Astrozyten Proliferation und Hypertrophie begleitet. Dieser Prozess der reaktiven Gliose ist als ein früher Marker der Schädigung des Nervensystems vorgeschlagen worden. Die traditionelle Methode zur Quantifizierung GFAP wird durch Immunoassay. Dieser Ansatz wird durch die Unfähigkeit, Informationen über die zelluläre Lokalisation, Morphologie und Zellzahl bieten begrenzt. Wir haben festgestellt, dass HCA verwendet werden könnten, um diese Einschränkungen zu überwinden und gleichzeitig zu messen mehrere Funktionen mit Gliose in Verbindung gebracht werden - Veränderungen in GFAP-Expression, Astrozyten Hypertrophie und Astrozyten Verbreitung - in einem einzigen Assay. In Co-Kultur-Studien haben gezeigt, dass Astrozyten Neuronen gegen verschiedene Arten von toxischen Beleidigung zu schützen und entscheidend beeinflussen neuronale Überleben. Neuere Studien legen nahe, dass die Verwendung von Astrozyten in einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Neurotoxizität Testsystem kann sich als relevant für die menschliche ZNS-Struktur und Funktion neuronaler Zellen als allein. Dementsprechend haben wir eine HCA Test für Co-Kultur von Neuronen und Astrozyten entwickelt, bestehend aus Protokollen und validiert, target-spezifischen Nachweisreagenzien zur Profilierung βIII-Tubulin und sauren Gliafaserproteins (GFAP). Dieser Assay ermöglicht die gleichzeitige Analyse von Neurotoxizität, Neuritenwachstum, Gliose, neuronale und astrozytären Morphologie und neuronalen und astrozytären Entwicklung in einer Vielzahl von zellulären Modellen, was einem neuartigen, nicht-subjektive, High-Throughput-Assay für Neurotoxizität Beurteilung. Der Test birgt ein großes Potenzial für eine verbesserte Erkennung von Neurotoxizität und eine verbesserte Produktivität der neurowissenschaftlichen Forschung und Wirkstoffentwicklung.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Dieser Artikel beschreibt ein neuartiges Protokoll und Reagenz-Set für empfindliche Messung der neurotoxischen Wirkungen von Verbindungen und Behandlungen auf Co-Kulturen von Neuronen und Astrozyten mit High Content Analyse entwickelt. Die Ergebnisse zeigen, dass High Content Analyse eine spannende neue Technologie für die Neurotoxizität Beurteilung darstellt.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Serie: A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is very poor 1. The failure of axon regeneration is a combined result of several factors including the hostile glial cell environment, inhibitory myelin related molecules and decreased intrinsic neuron regenerative capacity 2. Astrocytes are the most predominant glial cell type in central nervous system and play important role in axon functions under physiology and pathology conditions 3. Contrast to the homologous oligodendrocytes, astrocytes are a heterogeneous cell population composed by different astrocyte subpopulations with diverse morphologies and gene expression 4. The functional significance of this heterogeneity, such as their influences on axon growth, is largely unknown.
To study the glial cell, especially the function of astrocyte heterogeneity in neuron behavior, we established a new method by co-culturing high purified dorsal root ganglia neurons with glial cells obtained from the rat cortex. By this technique, we were able to directly compare neuron adhesion and axon growth on different astrocytes subpopulations under the same condition.
In this report, we give the detailed protocol of this method for astrocytes isolation and culture, dorsal root ganglia neurons isolation and purification, and the co-culture of DRG neurons with astrocytes. This method could also be extended to other brain regions to study cellular or regional specific interaction between neurons and glial cells.

In this protocol, we described a new method to study the influence of glial cell heterogeneity on axon growth with an in vitro co-culture system. Rat cortical glial cells were cultured to confluence and cocultured with highly purified rat dorsal root ganglia neurons. Different glial cell influence on neurons adhesion and axon growth was compared directly in the same culture. This method provides a new way to directly study the glial cell heterogeneity influence on neuron adhesion and axon growth.

Study Gliazellen Heterogenität Einfluss auf Axon Wachstum Mit einer neuen Methode Cokultur

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

Forschung

Neurowissenschaften

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

Imaging Analyse von Neuron zu Glia Interaktionen in Microfluidic Kultur Platform (MCP)-basierte Neuronale Axon und Glia Co-Kultur-System

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

Ein Multi-Kompartiment-ZNS-Neuron-Glia-Co-Kultur mikrofluidischen Plattform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Biologie

A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides reliable analysis of neuronal morphology together with quantitative measurements of modifications on neurite length and synaptic protein localization and abundance upon treatment with small molecule compounds. In addition to the application of the presented method in neurite outgrowth studies, neurotoxicity assessment can be performed to assess, distinguish and rank commercial chemical compounds based on their potential developmental neurotoxicity effect.
Even though cell lines are nowadays widely used in compound screening assays in neuroscience, they often differ genetically and phenotypically from their tissue origin. Primary cells, on the other hand, maintain important markers and functions observed in vivo. Therefore, due to the translation potential and physiological relevance that these cells could offer neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment can considerably benefit from using human neural progenitor cells (hNPCs) as the primary human cell model.
The presented method herein can be utilized to screen for the ability of compounds to induce neurite outgrowth and neurotoxicity by taking advantage of the human neural progenitor cell-derived neurons, a cell model closely representing human biology.&#34;

The presented protocol describes a method for a neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment of small molecule compounds.

Ein Neurit Engrowth Assay und Neurotoxizität Satonie-Bewertung mit menschlichen neuronalen Vorläufer Cell-Derived Neuronen

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides ...

Entwicklungsbiologie

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Für die detaillierte Untersuchung von Neuron-Glia Interaktionen Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

Ein Zellkulturmodell zum Studium der Rolle von Neuron-Glia-Interaktionen in Ischämie

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to study the process of neuronal survival upon cytotoxic stress. Most methods are based on biochemical approaches that do not allow single-cell resolution or involve complex and costly methodologies. Presented here is a versatile, inexpensive, and effective experimental paradigm to study neuronal survival. This method takes advantage of sparse fluorescent labeling of the neurons followed by live imaging and automated quantification. To this aim, the neurons are electroporated to express fluorescent markers and co-cultured with non-electroporated neurons to easily regulate cell density and increase survival. 
Sparse labeling by electroporation allows a simple and robust automated quantification. In addition, fluorescent labeling can be combined with the co-expression of a gene of interest to study specific molecular pathways. Here, we present a model of stroke as a neurotoxic model, namely, the oxygen-glucose deprivation (OGD) assay, which was performed in an affordable and robust homemade hypoxic chamber. Finally, two different workflows are described using IN Cell Analyzer 2200 or the open-source ImageJ for image analysis for semi-automatic data processing. This workflow can be easily adapted to different experimental models of toxicity and scaled up for high-throughput screening. In conclusion, the described protocol provides an approachable, affordable, and effective in vitro model of neurotoxicity, which can be suitable for testing the roles of specific genes and pathways in live imaging and for high-throughput drug screening.

Here, we present a simple, potent, and versatile methodology to investigate neuronal survival upon cytotoxic stress in primary cortical neurons with cellular resolution in real time or in fixed material.

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to ...

 Primäres Mikroglia- und Neuronen-Co-Kulturprotokoll für ZNS-Interaktionsstudien

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

Autor im Rampenlicht: In vitro Co-Kultur-Modell zur Untersuchung von Mikroglia-neuronalen Interaktionen bei Krankheitszuständen

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

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Zusammenfassung

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Study Gliazellen Heterogenität Einfluss auf Axon Wachstum Mit einer neuen Methode Cokultur

Imaging Analyse von Neuron zu Glia Interaktionen in Microfluidic Kultur Platform (MCP)-basierte Neuronale Axon und Glia Co-Kultur-System

Ein Multi-Kompartiment-ZNS-Neuron-Glia-Co-Kultur mikrofluidischen Plattform

Ein Neurit Engrowth Assay und Neurotoxizität Satonie-Bewertung mit menschlichen neuronalen Vorläufer Cell-Derived Neuronen

Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein

Ein Zellkulturmodell zum Studium der Rolle von Neuron-Glia-Interaktionen in Ischämie

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

Generierung und Co-Kultivierung von primären Mikroglia und kortikalen Neuronen von Mäusen

Generierung und Co-Kultivierung von primären Mikroglia und kortikalen Neuronen von Mäusen

Generierung und Co-Kultivierung von primären Mikroglia und kortikalen Neuronen von Mäusen