Gen ekspresyonu üzerindeki mutasyonların sonuçları genellikle yerinde hibridizasyon tarafından nitel olarak değerlendirilir ve genellikle görsel olarak puanlandırılır, bu da araştırmacının beklentilerine göre öznel ve önyargılıdır. Bu yöntem, görüntü yoğunluklarını ölçerek yerinde deneyleri karşılaştırmak için daha tutarlı bir yol sağlar ve bu sapmayı kaldırır. Bu aynı zamanda kolayca bir gen ekspresyonu okuyucu olarak yerinde hibridizasyon kullanan diğer model sistemlerine adapte edilebilir.
In situ hibridizasyon-veya ISH-lekeli embriyolar görüntüleme ile başlayın. Bir gliserol çözeltisi hazırlamak ve homojenize etmek için karıştırın. Üç mililitrelik Pasteur pipet ile gliserol çözeltisine embriyolar transfer ve en az beş dakika yerleşmek için bırakın.
Hazırlamak ve görüntüleme den sonra ISH lekeli embriyolar aktarmak için yeterli PCR tüpleri etiket, sonra bir cam depresyon slayt kuyunun altına% 100 gliserol eklemek için üç mililitrelik Pasteur pipet kullanın. Tek bir ISH vitraylı embriyoyu cam kaydırağa aktarın ve dijital fotoğraf makinesi ve alt ve üst aydınlatma ile donatılmış stereo mikroskop altında yönlendirin. İlk embriyoyu kullanarak, aydınlatma ve maruz kalma süresini istenilen büyütmede ayarlayın.
Gerektiği kadar embriyo görüntüleyin ve her görüntüyü benzersiz bir sayıyla etiketleyin. Görüntülemeden sonra, her embriyo aynı sayıda etiketli bir PCR tüpüne transfer ve gerekirse PCR tüplerden aşırı gliserol aspire. DNA ayıklamak için, her tüpe HoTSHOT gibi bir alkali lysis tampon 40 ila 75 mikrolitre ekleyin.
Tüpleri 95 derecede yaklaşık 30 dakika kuluçkaya yatırın ve sonra 4 santigrat dereceye kadar soğutun. Nötralizasyon tamponeşit hacimli ekleyin ve ilgi mutasyonu için genotipleme ile devam edin. Görüntü analizi gerçekleştirmek için, Fiji'deki resmi seçin ve açın ve Edit'i tıklatarak görüntüyü ters çevirin ve ardından Resim sekmesini tıklatarak, Tür'ü seçerek ve 8 bit seçerek görüntü türünü 8-bit'e dönüştürün.
Çokgen aracını seçin ve ölçülecek ISH sinyalini içeren bölge çevresindeki görüntüye ilgi veya YG bölgesini el ile çizin. YG Yöneticisi'ni açmak ve ilgi çekici bölgeyi seçmek için T tuşuna basın ve ardından Ölçü'ye tıklayın. Sonuçlar penceresinden ortalama değeri elektronik tabloya kopyalayın.
Arka plan yoğunluğunu ölçmek için, yG'yi embriyodaki bir bölgeye boyama olmadan taşıyın ve YG Yöneticisi'ni ekle'yi tıklatın. Arka plan bölgesini seçin ve Ölçü'ye tıklayın, ardından ortalama yoğunluk değerini elektronik tabloya kaydedin. LEKEli bölgeden arka planın ortalama yoğunluğunu çıkararak NC2 hibridizasyon sinyalinin ortalama piksel yoğunluğunu elde edin.
Her numunenin ortalama piksel yoğunluğunu belirledikten sonra, her örneğe bir genotip atayın. Genotip belirlenemiyorsa, numuneyi sonraki analizden dışlar. Ortalama örneklem yoğunluğu değerlerini genotiplere göre sıralayın ve istatistiksel testlere devam edin.
Bu tekniğin yararı dnmt3bb için ISH gösterilmiştir. 1 bir runx1 heterozigot incross gelen embriyolarda. dnmt3bb bir azalma.
Runx1 homozigot mutantlarda 1 ekspresyon saptanırken heterozigot embriyolar dnmt3bb'de anlamlı bir farklılık göstermedi. 1 ifade. Lmo4 mutasyonunun runx1 ekspresyonu üzerindeki etkisini belirlemeye çalışırken, bu analiz yabani tip ve homozigot lmo4 mutantları arasında anlamlı ifade farklılıkları göstermedi.
Ancak tek embriyo qPCR ile runx1 ekspresyonunda küçük bir azalma saptanır. Runks1-probed embriyoların yaklaşık% 0.4, ISH sinyal çıkarılır zaman negatif bir sayı ile sonuçlanan yüksek bir arka plan vardı. Bu gibi durumlarda, embriyolar analiz dışı bırakıldı.
Embriyolar üzerinde dört farklı bölgelerde arka plan düzeltmeleri optimize etmek için test edilmiştir. Arka plan alanlarının herhangi birinde Yatırım Getirisi'nin yoğunluğunda nispeten kararlı bir fark olsa da, R3 her zaman Yatırım Getirisi'nden daha yüksek yoğunluk gösterdi ve arka plan düzeltmesi için kullanılmamalıdır. R1 ve R4 arka plan düzeltme için en uygun alanlar olduğunu kanıtladı.
Görüntüleme için en iyi koşulları bulmak ve deney boyunca değişmeden tutmak önemlidir. Ayrıca, her bir örneğe bir genotip atamadan önce piksel yoğunluğunun ölçülmesini öneririz.
