We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.

Bu protokol Alman ve Berlin eyalet yasasının hayvan bakım kurallarına şöyle; Zebra balığı işleme hayvan koruma (LaGeSo, Berlin-Brandenburg) yerel otorite tarafından izlendi. 1. Kalp Ekstraksiyon için Zebra balığı Embriyolar Alınması <ol><li> Transgenik hat 9 twu34 Kalbe spesifik GFP ile embriyolar elde etmek için: bu tür Tg (EGFP myl7) halinde çapraz kalp raportör zebra balığı. </li><li> İstenilen embriyonik aşamada 10,11 yılına kadar 28.5 ° C&#39;de yumurta suda embriyolar koruyun. Toplanan embriyo nüfus gen ifadesi değişikliklerini sınırlamak için hem genetik ve gelişimsel aşamada homojen olduğundan emin olun. </li><li> Elle embriyolar Dechorionate. </li></ol> 2. Kesme Zebra balığı Embriyonik Kalpler NOT: buz üzerinde tüm çözümleri tutun. Mümkünse, takım çalışması yapın: Bir kişi emb gelen kalpleri masayaryos başka bir kişi floresan stereomikroskop altında kalpleri sıralar ise. Bu, birkaç saat içinde embriyo yüzlerce işlenmesine olanak tanır. <ol><li> 1.5 ml santrifüj tüpüne yaklaşık 100 embriyolar transfer. Tricaine embriyo (E3 ortamı içinde 0.16 mg / ml) anestezisi. Embriyolar açıkça anestezi kez devam edin (onlar yüzmek ve tüpün dibine tortu, ama yürekleri hala yenerek değil). </li><li> Tricaine / E3 çözeltisini çıkarın ve 1 ml L-15/10% FBS ortamı ile bir kez embriyolar yıkama ve buz üzerinde muhafaza. NOT: L-15 /% 10 FBS orta kalpleri RNAlater veya Trizol içine devredilmiştir kadar tüm diseksiyon işlemi sırasında canlı organ ve hücreleri tutmak önemlidir. </li><li> Sarısı tamamen bozulur kadar Yuvarlak Jel Yükleme İpucu yukarı ve aşağı embriyolar ve pipet 5-8 kez 1 ml L-15 /% 10 FBS orta ekleyin. Embriyolar damla damla çözeltinin yüzeyine açılan patlama böylece pipet veEmbriyolar hafifçe bozulur. NOT: yukarı pipetle ve aşağı, yani daha pipet geç evrelerde (örneğin 56 hpf) ihtiyaç olduğu, embriyoların gelişim aşamasında bağlıdır edilecek Nasıl şiddetle ve ne sıklıkta embriyolar var. </li><li> Çok hafifçe pipetle, bazı kalpleri embriyoların takılı kalabilir çünkü disseke embriyoların ilk parti için, embriyoların bütünlüğünü ve bir stereo mikroskop altında disseke kalpleri oranını değerlendirmek. Buna göre diseksiyon sonraki tur için pipetleme şeklini ayarlayın. NOT: plastik yapışmasını kalpleri en aza indirmek için düşük tutma pipet uçları ve mikrosantrifüj tüpleri kullanın. </li><li> 50 ml&#39;lik santrifüj tüpüne yerleştirilen 100 mikron filtre üzerine numuneyi uygulayın; 1 ml L-15/10% FBS ortamı ile 1.5 mi tüp durulama ve sonra, (bir kupa tüpün duvarlarına yapışmasını olabilir) örnek kaybını en aza indirmek amacıyla, filtreye, bu geçerlidir. 1 ml L, iki kez filtre yıkayın-15/10% FBS. Bu adımda, kalpler filtre içinden geçer ve 50 ml&#39;lik bir tüp içinde toplanmıştır. </li><li> 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne yerleştirilir, 30 mikron filtre üzerine akış yoluyla uygulanır ve 1 ml L-15/10% FBS ortamı ile bir kez durulayın. Bu ikinci filtrasyon adımında, kalpler filtre muhafaza edilir ve küçük çöp yıkanır. </li><li> Baş aşağı çevirin ve filtreyi 1 ml L-15/10% FBS ile arka arkaya üç yıkar uygulayarak% 1 agaroz kaplı petri içine filtre dışarı kalpleri yıkayın. </li><li> Elle floresan stereomikroskop altında forseps bir çift ile nonfluorescent embriyonik enkaz (örn göz mercekleri) GFP-pozitif kalpleri ayırmak ve yemeğin ortasında onları konsantre. Adım 3&#39;e göre onları toplayın. NOT: embriyolar daha eski 24 hpf iseniz, kalpler, dayak dokular hala fizyolojik normal olduğunu belirten olmalıdır. </li></ol> 3. Dissec mRNA izoleted Kalpler <ol><li> (Buz üzerinde) ve 0.75 ml RNAlater ihtiva eden 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine mümkün olan en küçük hacimde kalpleri (örneğin, 10 | il) ve pipet toplayın. Hiçbir kalpler bir floresan stereomikroskop altında görüntüleyerek pipet kalır emin olun. </li><li> Alternatif olarak, bir kimyasal başlık floresan mikroskop hemen yakınında varsa, kimyasal başlık altında Trizol (DİKKAT) toplanır kalpleri aktarmak. Bu pipet ve aynı zamanda kalplerin santrifüj sırasında yapışmasını kalplerin olası kaybını circumvents (3.4, 3.5 ve 3.7 adımları). Trizol ile aynı tüpe izolasyon birkaç tur kalpleri havuzu ve 3.8 adıma doğrudan gitmek; Nihai hacim orijinal Trizol hacminin% 10 geçmemelidir. NOT: Kullanmadan önce Trizol Malzeme Güvenlik Bilgi Formu (MSDS) okuyun. Bir başlık altında Trizol reaktif Kulp ve Kişisel Koruyucu Ekipman tavsiye aşınma. Cilt, göz ve clothi ile temastan kaçınınng. Tüm tutuşma kaynaklarını uzaklaştırın. </li><li> RNA izolasyonu etkinliği toplanan doku miktarı ile iyileştikçe, (buz üzerinde) RNAlater aynı tüp içine tecrit birkaç tur kalpleri havuzda toplayın. Toplam örnek hacmi, orijinal RNAlater hacminin% 10&#39;unu aşması halinde, (buz üzerinde) depolama için 0.75 ml RNAlater ile ek bir tüp kullanın. </li><li> Kalpleri çökeltmek için 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 15.700 x g&#39;de örnekleri santrifüjleyin. </li><li> Flöresanlı bir stereomikroskop altında, 3 ml L-15/10% FBS ortamı içeren bir% 1 agaroz kaplı petri içine mümkün olduğu kadar çok dikkatli bir şekilde süpernatan toplamak ama santrifüj tüpünün tabanına tabakalandığı kalpleri rahatsız yoktur. Kalpleri% 15 e kadar bağlı RNAlater yüksek bir viskoziteye sahip süpernatan içinde kalabildiği için aşama 3.7&#39;de tarif edildiği gibi, bunları almak. </li><li> Bir kimyasal Kaputun altında, sedimante kalpleri içeren tüp 0.5 ml Trizol ekleyin ve buz üzerinde tutmak. </li><li> Floresan microsco altındaPE, sulandırmak için 3 ml L-15/10% FBS ile bir% 1 agaroz-kaplanmış çanak içine RNAlater / l-15/10% FBS çözeltisi ihtiva eden,% 1 agaroz-kaplanmış çanak (adım 3.5 den) kalpleri aktarmak RNAlater dışarı. Petri kasesinin ortasına kalpleri toplamak ve kimyasal bir başlık altında Trizol tabakalandığı kalplerin tüp içine, küçük bir hacim içinde aktarın. </li><li> Girdap Trizol kalpleri ihtiva eden 1.5 ml&#39;lik bir tüp kalpleri bozabilir ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübasyona. </li><li> Bir kimyasal Kaputun altında, 100 ul kloroform (DİKKAT) ekleyin, iyice karıştırın ve (kullanmadan önce maksimum hızda santrifüj 30 sn) 1.5 ml önceden bükülmüş PLG tüp Trizol / kloroform çözüm aktarın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca inkübe edin. NOT: Kullanmadan önce kloroform MSDS okuyunuz. Bir başlık altında kloroform reaktif Kulp ve Kişisel Koruyucu Ekipman tavsiye aşınma. Deri, göz ve giysilere dokunmayınız. Alkaliler, metal gibi uzak Uygunsuz maddelerden tutunuz. </li><li> Santrifüjge 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 15.700 x g&#39;de numune ve yeni bir 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine, sulu faz aktarılır. </li><li> 5-10 mikrogram glikojen ve izopropanol (-20 ° C&#39;de) soğutulmuş 250 ul ekleyin; iyice karıştırılır ve -20 ° C &#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 15,700 x g&#39;de santrifüjleyin ve süpernatant atılır. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 15.700 x g&#39;de 1 mi% 75 etanol, santrifüj ile pelet yıkayın ve süpernatant atılır. </li><li> Bu (10-15 dakika, örneğin), beyaz hale gelinceye kadar oda sıcaklığında pelet kurutulmasıyla etanol buharlaşmasını olsun. </li><li> Pelet 20 ul RNase içermeyen GKD 2 O ekleyin ve RNA çözmek üzere 55 ° C de 10-15 dakika inkübe edilir; Daha sonra buz üzerinde tutmak. </li><li> Absorbans ölçümü RNA konsantrasyonu ve saflığı değerlendirin. Bir% 1 agaroz jeli üzerinde örneği çalışmadan RNA bütünlüğü değerlendirin. </li></ol>

<ol>
	<li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+formation+and+function+of+the+cardiovascular+system+in+the+zebrafish+embryo.">Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo.</a> Development. 123, 285-292 (1996).</li><li>Chen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+cardiovascular+system+and+other+internal+organs+in+zebrafish.">Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish.</a> Development. 123, 293-302 (1996).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends Genet. 10, 73-74 (1994).</li><li>Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+real+time+quantitative+RT-PCR.">A novel method for real time quantitative RT-PCR.</a> Genome Res. 6, 995-1001 (1996).</li><li>Epstein, C. B., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+technology+-+enhanced+versatility,+persistent+challenge.">Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge.</a> Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).</li><li>Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+Technology+and+Its+Application+in+Fish+Transcriptomics.">RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics.</a> OMICS. 18, 98-110 (2014).</li><li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos.">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 40, 274-278 (2006).</li><li>Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish.">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Veerkamp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+dampening+of+Bmp+activity+by+nodal+generates+cardiac+left-right+asymmetry).">Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry).</a> Dev Cell. 24, 660-667 (2013).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Brownlie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+embryonic+globin+genes+of+the+zebrafish.">Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish.</a> Dev Biol. 255, 48-61 (2003).</li><li>Marvin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+patterns+of+the+zebrafish+small+heat+shock+proteins.">Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins.</a> Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).</li><li>Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+brain.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain.</a> Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol gen ifadesi için Zebra balığı Embriyonik kalp dokusunun hızlı zenginleşme analizleri verir. RNA arıtma sadece yeterli çalışır çünkü, kalplerin kaybı protokolü her aşamasında önlenir, ilk numune miktarı büyük ölçüde artırıldı: kardiyak spesifik RNA örnek miktarı ve kalitesi büyük ölçüde bir kaç önemli adımlar bağlıdır başlangıç ​​malzemesi. İkinci olarak, deneyi ile tamamen bağlıdır numune saflığı, sıralama ve sıkı bir şekilde diğer dokuları hariç...

Balığı (Danio rerio), yaygın küçük olması nedeniyle ve floresan proteinleri dokuya-özel ifadesi transjenik raportör hatları durumu ile birleştirilmiş olan, hızlı, şeffaf ve rahim dışı embriyonik gelişme, in vivo olarak organogenez çalışma gelişim biyolojisi kullanılır. Bu küçük omurgalı, özellikle de erken Zebra balığı embriyonun oksijenlenme, kalp atışı ve kan akımı dayanmaz çünkü kalp gelişimini incelemek için uygundur; Bu özellikler kardiyovasküler mutantların 1,2 sayıda karakterizasyonu izin ve zebra balığı artık kalp hastalıkları 3 incelemek için yaygın olarak tanınan bir model organizmadır. Embriyo gelişimi esnasında gen ekspresyonunu incelemek için, transkriptler genellikle tüm montaj in situ melezleşme (VVISH) 4 ile analiz edilmiştir, RT-qPCR 5, mikrodiziler 6, ya da bir sonraki nesil sıralama (RNA Dizi) 7. SüreWISH analiz tüm embriyo olan gen ifadesinin uzamsal ve zamansal analizi, transkript seviyeleri, genellikle, RT-qPCR mikrodizilerdeki ya da RNA-Seq yaklaşımlarla değerlendirilir sağlar. Bununla birlikte, bu yöntemler, belirli bir gen ekspresyonu profillemesi doku zenginleştirme gerektirir. Zebra balığı Embriyonik kalp tüm embriyo küçük bir kısmını temsil ettiğinden dolayı, kalp gelişimi sırasında transcriptome çalışmaları diseksiyon ve kalpleri zenginleştirilmesi için bir protokol gerektirir. Buna ek olarak, fizyolojik olarak ilgili veri elde etmek için, bu RNA ekstraksiyonu kadar tam olarak işlevsel kalp dokusunu muhafaza etmek önemlidir. Burada, biz hızla fizyolojik, normal izole ve verimli bir şekilde ileri analizler için yüksek kaliteli RNA örnekleri elde etmek için Zebra balığı embriyolarının yüzlerce kalpleri yenerek bir protokol açıklar. Bu yöntem Burns ve MACRAE 2006 8 tarafından bildirilen protokol dayanmaktadır. Kalp dokusunun zenginleşmesi için, her iki yöntem bir transgenik miyokard muhabiri hattını kullanmakve diğer dokulara karşı Zebra balığı embriyonik kalpleri diferansiyel yapışma özelliklerine yararlanmak. Kısaca, dar bir pipet ucu ile yukarı ve aşağı doğru çok sayıda embriyolar pipetleme, kalpler aynı embriyonik gövdelerinden serbest bırakılır ve daha sonra, iki hızlı bir filtreleme adımlarından embriyonik enkaz ayrılır; floresan etiketli kalpler sonra el kalan enkaz sıralanır ve daha fazla işlem için toplanır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment for raising fish and collecting eggs&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see the Zebrafish Book11 for details</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid electrophoresis chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dishes 4cm &#216;, coated with 1% agarose in E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,5ml centrifugation tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15ml and 50ml centrifugation tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pair of Dumont #5 forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ExactaCruz&#8482; Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200&#956;l&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-201732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 &#956;m filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30 &#956;m filter (Pre-Separation Filters-30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes&#160;</td>
			<td>Prime</td>
			<td>2302810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Egg water medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60&#956;g/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E3 medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricaine (3-amino benzoic acidethylester)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1% agarose (in E3 medium)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1% agarose gel (in TBE buffer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#180;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNAlater</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizol</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>1559606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycogen&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td>20 &#181;g/&#181;L in RNase-free water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >75% ethanol (in DEPC-ddH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid loading buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale zebrafish embryonic heart dissection for transcriptional analysis

Zebra balığı Embriyonik kalp tüm embriyonun sadece küçük bir kısmını temsil eden, sadece birkaç yüz hücrelerden oluşur. Bu nedenle, genel embriyonik transcriptome tarafından maskelenen kardiyak transcriptome önlemek için, ayrıca analiz için kalpleri yeterli sayıda toplamak için gereklidir. Zebra balığı kalp geliştirme hızla devam Dahası, kalp toplanması ve RNA ekstraksiyonu yöntemleri numunelerin homojen olmasını sağlamak için hızlı olması gerekir. Burada, biz Zebra balığı embriyolarının fonksiyonel / yenerek kalpleri toplamak için hızlı manuel diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu transcriptome analizleri ile bu kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) halinde, kalp-özgü gen ekspresyon seviyelerini belirlemek için daha sonra, kalp-özel RNA ekstraksiyonu için bir temel oluşturur. yöntem, diğer dokulara göre zebra balığı embriyonik kalp diferansiyel yapışma özellikleri dayanmaktadır; Bu hızlı laşılmakla sağlarakışkan kesme kuvveti bozulması, aşamalı filtrasyon ve transgenik floresan etiketli kalplerin manuel toplama bir kombinasyonu ile dışı dokusundan kalp ceği ayrılması.

Sadece miyokardın (. Şekil 1) içinde twu34 transgenik hattı 9, yeşil floresan proteininin (GFP) ifade eder: Burada, biz zebrabalıkları Tg (GFP myl7) kullanarak bir temsilci kalp diseksiyon deneyi tarif. Biz disseke kalpleri ve kalp numunenin saflığını değerlendirmek için elde edilmiştir hangi embriyolar hem topladı. Kısaca, homozigot Tg (myl7 GFP) twu34 zebra balığı 9, embriyonik kalpleri GFP etiketli ki, vahşi tip ile ç...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis at JoVE.com

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Zebra balığı kalp gelişimi sırasında kalp gen ekspresyon profillerini analiz etmek, toplam RNA izole kalpleri elde edilecek olan. Burada, biz kalp-özel mRNA elde etmek Zebra balığı embriyolarının gelen hızlı manuel diseksiyon ile işlevsel / yenerek kalpleri toplamak için bir protokol mevcut.

Transkripsiyonal Analiz Büyük ölçekli Zebra balığı Embriyonik Kalp Diseksiyon

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

large-scale-zebrafish-embryonic-heart-dissection-for-transcriptional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.2K Görüntüleme.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine.  Zebra balığı kalp gelişimi sırasında kalp gen ekspresyon profillerini analiz etmek, toplam RNA izole kalpleri elde edilecek olan. Burada, biz kalp-özel mRNA elde etmek Zebra balığı embriyolarının gelen hızlı manuel diseksiyon ile işlevsel / yenerek kalpleri toplamak için bir protokol mevcut. 

Video: Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Gelişim Biyolojisi

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously applied large scale EM to human skin pancreatic islets, tissue culture and whole zebrafish larvae1-7. Here we describe a universally applicable method for tissue-scale scanning EM for unbiased detection of sub-cellular and molecular features. Nanotomy was applied to investigate the healthy and a neurodegenerative zebrafish brain. Our method is based on standardized EM sample preparation protocols: Fixation with glutaraldehyde and osmium, followed by epoxy-resin embedding, ultrathin sectioning and mounting of ultrathin-sections on one-hole grids, followed by post staining with uranyl and lead. Large-scale 2D EM mosaic images are acquired using a scanning EM connected to an external large area scan generator using scanning transmission EM (STEM). Large scale EM images are typically ~ 5 - 50 G pixels in size, and best viewed using zoomable HTML files, which can be opened in any web browser, similar to online geographical HTML maps. This method can be applied to (human) tissue, cross sections of whole animals as well as tissue culture1-5. Here, zebrafish brains were analyzed in a non-invasive neuronal ablation model. We visualize within a single dataset tissue, cellular and subcellular changes which can be quantified in various cell types including neurons and microglia, the brain&#39;s macrophages. In addition, nanotomy facilitates the correlation of EM with light microscopy (CLEM)8 on the same tissue, as large surface areas previously imaged using fluorescent microscopy, can subsequently be subjected to large area EM, resulting in the nano-anatomy (nanotomy) of tissues. In all, nanotomy allows unbiased detection of features at EM level in a tissue-wide quantifiable manner.

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.

Sağlıklı ve Yaralı Zebra balığı Beyin büyük ölçekli Tarama Transmisyon Elektron Mikroskobu (Nanotomy)

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Temizlendi Embriyonik Kalpler Koroner Damarlar Analizi

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

Larva Zebra balığı Gonadal Doku Diseksiyon

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Fare Embriyonik Böbreklerinin Diseksiyonu ve Kültürü

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained even in embryos that are larger or smaller, within certain limits. Although this phenomenon of scaling has attracted attention for over a century, understanding the underlying mechanisms has been limited, owing in part to a lack of quantitative description of developmental dynamics in embryos of varied sizes. To overcome this limitation, we developed a new technique to surgically reduce the size of zebrafish embryos, which have great advantages for in vivo live imaging. We demonstrate that after balanced removal of cells and yolk at the blastula stage in separate steps, embryos can quickly recover under the right conditions and develop into smaller but otherwise normal embryos. Since this technique does not require special equipment, it is easily adaptable, and can be used to study a wide range of scaling problems, including robustness of morphogen mediated patterning.&#160;

Here, we describe a method for reducing the size of zebrafish embryos without disrupting normal developmental processes. This technique enables the study of pattern scaling and developmental robustness against size change.

Embriyonik desen ölçekleme çalışma için zebrafish cerrahi boyutu azaltma

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation (DIAMOND) Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are increasingly utilized as a model organism for cardiomyopathies and regeneration. Current methods evaluating cardiac function fail to reliably detect segmental mechanics and are not readily feasible in zebrafish. Here we present a semiautomated, open-source method for the quantitative assessment of four-dimensional (4D) segmental cardiac function: displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND). Transgenic embryonic zebrafish were imaged in vivo using a light-sheet fluorescence microscopy system with 4D cardiac motion synchronization. Acquired 3D digital hearts were reconstructed at end-systole and end-diastole, and the ventricle was manually segmented into binary datasets. Then, the heart was reoriented and isotropically resampled along the true short axis, and the ventricle was evenly divided into eight portions (I&#8211;VIII) along the short axis. Due to the different resampling planes and matrices at end-systole and end-diastole, a transformation matrix was applied for image registration to restore the original spatial relationship between the resampled systolic and diastolic image matrices. After image registration, the displacement vector of each segment from end-systole to end-diastole was calculated based on the displacement of mass centroids in three dimensions (3D). DIAMOND shows that basal myocardial segments adjacent to the atrioventricular canal undergo the highest mechanical deformation and are the most susceptible to doxorubicin-induced cardiac injury. Overall, DIAMOND provides novel insights into segmental cardiac mechanics in zebrafish embryos beyond traditional ejection fraction (EF) under both physiological and pathological conditions.

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation DIAMOND Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

The goal of this protocol is to detail a novel method for the assessment of segmental cardiac function in embryonic zebrafish under both physiological and pathological conditions.

Miyokardiyal Mekanik Deformasyonun Yer Değiştirme Analizi (DIAMOND) Embriyonik Zebrabalığında Kardiyak Fonksiyonun Segmental Heterojenliğini Ortaya Çıkarır