ESB NIH Yönetmen Kullanıcı Yeni Yenilikçisi Ödülü (OD002002-01 DP2), NIH Mücadelesi Grant 1RC1MH088182-01, NIH Büyük Fırsatlar Hibe 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, NSF (0.835.878 ve 0.848.804), McGovern Enstitüsü Nöroteknoloji Ödülü Programı tarafından fon kabul eder Savunma, NARSAD, Alfred P. Sloan Vakfı, Jerry ve Marge Burnett, Nörobilim, MIT Media Lab, Benesse Vakfı ve Wallace H. Coulter Vakfı Yenilik SFN Araştırma Ödülü Bölümü.

1. Stereotaksik Kelepçe inşa <ol><li> Stereotaksik kelepçe enjektörler stereotaksik koluna paralel olacak şekilde, stereotax enjektör dizisi takmak için kullanılır. </li><li> Her bir laboratuar, aynı anda birden fazla cerrahi yer alabileceğini tahmin sürece, sadece tek bir kelepçe gerekiyor. Bu durumda, eşzamanlı ameliyatlar beklenen maksimum sayısı olarak aynı sayıda olun. Aynı zamanda ilk hasar halinde, fazladan bir tavsiye olabilir. </li><li> Stereotaksik kelepçe yapmak için, öncelikle, 1.5 mm dış çapı (OD) çelik kanül 2 inç uzunluğunda kesilir ve uçları düz kadar aşağı Dremeled. </li><li> Sonra, bir boşluk olarak kullanılmak üzere küçük bir parça (yaklaşık 0,5 x 0,5 cm), PCB proto-board dışarı kesilir. </li><li> Yapılan hiçbir kesinti malzeme yüzeyine dik olduğundan emin olun bir lazer kesici kullanarak, iki özdeş dikdörtgenler (1 / 2 &quot;x 3 / 8&quot;) 1 / 8 &quot;akrilik kaplama, iki dairesel delik olan her dikdörtgen kesilir 1.5mm çap dikdörtgen ters köşe. ilk delik, sadece sıkı metal kanül içine alabilecek kadar büyük. çapı 1 / 16 &quot;(Şekil 1C) ikinci bir delik vardır. </li><li> Metal kanül ikinci 1.5 mm delikten sonra, bir dikdörtgenin 1.5 mm delik eklenir. Kanül alt ucuna bir hokey sopası şekli oluşturan, altındaki dikdörtgen alt yüzü ile uyumlu. </li><li> Bu yapı, iki dikdörtgen arasındaki sıkı düzenlenen ayırıcı tutarken, kanül ve 1.5mm delikleri etrafında sıcak tutkal kullanarak birlikte yapıştırma dikdörtgenler için ayırıcı önlemek için dikkatli olmak yapıştırılır. Kil modelleme, bu işlem sırasında birlikte bir şeyler tutmak için yararlı olabilir. </li><li> Tutkal kuruduktan sonra, 1-72 vida dikdörtgenlerin üst kısmında 1 / 16 deliğe sokulur. Sonra 1-72 altıgen somunu 1-72 vida ucuna vidalanır ve sıkılır. Vida ve somun birlikte kelepçe tutmak için hizmet vermektedir. </li><li> Epoksi altıgen somunu veya vida konuları içine almak için izin vermeden, alt dikdörtgen, 5 dakikalık epoksi küçük miktarda alt yüzüne altıgen somunu eklemek için, altıgen somunu kenarında bırakılır. Herhangi bir modelleme kil kaldırılır ve ayırıcı vida sıkma tarafından sıkıca yerinde tutulabilir doğruladı. </li></ol> 2. Hamilton pompa ve stereotax özelleştirilmiş enjektör dizi için sistem hazırlanması <ol><li> Enjektör dizi beyin koordinatları hemen her şekilde özelleştirilebilir. </li><li> Kullanıcı ilk bulur stereotax tarafından kullanılan uygun koordinatlara dönüştürme, bir fare (veya başka tür) beyin atlası istenen enjeksiyon yerleri koordinatları (burada, X, Y ve Z koordinatları). Enjeksiyon sitelerin sayısı (Şekil 1A ve 1B üç) bundan sonra k olarak adlandırılan olacak. </li><li> k 10 ul Hamilton şırınga sayısı gibi Harvard aparat bu gibi bir enjeksiyon / çekme şırınga pompa yerleştirilir. </li><li> Her Hamilton şırınga, iğne, polietilen boru Sonraki, 3 metrelik parçalar güvenli bir şekilde bağlıdırlar. </li><li> Upchurch Bilimsel bir F-252 boru kol polietilen boru, her parça için açık ucu üzerine kaydırdı ve yer somunu kullanarak bir P-627 tüp adaptörü bağlı ve aynı zamanda Upchurch Bilimsel, halkalı. </li></ol> 3. Özelleştirilmiş Enjektör Array oluşturulması <ol><li> Her enjektör dizi, kullanıcının seçtiği koordinat ayarlamak için özelleştirilmiştir. Ancak, sadece bir çeviri ve / veya rotasyon farklı koordinat kümeleri için, aynı enjektör dizi kullanılmalıdır. </li><li> Göz önüne alındığında sadece göreceli enjeksiyon sitelerin X ve Y koordinatları, k delik &quot;aynı bağıl aralık, kalınlığı 1 / 32 bir PCB proto-board içine Bu delikler, bir Modela mini değirmen ve bir .011 kullanarak delinir&quot; delinir McMaster-Carr matkap ucu çapı. Kırılma veya matkap tükenmesini önlemek için yavaş bir sondaj oranı (Z-hız) kullandığınızdan emin olun. Değirmen kurulu çıkarmadan önce, bir dikdörtgen küçük bir tükenmesini önlemek için, çapı 1 / 32 &quot;daha büyük bir matkap ucu kullanılarak, küçük delikler etrafında delinmiş mini değirmen Kod kolayca MATLAB kullanarak oluşturulabilir; örnek kodu aşağıdaki dosyaları sağlanmaktadır. <ol class="lroman"><li> generate.m - MATLAB kodu istenilen koordinatları Modela kodu üretmek için </li><li> holes_ex.rml - Proto-board delik zil sesi tonu (sekiz delikli) Modela kodu </li><li> outline_ex.rml - sondaj dikdörtgen için delikleri etrafında Modela kodu </li></ol></li><li> 245 mikron OD/100 mm iç çapı (ID) erimiş silika kapiler boru Polymicro Teknolojileri edinilebilir, 3 inç adet k sayısı bölünür. Bunlar ayrı ayrı enjektörler oluşmaktadır. Kılcal boru tek parça ile dürttü.deliklerin her biri, gerçek enjektörler tıkamadan enkaz kaldırmak için. Enjektörler, daha sonra her deliğe yarım takılı, birbirlerine sıkı ve paralel tutulur. Enjektörler, enjektör dizinin yapısı oluşturarak, yönetim kurulu epoxied. Geriye kalan tek şey, doğru uzunlukta enjektörler trim. </li><li> Enjektör dizi stereotaksik kelepçe vida sıkma sonra akrilik dikdörtgenler arasında proto-board bir köşesinde koyarak stereotaksik kelepçe takılmış ve. Sonra, kelepçe, metal kanül stereotax eki mekanizmasını kullanarak, stereotax eklenir. </li><li> Aşağıdaki mikroskop altında yapılır. Dış enjektörler (yani, diğer herhangi bir enjektör içine darbeleme olmadan, düz bir kenarı ile yan yaklaştı olabilir) biri için, proto-kurulu alt ötesine uzanan ucu makas ile kesilir. Kortikal enjeksiyon için enjektör proto-board yüzey ötesinde yaklaşık 5mm uzanan olması uygundur. Derin enjeksiyonları için derinlemesine karşılık gelen bir artış, bu sayı artabilir. Ucu Dremel aleti ile düzleştirilir. Enjektör ipuçları derinlemesine hassas, daha az önemli olmadığını da tıkanma karşı ekstra bir önlem olarak bir açıyla zemin olabilir. </li><li> Sonra, stereotaksik kol aralık içinde kararlı bir referans noktası seçilir ve enjektör dizi dış enjektör ucu basık, bu referans noktası o kadar taşınır. </li><li> Ikinci bir enjektör ilgili koordinatları ile birlikte, tercih edilir. Birinci ve ikinci enjektör koordinatları göreli arasındaki yükseklik farkı (z yönünde) değerlendirilmektedir. Enjektör dizi bu izafi mesafe Z ekseni boyunca hareket eder. Ikinci enjektör ikinci enjektör ucu referans noktası yüksekliği şu anda düz ve böylece kesilmiş ve doğru uzunlukta için Dremeled. Enjektör dizi referans noktası ile, enjektörün ucu karşılaştırma kolaylaştırmak için X ve Y yönlerinde hareket ettirilebilir. </li><li> Kırpma Bu süreç kalan enjektörler için tekrarlanır. </li></ol> 4. Tüm sistem montajı <ol><li> Stereotaksik kelepçe ve özelleştirilmiş enjektör dizisi, her ikisi de zaten inşa, bu bölüm için gereklidir. </li><li> Her bir enjektör arka uç (kesilmiş olmamıştır sonuna), P-235 somun ve P-200 halkalı Upchurch Bilimsel kullanarak, bir F-240 boru kol mavi ve eklenir zaten bağlı dişli adaptöre bağlı polietilen boru Hamilton pompa. Ayrıntılı bilgi için üreticinin talimatlarına konsülte edilebilir. </li><li> 27-gauge bir iğne kullanılması, silikon yağı, tüm sistem Hamilton şırınga, enjektör ucu doludur ki Hamilton şırınga arkasına hiç hava kabarcığı enjekte edilir. </li><li> Yerleştirilir Hamilton şırınga Hamilton pompası yeniden silikon yağı, mümkün olan en büyük hacimli şırınga korunur. </li><li> Deney pompası (bu durumda iki) için tasarlanmış daha fazla şırınga gerektiriyorsa, şırıngalar, onları birbirlerine paralel tutmak ve tüm parçaları olduğundan emin olmak için küçük plastik parçaları (örneğin, iğne kapakları) aralıklı olabilir aynı ölçüde pompa ile itti. Ya da, çok raf yükseltme kiti, tek seferde 10 şırınga adete kadar Harvard Apparatus satın olabilir. </li></ol> 5. Enjeksiyonlar / cerrahi <ol><li> Paralel bir enjektör ile enjekte süreci tek bir pipet yardımıyla enjekte çok benzer. </li><li> Hızlı pompalama büyük ve küçük tüp arasındaki ortak bir stres yaratır, çünkü, yavaş dolum / oranları bu süreç boyunca demlenmeye esastır. Önerilen maksimum hızı: 2 ul / virüs yükleme dk, ve 0.1 virüs beslerken ul / dk. </li><li> Bir anestezi fare stereotax yerleştirilir ve deney süresince anestezi kalır. </li><li> Gerektiği gibi fare hazırlayın. Örneğin, bir bistüri ile, tek bir kesim gözler arasındaki kulağı arasında, cildin orta hatta aşağı yapılır. Kafatası açığa çıkarmak için deri geri çekilir ve fasya temizlenmelidir. Bir çekti cam pipet stereotax eklenir. Kulak çubukları pozisyonları bregma ve lambda aynı yükseklikte hizalanır ve böylece onları birleştiren çizginin stereotax Y-eksenine paralel olduğu kadar ayarlanır. Stereotax eksenleri enjeksiyon koordinatları hesaplanır edildiği koordinat sistemine göre odaklı. Stereotaksik bregma cam pipet ucu ile sıfırlanır ve sonra ucu X ve Y-koordinatlarının enjeksiyon sitelerinden biri kafatası biraz üzerinde konumlandırılmış. </li><li> Bir diş matkap kullanarak, son derece ince bir tabaka kemik kalana kadar, ucu aşağıdaki kafatası dikkatlice uzakta karşılaştırıldı. Cam pipet düşük olabilirdelinmiş deliğe doğru pozisyonda merkezli olup olmadığını kontrol etmek için kaldırdı ed ve. 30-gauge iğne kullanarak, küçük bir parça katmanın doğru X ve Y koordinatları, nazikçe kapalı alınır duramater maruz kaldığı. Bu delik enjektörler (0.25mm geniş) sığacak kadar büyük olmalıdır. Diyagramı Şekil 1D bakın. Bu şekilde, küçük, 0.25mm geniş delikler, kafatası yapılan X-ve her enjeksiyon yerinde karşılık gelen Y koordinatları. </li><li> Cam pipet kavuz konteyner atılır ve özelleştirilmiş enjektör dizi stereotaksik kelepçe kullanarak stereotax eklenir. </li><li> Enjektör dizinin doğru açıyı ayarlamak için, aşağıdaki gibi iki dış enjektörler, belirli bir referans noktası kalibre edilmesi tercih edilmektedir. Enjektörlerin bir referans noktası ile eşleşen sonra, göreli X-ve bu enjektör göre enjeksiyon siteler arasında Y-mesafeler ve diğer bir düşünün. Tüm enjektör dizi bu izafi mesafeleri X ve Y yönünde hareket eder, böylece stereotax eksenleri ayarlanır. Ikinci enjektör şimdi referans noktası ile uyumlu değilse, metal kanül gevşetti ve döndürülür. Enjektör dizisi doğru açılı kadar bu işlemi yinelemeli tekrarlanır. </li><li> Şırınga 2 ul noktası (veya daha fazla) kadar virüs enjektörler doldurmadan önce, enjektörler, silikon yağı ile doldurulur. Bu uç tıkanma herhangi bir hava kabarcıkları ya da önceden tanımlamak, şırınga arkasına silikon yağı ile dolum tüm sistemine sahip olmadan, Hamilton pompa kullanarak ileriye iterek yağ kolayca çıkarılabilir, böylece bir tampon bölge sağlar. </li><li> Parafilm steril bir parça kafatası konur, ve enjektörler Parafilm üzerine hafifçe düşürdü. Büyük ölçüde değişen derinliklerde, özel işlenmiş bir parçası (örneğin merdiven şeklindeki bir nesnenin) koordinatları için yükleme kolaylaştırabilir. </li><li> Aşağıdaki parçalar 1 ul virüs (küçük miktarlarda istendiğinde aşağıdaki miktarlarda küçülttüm olmalıdır) her yerinde yüklenecek olduğunu varsayalım. Her site&gt; 1 ul virüs enjekte olduğunu garanti etmek için, virüs 1.5 ul her enjektör ucunda Parafilm veya merdiven üzerine pipetlenir. </li><li> Hamilton pompa dolum oranı 1 ul / dk seti ile virüs 1.2 ul her enjektör içine doldurulur. </li><li> Uzun enjektör ucu bregma sıfırlanır ve sonra enjektör dizi bu enjektör X ve Y koordinatları kaydırılır. Tıkanma, çok derin hedefler bir sorun ise söz konusu olması halinde, diyelim ki, hatta beyin içine enjektör ipuçları yerleştirmeden önce, virüs tüm enjektör ipuçları ortaya çıkan görülebileceği kadar, pompa beslerken başlatmak için bazen tavsiye edilir. Bu enjektör ucunda herhangi bir hava kabarcığı kaldırır ve aynı zamanda herhangi bir tıkanma var olmasını sağlar. Tıkanma durumda, Hamilton pompa hafifçe tıkanma temizlemek için, kısa bir darbe daha yüksek bir hızda 2 ul / dak demlenmeye ayarlanır. </li><li> Sonra enjektör dizi Doğru Z-derinlik, 30-gauge iğne ile yapılan küçük deliklerden indirilir. </li><li> 1 ul virüs 0.1 ul / dk, her bir enjektör ile enjekte edilir. </li><li> Enjeksiyonları 30 dakika boyunca yalnız bırakılır. </li><li> Hamilton pompası enjektör dizisi yavaş yavaş beyin çıkarılan sonra, her enjektör tıkanma kontrol etmek için, 0.1 ul / dak aynı oranda demlenmeye ayarlanır. </li><li> Sonra enjektörler 2 ul / dak etanol 1.5 ul dolum ve beslerken tarafından temizlenir. </li><li> Son olarak, enjektörler, her Hamilton şırınga içinde 2 ul tampon bölge korumak için silikon yağı ile doldurulabilir. </li><li> Tüm ekipman kurumun biyogüvenlik ve hayvan kullanım protokolleri göre, işlem öncesi ve sonrasında sterilize edilmelidir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Paralel enjektör dizi bireysel kez uygulayıcısı beceri bağlıdır rağmen, kurulum ve kurtarma zamanı saymazsak, enjekte edenlerin sayısı ile eşit bir faktör tarafından kabaca bir ameliyat hızlandırır. 1 mikrolitrelik enjeksiyon için, biz genellikle yaklaşık çapı 1 mm (Şekil 1E) bir küre lentivirüs ifade gördüm. Enjeksiyon hassas ucu konumlandırma değişkenliği, deneme yargılanma, yaklaşık 45 mikron (ucunun pozisyonu amaçlanan ucunun mesafe standart sapma) olduğunu gibi oldu. <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. üçlü paralel enjektör dizi fotoğrafı aynı anda üç enjeksiyon için, üçlü bir enjektör yapılandırma gösteren paralel enjektör dizi sistemi, şematik, B, A Tasarım, uygulama ve paralel bir virüs enjektör dizi kullanın. Diyagramlanabilmiştir . <stRong&gt; C, üst anahat gösterilen stereotaksik kelepçe, D, tekniği, hasar en aza indirmek, beynin içine enjektör yerleştirilmesi için kafatasında delik verimli açılması için resimde: diş bir matkap ile, ince aşağı kafatası ~ 50 mikron kalınlık, daha sonra kullanmak channelrhodopsin-2 (ChR2) gösteren küçük bir kraniotomi açmak için keskin bir iğne ucu E, floresan görüntü GFP etiketli B&#39;de gösterildiği gibi üç enjektör dizisi ile hedef üç fare kortikal bölgelerde, hücrelerin

<ol>
	<li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+halorhodopsin+variants+for+improved+genetically-targetable+optical+neural+silencing.">High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. , (2009).</li><li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration.">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li><li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain.">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity,+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li><li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells.">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li><li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels.">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li></ol>

Tüm işlemler Laboratuvar Hayvanları NIH Kılavuzu&#39;na uygun ve MIT Hayvan Bakım ve Kullanım ve Biyogüvenlik Komiteleri tarafından onaylanmıştır.

(Örneğin, 1,4,5,6,7,8 kısa ışık darbeleri yanıt olarak, geçici olarak hassas bir moda, son yıllarda, genetik olarak kodlanmış optik duyarlaştırıcılar bir dizi aktif hale nöronlar etkinleştirilmiş olması ve in vivo susturuldu , 11). Nöronlar memeli beyninde ışık hassaslaşmış olan bir önemli yöntem, fareler ile maymunlar arasında değişen hayvanların beyin opsins kodlayan genlerin sunabilirsiniz lentiviruses ve adeno-ilişkili virüs (AAV) gibi virüsler aracılığıyla güvenli ve kalıcı bir şekilde (örneğin, 2,9,10) . Virüsler, transgenik daha hızlı gerçekleştirme süresi, özellikle bu tür fareler ve maymunlar gibi genetik model organizma değildir organizmalar için izin ve opsins için transgenik senaryolarda mümkün olmayabilir yüksek ekspresyon düzeyleri etkinleştirebilirsiniz. Burada tek bir cerrahi adımda bütün 3 boyutlu beyin yapıları viral bir gen hedef sağlayan hızlı bir zaman çizelgesi oluşturma yeteneğine sahip paralel bir enjektör dizi, &quot;devre düzeyinde transgenik&quot;, göstermektedir. Enjektör dizi, her biri poliimid / erimiş silika besleyen her sürücü, bir şırınga, yüksek basınca dayanıklı konnektörü üzerinden kapiller bir veya daha fazla deplasmanlı pompalar oluşmaktadır. Kılcal damarların boyutlu ve daha sonra stereotaktik bir konumlandırma kurulu özel öğütülmesi ile belirtilen istenilen yerlerde takılı, böylece virüs veya diğer reaktifler beyin bölgelerinde istenilen şekilde ayarlanabilir teslim edilmek üzere izin. Cihazı kullanmak için, cerrah ilk yağı ile akışkan alt sistemi tamamen doldurur virüs kılcal damarların Dolgularda, cihaz beynin içine ekler, ve yavaş yavaş (&lt;0.1 mcL / dk) reaktifler aşılamaktadır. Bu teknoloji gibi yeni tür deneyler, karmaşık şekilli yapılar milisaniye davranış sırasında hassas zaman-zaman ölçeğinde kapatma (hipokampus gibi), yedeklemeli hareket edebilir ikili yapıların zamansal hassas inaktivasyon gibi geniş bir yelpazede (sağlayacaktır sol ve sağ amigdala) ve faz iki bağlı bölgelerde sürüş birden fazla ayrık beyin bölgelerinde (örneğin, pertürbasyon çapraz bölge senkronize her bölgede faaliyet bağlıdır nasıl çalışması, ya da bir alt kümesi susturmak ise bir bölgeye girdi uyarıcı ) çeşitli hedefleri olan bu girdilerin etkileri arabuluculuk için kritik anlamak için hedefler. Primat gibi büyük beyinler için, içinde yaşadığımız son zamanlarda optik hücre tipi özel nöral aktivasyon 3, büyük, karmaşık yapılar viral etiketlenmesi, davranışsal ilgili bir alanda faaliyet rahatsızlık vermesini isteyebilir göstermiştir. - Ilaçlar, nöromodülatör, nörotransmitterler, ya da hücreler, beynin karmaşık 3-D desenler, geçici olarak kesin bir şekilde paralel enjektör dizileri hemen hemen herhangi bir yük enjekte etmekte kullanılan olabileceğini unutmayın. Son olarak, translasyonel bir bakış açısıyla, hızlı, hasta özelleştirilmiş gen tedavisi ya da ilaç dağıtım cihazları hızla olabilir, potansiyel olarak kullanılması yoluyla, çeşitli patolojiler için yeni tedaviler destekleyen, bireysel beyin geometrileri maç için özel olarak tasarlanmış ve imal edilmiş optik kontrol moleküllerdir. Enjektör diziler hem de mekansal ve hacimsel olarak, kesin olmak için tasarlanmıştır. X ve Y yönünde, bu delikli enjektörler, enjektörler birbirine paralel tutulur, böylece sığacak kadar sadece büyük bir ucuz mini-mill kullanarak çok doğru yerleştirilmiş delik delme gerçekleştirilir, ve kesin bir konumu. Z-yönünde stereotaksik cerrahi kendisi ile eşdeğer bir hassasiyet seviyesini sağlayan, enjektörler, stereotaksik cihazları kullanırken kesilmiş bulunmaktadır. Hamilton pompasının yanı sıra, hassasiyet, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) alanına adapte sıfıra yakın ölü hacim konektörler, hacimsel hassasiyet ortaya çıkar. Enjektörler, güçlü ve kesin şeklini ve basınç altında boşluk korur yeterince sert erimiş silika kapiler boru, çelik kanüller gibi alternatifler büyük duvar kalınlığı olmadan yapılır. Paralel enjektör dizi deney çeşitli adapte küçük değişiklikler kolayca yapılabilir. Örneğin, küçük hacimli bir virüs ya da ince aralığı gerekiyorsa, daha küçük kılcal boru ilgili küçük bir matkap ucu ile birlikte, istihdam edilebilir. Gelecek cihazların boyutunu en aza indirmek için (belki serbestçe hareket eden hayvanların başlarına bu tür cihazların monte edilmesini sağlayan), paralel enjektörlerin sayısını artırmak için, mikroakışkan kanalları ve pompaları kullanabilir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dremel Tool</td>
<td>Tool</td>
<td>Dremel</td>
<td>3956-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Cutter</td>
<td>Tool</td>
<td>Universal Laser Systems</td>
<td>VLS2.30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot glue gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Stanley Bostitch</td>
<td>GR20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump)</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton syringes</td>
<td>Tool</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>701N</td>
<td>Need one per injection site</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse stereotax</td>
<td>Tool</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51725D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Modela mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Roland</td>
<td>MDX-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.011" diameter drill bit for mini mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8915A12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/32" diameter drill bit For mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>8848A35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High speed dental drill</td>
<td>Tool</td>
<td>Lynx</td>
<td>333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dental drill accessories</td>
<td>Tool</td>
<td>Pearson</td>
<td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HTX-15R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 binding slotted machine screw</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>MX-0172B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 hex nut</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HNX-0172</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCB proto-board, 1/32" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Digi-Key</td>
<td>PC57-T-ND</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylic Sheet, 1/8" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8560K239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HPLC connectors</td>
<td>Material</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an &#x2018;x&#x2019; to the end of the part number)</td>
<td>Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused</td>
</tr>
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing, OD: 245 &mu;m, ID: 100 &mu;m</td>
<td>Material</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>2000022-10M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
<td>Material</td>
<td>Permatex</td>
<td>84101</td>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyethylene tubing .066 x .095 inch</td>
<td>Material</td>
<td>VWR</td>
<td>63018-827</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

scalable fluidic injector arrays for viral targeting of intact 3-d brain circuits

Nöral devreleri anlayışımız hızla karmaşık 3 genleri hedefleyen bir teknoloji ile büyük ölçüde kolaylaştırılmış olacaktır yaramak his, düşünce, duygu ve eylem, nörolojik ve psikiyatrik bozukluklar nasıl bozuk hesaplamaları nasıl arabuluculuk hızlı oluşturulmasını sağlayarak boyutlu sinir devreleri, &quot;devre düzeyinde transgenik.&quot; Biz son zamanlarda ışığa duyarlı proteinler için kodlama virüsler spesifik hücre tiplerinin milisaniyelik zaman çizelgesi aktivasyon duyarlı ve bozulmamış beyin susturma hangi yöntemler geliştirdik. Biz burada, beynin 3 boyutlu bir yapı içinde tanımlanan noktaları onlarca virüslerin (ya da diğer sıvılar) sunma yeteneğine sahip bir enjektör dizi tasarım ve uygulama mevcut (<strong&gt; Şekil. 1A, 1B</strong&gt;). Enjektör dizi, her biri poliimid / erimiş silika besleyen her sürücü, bir şırınga, yüksek basınca dayanıklı konnektörü üzerinden kapiller bir veya daha fazla deplasmanlı pompalar oluşmaktadır. Kılcal damarların boyutlu ve daha sonra stereotaktik bir konumlandırma kurulu özel öğütülmesi ile belirtilen istenilen yerlerde takılı, böylece virüs veya diğer reaktifler beyin bölgelerinde istenilen şekilde ayarlanabilir teslim edilmek üzere izin. Cihazı kullanmak için, cerrah ilk yağı ile akışkan alt sistemi tamamen doldurur virüs kılcal damarların Dolgularda, cihaz beynin içine ekler, ve yavaş yavaş (&lt;0.1 mikrolitre / dk) reaktifler aşılamaktadır. Enjektör dizi paralel doğa ışık tanımlanmış beyin devrelerinin aktivasyonunu ve susturulması etkinleştirmek için, optik duyarlaştırıcılar gibi viral payload ile tüm sinir devrelerinin, hızlı, doğru, ve sağlam etiketleme kolaylaştırır. Gibi beyin bölgelerinde istenilen setleri ışık teslimat için fiber optik dizileri gibi diğer teknolojiler ile birlikte, nedensel sinir fonksiyonları bozulmamış beyin sistematik problama sağlayan bir araç kutusu oluşturmak için umut. Bu teknoloji sadece memelilerde devre odaklı sinirbilim gibi sistematik yaklaşımlar açmak ve insan olmayan primatların gibi büyük hayvanlarda beyin bölgelerinin etiketleme kolaylaştırmak, ama aynı zamanda hücre özel optik kontrol protez için bir klinik translasyonel yolu açabilir olmayabilir olan hassas dirençli beyin bozuklukları gelişmiş tedavi sağlar. Son olarak, burada açıklandığı gibi bu tür cihazların kolaylaştırabilir tam-zamanlı kolay bir kullanıcı tarafından özelleştirilebilir moda 3 boyutlu yapılar için bu tür kök hücreler ve farmakolojik ajanlar gibi diğer taşıma kapasitesi, akışkan teslimat,.

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits at JoVE.com

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Nöral devreleri kontrol ve analiz<em&gt; In vivo</em&gt; 3 boyutlu kümeler beyin bölgelerinde istenilen virüs ve diğer reaktifler teslim bir teknoloji ile daha da kolaylaşabilir. Biz karmaşık beyin devrelerinin optik manipülasyonu sağlayan akışkan enjektör dizi özelleştirilmiş imalat, ve viral kodlanmış optik duyarlaştırıcılar teslim göstermektedir.

Bozulmamış 3-D Beyin Devrelerin Hedefleme Viral için Ölçeklenebilir akışkan Enjektör Diziler

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

scalable-fluidic-injector-arrays-for-viral-targeting-intact-3-d-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K Görüntüleme.  Massachusetts Institute of Technology. Nöral devreleri kontrol ve analiz In vivo 3 boyutlu kümeler beyin bölgelerinde istenilen virüs ve diğer reaktifler teslim bir teknoloji ile daha da kolaylaşabilir. Biz karmaşık beyin devrelerinin optik manipülasyonu sağlayan akışkan enjektör dizi özelleştirilmiş imalat, ve viral kodlanmış optik duyarlaştırıcılar teslim göstermektedir.

Video: Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

İlaçlar, Viral Vektörler, veya Hücre Transplantasyon teslimi için Microinjections Derin Beyin Yapıları Hedefleme

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Nörobilim

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Beyin-implante Microdevices ve Çevresi Doku Bozulmamış Histolojik Karakterizasyonu

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Sağlam Yetişkin Zebra balığı Beyin Elektrofizyolojik Kayıt

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

Nöronlar 3-D Görüntüleme ve Analiz Enfekte<em&gt; İn Vivo</em&gt; Ile<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Bir Colliculo-talamokortikal Fare Beyin Dilim modifikasyonu, 3-D Odası Bileşenleri baskı ve Multi-ölçekli Optik Görüntüleme birleştirilerek

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not represent the underlying cytoarchitectural and functional complexity of the affected individuals carrying suspected disease variants. Conventional 2-D models remain incomplete representations of in vivo-like structures and do not adequately capture the complexity of the brain. Thus, there is an emerging need for more 3-D hiPSC-based models that can better recapitulate the cellular interactions and functions seen in an in vivo system.
Here we report a protocol to develop a 3-D system from undifferentiated hiPSCs based on the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model mirrors aspects of a developing ventralized neocortex and allows for studies into functions integral to living neural cells and intact tissue such as migration, connectivity, communication, and maturation. Specifically, we demonstrate that the SFEBs using our protocol can be interrogated using physiologically relevant and high-content cell based assays such as calcium imaging, and multi-electrode array (MEA) recordings without cryosectioning. In the case of MEA recordings, we demonstrate that SFEBs increase both spike activity and network-level bursting activity during long-term culturing. This SFEB protocol provides a robust and scalable system for the study of developing network formation in a 3-D model that captures aspects of early cortical development.

Here we report a protocol to develop a three-dimensional (3-D) system from human induced-pluripotent stem cells (hiPSCs) called the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model can be used like an organotypic slice culture to model human cortical development and for the physiological interrogation of developing neural circuits.

Fizyolojik Olarak İlgili Tahliller Kullanılarak 3-D Kök Hücre Kültürlerinin Sorgulanması İçin HiPSC Türevi Serum Serbest Embriyoid Cisim Geliştirilmesi

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Sinir sistemi gelişimi sırasında axonal büyüme ve davranışı analiz etmek için 3-b kollajen bazlı hydrogels üretimi

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and smaller functional subgroups, it becomes paramount to record from projections and/or genetically-defined subpopulations of neurons. Fiber photometry is an accessible and powerful approach that can overcome these challenges. By combining optical and genetic methodologies, neural activity can be measured in deep brain structures by expressing genetically-encoded calcium indicators, which translate neural activity into an optical signal that can be easily measured. The current protocol details the components of a multi-fiber photometry system, how to access deep brain structures to deliver and collect light, a method to account for motion artifacts, and how to process and analyze fluorescent signals. The protocol details experimental considerations when performing single and dual color imaging, from either single or multiple implanted optic fibers.

This protocol details how to implement and perform multi-fiber photometry recordings, how to correct for calcium-independent artifacts, and important considerations for dual-color photometry imaging.

SerbestÇe Hareket Eden Hayvanlarda Nöral AktiviteYi Kaydetmek Için Çoklu Fiber Fotometri

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...