Anthony J. Koleske, Doktora YFP fareler sağlamak için teşekkür ederiz.

Bölüm 1: micropism Optik ve Mikroskop Kurulum <ol><li> Kullandığımız microprisms Optosigma Corporation (Şekil 1) alınan BK7 camdan yapılan 1 mm, dik açılı prizmalar. Microprisms mümkün forseps kullanarak işlenir. </li><li> 2000 nm - micropism hipotenüs 400% 97 daha fazla yansıtma sağlamak için geliştirilmiş gümüş ile kaplanır. Bu lazer uyarma ışık ve yayılan floresan hem de iç yansıma sağlar. </li><li> Microprisms her zaman mümkün olduğunda forseps kullanarak işlenir. Eldiven prizma temiz tutmak için her zaman giyilir. </li><li> Biz küçük hayvan görüntüleme kapasitesine sahip bir özel inşa edilmiş iki foton mikroskop kullanıyoruz. Stereotaktik cihaza bağlı hayvan, 3-eksenli bir motorlu sahnede yer almaktadır. </li><li> Mikroskop ScanImage yazılımı çalıştıran bir Windows PC&#39;ye bağlı. ScanImage Pologruto ve ark 1 Matlab yazılı bir görüntü elde etme yazılımı . </li><li> Micropism görüntüleme için 1024 x 1024 veya 512 x 512 piksel çözünürlükte görüntüler topluyoruz. Buna ek olarak, biz genellikle 2 ms / satır veya 4 ms / satır tarayın. </li><li> İki tür hedeflerin deneylerde kullanılır: <ul><li> Geniş alan görüş görüntüleme için daha düşük bir sayısal açıklık (NA) hava hedefi (Tablo Reaktifler ve Ekipmanları). </li><li> 0 tarafından uyarılan küresel sapmaları en aza indirmek yeteneğine sahip bir cam düzeltme yakalı bir yüksek NA hava hedefi - 2 mm cam (bkz. Reaktifler ve Ekipmanları Tablo) . </li></ul></li><li> Hayvan, düşük bir büyütme amacı altında görüntüleme için hazır olduğunda, micropism üst lazer kare raster tarama desen aynı hizaya getirin. Bu yönlendirmek görüntü ve lazer güç verimli kullanımını sağlamaya yardımcı olacak. </li><li> Cam bir düzeltme yaka ile daha yüksek bir NA amacı kullanarak, yaklaşık 1 mm cam için doğru düzeltme yaka ayarlayın. Floresan görüntü deney sırasında göründüğünde, bir dikkatle, görüntü çözünürlüğünü en üst düzeye çıkarmak için düzeltme yaka optimize etmek için mikroskop içinde ulaşabilirsiniz. </li></ol> Bölüm 2: Sigara hayatta Hayvan Cerrahisi ve micropism Ekleme <ol><li> Tüm prosedürü uzunluğu, ilk kesi görüntüleme tamamlanıncaya kadar, deney hedeflerine bağlıdır. Tamamlamak için 40 dakika hayatta olmayan cerrahi prosedür ve micropism yerleştirme Ancak, yaklaşık 30 almak için bekleniyor olabilir. </li><li> Fare (P30-P60) tartılır ve uygun cerrahi işlemler için uygun bir uçak anestezi ketamin (100 mg / kg) ve xylazine (10 mg / kg) bir IP enjeksiyon kullanarak. </li><li> Tüm deney boyunca, hayvan anestezi seviyesini değerlendirmek için her 15-20 dakikada bir kontrol edilmelidir. Hayvan tepki sağlam bir ayak tutam ilave bir doz ketamin / xylazine gereklidir. Tipik bir ek doz ilk dozun üçte biri ve gerekirse acil IP enjeksiyon için bir şırınga içinde önceden hazırlanmış olabilir. </li><li> Fareyi doğru uyuşturulduktan sonra, hayvanın kafasına saç çoğunluğu # 40 bıçak ile bir düzenleyici kullanarak kazınıyor. </li><li> Nair ® görüntüleme sırasında micropism şekilde alabilirsiniz kılların ücretsiz bir yüzey oluşturmak yardımcı olmak için baş kalan kıllar için uygulanır. Nair ® 5 dakika sonra, bir pamuk uçlu çubuk yardımıyla temizlenir. </li><li> Anestezi hayvan düzgün bir fare stereotaktik cihazın içine yerleştirilir. Cerrahi işlemler ve görüntüleme oturumları sırasında hayvan 36 santigrat derece sıcaklıkta su dolu ısıtma yastığı tutulur. </li><li> Hayvanın kafa ile düzgün bir yerde sabit, temiz bir kesi kafatası medial satır aşağı cilt ayırmak için bir neşter kullanılarak yapılır. </li><li> % 3 hidrojen peroksit küçük bir miktar pamuk uçlu bir bez üzerinde yerleştirilir ve kafatası, kafatası ve cilt arasındaki membranlar temizlemek için uygulanır. </li><li> Hidrojen peroksit de bregma kraniotomi gerçekleştirmek ve micropism eklemek için bilerek, önemli bir dönüm noktası ortaya çıkarmak için yardımcı olur. </li><li> Kraniotomi başlamadan önce, kulak bar ve snack bar, düzgün bir tablo ile temel düzeyde olduğu gibi açıkta kalan kafatası yatırmak için ayarlanır. Bu kraniotomi için daha iyi bir platform sağlar. Buna ek olarak, bu gelen uyarma ışığı ile üst yüzeyine dik prizma yapar. Bu görüntüleme sırasında optik sapmaları en aza indirmeye yardımcı olacaktır. </li><li> Küçük bir diş çapak (~ 0.8 mm kafa boyutu), esnek bir uzatma kolu kullanarak bir Dremel ® araç bağlıdır. Cerrahinin için, yaklaşık olarak 7.000 ila 10.000 rpms hızını ayarlayabilirsiniz. </li><li> Kadar bir kare oluk kemik yılında kurulan diş çapak kafatası boyunca yağsız. Meydanın iki tarafında yaklaşık 2-3 mm uzunluğunda ve 1,5 mm kaudal ve bregma lateral 1 mm merkezli. </li><li> Kemik incelmesi kafatasına küçük bir delik aracılığıyla yapılıncaya kadar devam etmektedir. Forseps ca bir çiftn uzak kafatası kemik flep kaldırın. </li><li> Dura micropism korteks eklenebilir önce kaldırılması gerekiyor. Kanama, kan birkaç dakika için yüzey koagüle sağlayarak en iyi kontrol edilir. Daha sonra, pıhtılaşmış kan micropism takmadan önce cerrahi sünger kullanarak kaldırılır. </li><li> Korteks ile prizma uyum yardımcı yardımcı olmak için, dikey yüz micropism forseps kolları paralel dizilmiş olan. </li><li> Prizma üst neokortikal yüzeyi ile aynı hizada olacak kadar düzgün düzenlenen prizma ile, tüm micropism eklenir. </li><li> Doğru takıldığında micropism, düzgün bir pozisyonda kalmalıdır. Sonucu herhangi bir kanama az ve küçük bir cerrahi sünger ile absorbe edilebilir. Prizma yerleştirildikten sonra hayvan görüntüleme için hazırdır. </li><li> Micropism bir hayvan olarak kullanıldıktan sonra, birkaç kez yeniden kullanılmış olabilir. Ancak, düzgün kalan herhangi bir biyolojik materyal kaldırmak için temizlenmesi gerekir. Bu, küçük bir hacim HCl asit, metanol içine dalış takip içine prizma daldırma ile yapılabilir. Temizlenen micropism sonra ileride kullanmak kadar objektif kağıdı ile sarılmış olabilir. </li></ol> Bölüm 3: Temsilci Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: dik açılı micropism görüntüler. Bu deneyde kullanılan Prizmalar, hipotenüs üzerine, eksitasyon ve emisyon ışık iç yansıma izin vermek için geliştirilmiş bir gümüş kaplama ile bir milimetre, BK7 cam prizmalar. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: Image katmanı V YFP piramidal nöronların. Derin kortikal yüzeyinden 900 mikron - micropism Geniş alan görünümü görüntüleme ~ 800 piramidal hücre gövdeleri büyük bir nüfus ortaya koymaktadır. Buna ek olarak, katman doğru uzanan apikal dendritler Ben de çözülecektir. Ölçeği bar = 200 mm. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3: micropism uzaysal çözünürlük katman V piramidal nöronlar apikal dendritler dendritik dikenler çözmek için yeterli sağlar birlikte kullanılan yüksek sayısal diyafram objektif. Ölçek çubuğu = 10 mm. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4: micropism ve floresan boya kuyruk ven enjeksiyon kullanılarak elde edilen bir görüntü. Görüntü kortikal hacmi ile dallara derin beyin bölgeleri ve küçük kılcal damarları uzanan dikey, büyük kalibreli damarları gösterir. Ölçeği bar = 200 mm. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5: neokorteks, daha yüksek bir sayısal diyafram objektif kullanımı, kılcal damar ağı daha ayrıntılı görüntülenebilir . Ölçek çubuğu = 50 mm. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6: Microprisms damarları aracılığıyla akan görüntüleme kırmızı kan hücreleri (eritrositler) sağlar. Eritrositlerde floresan boya emer ve bu nedenle geminin üzerinde koyu çizgiler olarak görülür. Gemi karşısında hat-tarama, bir RBC akı ve hız ölçümleri elde edebilirsiniz. Ölçek çubuğu = 10 mm (üst ve alt görüntü yatay çubuk) ve 250 ms (alttaki resim dikey çubuk).

<ol>
	<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).</li></ol>

Yale Üniversitesi IACUC tarafından belirtilen kurallar ve düzenlemelere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Bir görüntüleme deneyde micropism kullanmak oldukça basit ve neokorteks in vivo çalışmalar için birçok avantaj sunuyor. Bu tekniği kullanarak Temsilcisi örnekler katman V kortikal nöronların sarı floresan protein eksprese eden transgenik farelerin alınan görüntüleri içerir. Microprisms kullanarak bir katman V büyük piramidal hücre gövdeleri bir koleksiyon, yaklaşık 1 mm kortikal yüzey altında görebilirsiniz. Ayrıca, Tufts (Şekil 2) içine uzaklaşan önce tüm yüzeysel katmanları üzerind...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>With enhanced silver reflective coating-(R77)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)</td>
<td>055-0010</td>
<td>With enhanced silver reflective coating-(R77)</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescein-dextran</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>FD70</td>
<td>70 kDa </td>
</tr>
<tr>
<td>0.28 NA, 4x air objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>XLFLUOR 4x/340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.60 NA, 40x air objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>LUCPLFLN</td>
<td>With 0-2 mm coverglass correction</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo imaging of deep cortical layers using a microprism

Biz bir micropism şeklinde derin bir beyin görüntüleme probu kullanarak kortikal doku in vivo görüntüleme için bir protokol mevcut. Microprisms boyutu 1 mm ve hipotenüs, eksitasyon ve emisyon ışık iç yansıma izin vermek için bir yansıtıcı kaplama var. Micropism prob aynı anda bir bakış açısı ile görüntüleri birden fazla kortikal tabakalar genellikle sadece dilim hazırlıkları görülmektedir. Görüntüler ile büyük bir alan görünümü (~ 900 mm). Buna ek olarak, hayatta olmayan bir cerrahi işlem ve mikroskop kurulumu hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Temsilcisi sonuçları, yüzeysel kortikal tabaka boyunca uzanan ve Tufts uzanan apikal dendritler gösteren Thy-1 YFP-H fareler katmanı V piramidal nöronlar görüntüleri içerir. Çözünürlük katmanı V nöronların soma yakın görüntü dendritik dikenler için yeterli oldu. Floresan boya kuyruk ven enjeksiyon kortekste kan damarlarının karmaşık ağ ortaya koymaktadır. Kılcal damarlar yoluyla akan kırmızı kan hücreleri (eritrositler) Line-tarama RBC hız ve akı oranları elde edilebilir ortaya koymaktadır. Bu roman micropism prob derin hücresel yapılar ve in vivo olarak kortikal fonksiyon görselleştirmek zarif ama güçlü bir yeni bir yöntem.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism at JoVE.com

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Fare neokorteks takılı sağ açılı microprisms genellikle dilim içinde bulunan bir bakış açısı ile birden fazla kortikal katmanları derin görüntüleme için izin verir. Bir milimetrelik microprisms geniş bir alan-view (~ 900 mm) ve dendritik dikenler çözmek için yeterli uzaysal çözünürlük sunuyor. Biz katmanı V nöronal görüntüleme ve microprisms kullanarak neokortikal vasküler görüntüleme göstermektedir.

Derin Kortikal Katmanlar bir micropism kullanarak in vivo Görüntüleme

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

in-vivo-imaging-of-deep-cortical-layers-using-a-microprism

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

11.3K Görüntüleme.  Yale University. Fare neokorteks takılı sağ açılı microprisms genellikle dilim içinde bulunan bir bakış açısı ile birden fazla kortikal katmanları derin görüntüleme için izin verir. Bir milimetrelik microprisms geniş bir alan-view (~ 900 mm) ve dendritik dikenler çözmek için yeterli uzaysal çözünürlük sunuyor. Biz katmanı V nöronal görüntüleme ve microprisms kullanarak neokortikal vasküler görüntüleme göstermektedir.

Video: In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Grubuyla Fare Kortikal Nöron Kültürler hazırlanması

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Biyoloji

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium indicator dyes, which are BAPTA-based organic molecules that change their spectral properties in response to the binding of Ca2+ ions. Calcium indicator dyes fall into two categories, ratio-metric dyes like Fura-2 and Indo-1 and single-wavelength dyes like Fluo-4. Ratio-metric dyes change either their excitation or their emission spectra in response to calcium, allowing the concentration of intracellular calcium to be determined from the ratio of fluorescence emission or excitation at distinct wavelengths.  The main advantage of using ratio-metric dyes over single wavelength probes is that the ratio signal is independent of the dye concentration, illumination intensity, and optical path length allowing the concentration of intracellular calcium to be determined independently of these artifacts. One of the most common calcium indicators is Fura-2, which has an emission peak at 505 nM and changes its excitation peak from 340 nm to 380 nm in response to calcium binding.  Here we describe the use of Fura-2 to measure intracellular calcium elevations in neurons and other excitable cells.

Calcium signals play a key role in many cellular processes including gene expression, survival and differentiation. Here we demonstrate how to perform calcium imaging using Fura-2 AM. Calcium imaging is a valuable tool to study the regulation of intracellular calcium in real time and its regulation of signaling cascades.

Kortikal nöronlar kullanarak Fura-02:00 Kalsiyum Görüntüleme

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

Meme Tümörleri IVIS Spektrum kullanarak in vivo Bioluminescent Görüntüleme

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo Drosophila Embriyolar Santrifüj

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Gen Yönetmelik Tek molekül Görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt; Dilinim tarafından Cotranslational Aktivasyon (CoTrAC) kullanma

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...