Bu çalışma, Biyomedikal Bilimler (AKM) Burroughs Wellcome Kariyer Ödülü tarafından desteklenen, Whitehall Vakfı Araştırma Bursu (AKM), Sloan Vakfı Bursu (AKM), NIH EY019277 (AKM) ve bir NEI tarafından finanse edilen, Vizyon Eğitim Grant, EY013319 ( EAK).

<ol><li> Iki foton mikroskopi, nöronlar floresan işaretleri ile etiketlenmiş bir hazırlık kullanarak sağlam beyin nöronları görselleştirmek için kullanılmaktadır. Deneylerde burada sunulan 5 piramidal hücrelerde 1 tabaka etiketler GFP-M transgenik fare hattı kullanıyoruz. Katman 5 piramidal hücreleri pia seviyesinin altında 300 mm derinliğe kadar, dendritler ve dendritik dikenler görselleştirme sağlayarak, yüzeysel katmanlarına dendritik süreçleri proje. Etiket hücrelere viral belirteçlerin (Lowery ve ark, vallahi teslim) kullanarak alternatif bir yaklaşım. </li><li> Aseptik cerrahi için% 70 etanol ve otoklav araçları kullanarak çalışma alanı sterilize edin. Temiz bir sargı ile yüzey işletim örtün. </li><li> Fareler IACUC onaylanmış prosedürlerini kullanarak Avertin çeyrek doz (0,0075 mg / ml) izledi. Fentanil kokteyl (; midazolam 5 mg / kg metatomadin 0.5 mg / kg fentanil 0.05 mg / kg) ile anestezi Analjezik fareler ön işlemden buprenorfin (0,5 mg / kg) subkutan (SQ). Anestezi uçağın kuyruk / ayak tutam test reaksiyonu ile izleyin. </li><li> 37.5 az hayvan koruyun ° C&#39;ye bağlı rektal termometre ile ısıtma battaniyesi. </li><li> Gözleri gözlerin kurumasını önlemek için oftalmik merhem sürün. Hood, ameliyat sırasında ışık kaynağı gözleri korumak için küçük kağıt levha ile gözler. </li><li> Makaslar kullanılarak, gözler başın arkasına (kulak arkası) saç kaldırmak. </li><li> Ardışık uygulaması ile% 70 etanol, hayvan kafası üst Temiz, betadin fırçalayın ve betadin çözüm izledi. </li><li> Gözleri orta hat (hangi yarımkürede görüntülü olacak bağlı olarak) ya da sağ veya sol kenarı boyunca, kulakları ve arkasında bir L-kesme kesi olun. Cilt üzerine katlayın ve hemen ameliyat sitesinden. Cilt görüntüleme oturumunun ardından sütüre olacak gibi cilt çıkarmayın. </li><li> Ince forseps kullanımı cildi hafifçe ilgi alanından yukarı çekin ve uzak. </li><li> Yavaşça temiz forseps veya mikrocerrahi bıçak ile kafatası maruz kalan alan periost kazınması. Pamuklu bir bez kullanarak, periost zarı tamamen kuru ve tamamen silinmiş olduğundan emin olmak için% 10 Ferric Chloride kafatasına küçük bir miktar geçerlidir. Kafatası tutkal uygun kalarak (11) sağlamak için tamamen kuru olduğundan emin önemlidir. Forseps veya mikrocerrahi bıçak kullanarak, nazikçe uzak kurutulmuş periost membran kazıyın. </li><li> Siyanoakrilat yapıştırıcı paslanmaz çelik kafa plaka (bkz. Şekil 1) ve yapıştırmayın kafatası plaka görüntüleme penceresi etrafında ince bir tabaka uygulayın. </li><li> Ahşap sonunda bir pamuklu çubukla sopa kullanarak, görüntüleme penceresi içinde dikişler tutkal sürün; görüntüleme plaka ve kafatası eğrilik arasındaki tüm boşlukları doldurmak için emin olun. </li><li> Tutkal hızlandırıcı bir damla pencerenin içine yerleştirin. Çabucak fazla tutkal hızlandırıcı, pamuklu bir bez veya kim silin ile silin. Tutkal tamamen sondaj önce katılaşmış olmalıdır. </li><li> 0.7 mm paslanmaz çelik çapak ile yapıştırılmış bir diş matkap kullanarak görüntüleme penceresi kafatası inceltmek için başlayın. Kafatası üzerinde çok fazla ısı üreten önlemek için zaman zaman% 0.9 &#39;luk steril serum fizyolojik uygulaması ile Alternatif delme. </li><li> Diş delme ile kafatası yüzeyi üzerinde küçük bir vuruş kullanarak kafatası üzerinde ince bir 4x4 mm penceresi. Künt son forseps ile kafatası inceliği sınayın. Kafatası yüzeyinde hafif hafif basınç ile girinti olacak. Görüntüleme için optimal kafatası kalınlığı 10 ile 30 mikron. </li><li> Kafatası ince ve pencere, tüm enkaz kafatası üzerinde tuzlu yer temizlenmelidir. Fotoğraf diseksiyon kapsamı monte edilmiş bir dijital kamera ile görüntüleme penceresi. Fotoğraf ve beynin damarsal kullanımı sonraki görüntüleme oturumları için görüntüleme plaka yerleştirmek için konumunuzu yardımcı olacaktır. </li><li> 2-foton teçhizat hayvan taşınması. Hayvan tüm görüntüleme oturumu sırasında ısıtıcı battaniye (rektal prob ile) kalmalıdır. Not: sedasyon altında iken, hayvanın temel vücut ısısı kortikal hasar veya ölümle sonuçlanan bir ısıtma ünitesi olmaması büyük dalgalanma olacak. </li><li> Mai Tai lazer, 10W maksimum güç ve modifiye Olympus Fluoview konfokal ünitesi için katı hal pompa ile iki foton mikroskop kullanılır. Sistemi, derin doku görüntüleme için optimize edilmiş ve dış dedektörleri beyin floresan maksimum algılama sağlamak için mümkün olduğunca objektif yakın olarak yüklenir. Olympus LUMPlan fl / IR 20X/0.95NA objektif lens kullanılır. % 0.9 serum fizyolojik amacı dalma için görüntüleme sırasında kullanılır. </li><li> Bu mikroskop kullanarak, ve düşük dijital zoom (x1), parlak etiketli nöron içeren bir alan tanımlar. </li><li> Mikroskop göz parçası yapıştırılmış bir dijital kamera kullanarak, görüntüleme alanında bir fotoğraf çekmek. Alternatif olarak, kan damarsal deseni eskiz. Bu yeniden gereklidaha sonraki bir zaman noktasında aynı görüntüleme konuma çevirin. </li><li> Tüm görünür ölçüde ölçüde dendritik dallanma gösteren beyin (genellikle ~ 200 mm kapsayan) sayesinde, düşük bir büyütme yığını (5 mikron adım x20 amacı, 512x512 piksel) edinin. Not: Bu düşük büyütme görüntü, hem kan damarları ve dendritler genç ve yetişkin hayvanların kendi yapısını korumak, daha sonraki zaman noktalarında görüntüleme alanını bulmak için kullanılacaktır. </li><li> Görüntüleme yazılımı (Fluoview, v. 5.0, FV300) kullanarak, 8 kat dijital büyütme oranını artırın. X, Y koordinatları (tava koordinatları), gerekirse ayarlayın ve konumları ve dendritik dikenler yapısı da dahil olmak üzere ayrıntılı dendritik morfoloji gösteren bir yüksek büyütme yığını toplamak. Her yığın toplanması, yani pan koordinatlar, toplanması, yığın içinde adım adım z boyutu ve sayısı aralığı ile ilgili ayrıntılı notlar alın. Bu notlar bir sonraki zaman noktasında bu dendrit ve akson dönerken kullanılacaktır. </li><li> Görüntüleme ardından, kafatası yüzeyinden yavaşça plaka ayırarak kafa plaka kaldırmak. Forseps kullanarak, kafatası üzerinde kalan herhangi bir kalıntı tutkal kaldırmak ve% 0.9 &#39;luk steril serum fizyolojik ile kafatası yüzeyi silin. # 6 sütür iplik kullanarak birlikte kafatası üzerinde deri dikin. % 70 etanol ile alanı silin. Ameliyat sonrası iyileşme sırasında ağrı hafifletmek için, 0.1 mg / kg Buprenorfin analjezik, SQ yönetmek. </li><li> Bir ısı lambası altında temiz bir kafes yerleştirin hayvan uyanır ve mobil kadar. Orijinal kafes hayvan dönün. </li><li> Daha sonraki bir zaman noktasında (2 gün dışında birçok ay görüntüleme zaman noktalarında herhangi bir yerde olabilir) Reimage hayvan için, dikiş kaldırmak ya da yukarıdaki gibi aseptik yöntemler kullanarak kafasına cilt yeniden. Orijinal görüntüleme konumu için beynin damarsal (ilk cerrahi tarihinde alınan) dijital görüntü kullanın. Reaffix paslanmaz çelik headplate (adım 10-12). Yavaşça herhangi bir kemik görüntüleme zaman noktaları arasında yeniden büyümüş olabilir uzakta ince bir mikrocerrahi bıçak kullanın. Eğer gerekli diş matkap ile ince. Clear görüntüleme enkaz pencere ve% 0.9 &#39;luk steril tuzlu bir damla uygulayın. </li><li> Iki foton mikroskop hayvan Carry ve orijinal görüntüleme alanını bulun. Yardım için ilk görüntüleme oturumu sırasında alınan dijital fotoğraf kullanın. </li><li> Fluoview programını açın ve orijinal düşük büyütme görüntüyü açmak. Yapıştırmayın bilgisayar ekranında ve kroki için bir saydamlık sayfalık bir saydamlık kalem kullanarak büyük bir kan damarı desen. </li><li> Canlı görüntü açın ve asetata çizilen desen kan damarsal realign. </li><li> Yapılarda yakınlaştırılmış 8x Reimage için, bir önceki görüntüleme oturumda istenilen toplanan yığın açın. Bilgisayar ekranına yapıştırılan yapısı (glial, dendritik, yani akson), asetat film üzerine çizin. </li><li> Canlı Görüntü 8x zoom ve pan ilk gününde görüntüleme parametrelerine koordine eder. Düşük büyütme yeri hizalayarak doğruluğunu bağlı olarak, o da biraz görüntü açısını ayarlamak için gerekli olabilir. Istenilen yapısı tespit edildikten sonra, kabataslak yüksek büyütme desen yapısı kadar maç. Z-yığın, sonraki analiz için z-yığın görüntüleri aynı bir adım boyutu ve sayısı ile toplayın. </li><li> Tüm yüksek büyütme görüntüleri yeniden toplanana kadar 29 ve 30 adımları tekrarlayın. </li><li> Görüntüleme işlemi tamamlandığında, tekrar adımları 22-24. Re-görüntüleme, 2 ayrı zaman noktalarında tekrar edilebilir. </li><li> Hayvanlar üzerinde yapılan deneyler, Laboratuar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği tarafından tam akreditasyon Vivarium ve University of Rochester Tıp ve Diş Hekimliği Fakültesi Laboratuar Hayvanları Tıp Bölümü tarafından belirtilen kurallar ve düzenlemelere uygun olarak yapıldı International (AAALAC) ve eyalet yasası, federal tüzüğü ve NIH politikası ile uyum içinde. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar GFP-M ifade farelerde, bir alt katman 5 piramidal hücreleri ve buna karşılık gelen dendritik süreçleri 2-foton lazer tarama mikroskobu (2PLSM 1) kullanarak kolayca görüntülenebilmekte olabilir. Burada istenen görüntüleme konumu üzerinde kafatası ~ 10-30 mikron inceltilmiş olduğu seyrelmiş bir kafatası hazırlık gösterdi. Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi, protokol bize açıkça, akut ya da kronik analizi (Şekil 2) için sağlam görsel korteksteki kortikal dendritler ve dikenler görselleştirmek için izin verdi. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Özel baş ve taban plakası inceltilmiş-kafatası cerrahisi hazırlanması için kullanılan özel yapılmış baş ve taban plakası (A) Üstten görünüm. Ölçüye baş ve taban plakası (B) Yan görünüm. (C, D), kafa plaka detaylı şematik ve görüntü. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> <strong&gt; Şekil 2. 2PLSM Temsilcisi sonuçlar ince kafatası hazırlık aşağıdaki (A) Dendritler iki foton mikroskopi kullanılarak, transgenik GFP-M fare görsel korteks in vivo imaged . Görüntü, son bir derinliği 175 mm pia her 5 mikron elde tek görüntü, bir projeksiyon. A kutulu alanda büyütülmüş bir bölgeyi temsil eder (B) ve (C) 0 (D0) ve dört gün sonra (D4) günü imaged. B ve C kutulu dendritik şube istikrarlı dikenler (beyaz ok uçları) gösteren (D, E) Yüksek büyütme / geri çekilmeden dikenler (kırmızı ok uçları) ve yeni dikenler (yeşil ok uçları) kaybetti. Ölçek bar = A. 200 mikron, B, C. 20 mikron, D, E. 5 mm.

<ol>
	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo.">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li></ol>

Iki foton mikroskopi kullanılarak Kronik görüntüleme plastisite 2-5 sırasında tetiklenen morfolojik değişiklikleri incelemek için giderek daha popüler bir teknik haline gelmektedir . Burada farklı görüntüleme gün bozulmadan fare beyin tespit dendritik dikenler takip seyrelmiş bir kafatası hazırlık göstermektedir. Bu protokolde, korteks minimal hasara neden kafatası ve beyin fonksiyonu 6 değiştirebilir nöro çok düşük seviyelerde ile sonuçlanan, değişmeden kalır. Bu ha...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Medetomindine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Midazolam HCL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>2,2,2-tribromoethanol </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
</td>
</tr>
<tr>
<td>2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
</td>
</tr>
<tr>
<td>TC-1000 Temp. Control System for Mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CWE, Inc.</td>
<td>TC-1000 Mouse</td>
<td>Body Temp. Regulation</td>
</tr>
<tr>
<td>Toberadex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eye Ointment</td>
</tr>
<tr>
<td>10% Ferric Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical, Inc.</td>
<td>3120-32</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microsurgical Blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Industries</td>
<td>S-6400</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 404,401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 46551</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 40140</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Zip Kicker Glue Accelerator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pacer Technology</td>
<td>PT-29</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ram Products, Inc.</td>
<td>TECH2000ON/OFF</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>#6-0 (0.7 metric ) silk suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>K8894H</td>
<td>Taper C-1</td>
</tr>
<tr>
<td>Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14084-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation

Bozulmamış beyin hücreleri ve nöronal süreçleri yaşayan iki foton lazer tarama mikroskobu (2PLSM) kullanarak in vivo görüntüleme çalışma sağlar. Burada sunulan teknik MSS eksitatör postsinaptik sitelerin büyük çoğunluğu temsil eden küçük yapılar dendritik dikenler izleme izin mikroskobik çözünürlüğü ile çeşitli zaman noktalarında (kronik görüntüleme) aynı bölgede beyin görüntüleme sağlar. Ince kortikal yapıların, birkaç kez puan üzerinden açıkça çözmek için yeteneği, sinapsların morfolojik değişiklikler ve devre remodelling altta yatan mekanizmaların açıklanmasına yardımcı olan beyin plastisite çalışma, özellikle pek çok avantajı vardır. Bu video ve tamamlayıcı malzeme, kronik seyrelmiş bir kafatası hazırlık kullanarak bozulmamış beyin in vivo görüntüleme için bir protokol göstermektedir. Inceltilmiş kafatası hazırlama, minimal invaziv bir yaklaşım, böylece bir inflamatuar yanıt başlangıcı azaltarak, dura ve / veya korteks potansiyel zarar görmesini engeller. Bu protokol doğru yapıldığında, açıkça zaman uzun bir süre içinde bozulmamış beyin dendritik omurga özellikleri değişiklikleri izlemek için mümkündür.

Watch this Scientific Journal Video about Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation at JoVE.com

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Bu video ve tamamlayıcı malzeme, kronik bir protokol<em&gt; In vivo</em&gt; Seyrelmiş bir kafatası hazırlık kullanarak sağlam beyin görüntüleme.

Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Görüntüleme.  University of Rochester. Bu video ve tamamlayıcı malzeme, kronik bir protokol In vivo Seyrelmiş bir kafatası hazırlık kullanarak sağlam beyin görüntüleme.

Video: Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Nörobilim

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Süreksiz Percoll Sakkaroz Yoğunluk Gradient kullanarak Fare Cortex Synaptoneurosomes hazırlanması

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Fare Beyin Uzun vadeli Görüntüleme için Parlak ve Takviyeli inceltilmiş-kafatası Pencere

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Için inceltilmiş-kafatası Kortikal Pencere Tekniği<em&gt; In Vivo</em&gt; Optik Koherens Tomografi Görüntüleme

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Yüksek alan fMRI kullanılarak Yetişkin kedilerde işitme korteksi Fonksiyonel Görüntüleme

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed as candidate sites for misrouting. Since a correlation between the number of lateral geniculate nucleus (LGN) relay neurons and LGN size has been shown, and based on previously reported reductions in LGN volumes in human albinism, we suggest that fiber projections from LGN to the primary visual cortex (V1) are also reduced. Studying structural differences in the visual system of albinism can improve the understanding of the mechanism of misrouting and subsequent clinical applications. Diffusion data and tractography are useful for mapping the OR (optic radiation). This manuscript describes two algorithms for OR reconstruction in order to compare brain connectivity in albinism and controls.An MRI scanner with a 32-channel head coil was used to acquire structural scans. A T1-weighted 3D-MPRAGE sequence with 1 mm3 isotropic voxel size was used to generate high-resolution images for V1 segmentation. Multiple proton density (PD) weighted images were acquired coronally for right and left LGN localization. Diffusion tensor imaging (DTI) scans were acquired with 64 diffusion directions. Both deterministic and probabilistic tracking methods were run and compared, with LGN as the seed mask and V1 as the target mask. Though DTI provides relatively poor spatial resolution, and accurate delineation of OR may be challenging due to its low fiber density, tractography has been shown to be advantageous both in research and clinically. Tract based spatial statistics (TBSS) revealed areas of significantly reduced white matter integrity within the OR in patients with albinism compared to controls. Pairwise comparisons revealed a significant reduction in LGN to V1 connectivity in albinism compared to controls. Comparing both tracking algorithms revealed common findings, strengthening the reliability of the technique.

This manuscript describes deterministic and probabilistic algorithms for white matter (WM) reconstruction, used to examine differences in optic radiation (OR) connectivity between albinism and controls. Although probabilistic tractography follows the true course of nerve fibers more closely, deterministic tractography was run to compare the reliability and reproducibility of both techniques.

Difüzyon tensör görüntüleme ve traktografi kullanarak İnsan Albinizmi İlköğretim Görsel Yolu&#39;ndaki Bağlantı Ölçme

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. Several recent studies have demonstrated the effectiveness of chronic VNS in enhancing central nervous system plasticity to improve motor rehabilitation, extinction learning, and sensory discrimination. Construction of chronically implantable devices for use in such studies is challenging due to rats&#8217; small size, and typical protocols require extensive training of personnel and time-consuming microfabrication methods. Alternatively, commercially available implantable cuff electrodes can be purchased at a significantly higher cost. In this protocol, we present a simple, low-cost method for construction of small, chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in rats. We validate the short and long-term reliability of our cuff electrodes by demonstrating that VNS in ketamine/xylazine anesthetized rats produces decreases in breathing rate consistent with activation of the Hering-Breuer reflex, both at the time of implantation and up to 10 weeks after device implantation. We further demonstrate the suitability of the cuff electrodes for use in chronic stimulation studies by pairing VNS with skilled lever press performance to induce motor cortical map plasticity.

Existing approaches for constructing chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in small rodents often require specialized equipment and/or highly trained personnel. In this protocol we demonstrate a simple, low-cost approach for fabricating chronically implantable cuff electrodes, and demonstrate their effectiveness for vagus nerve stimulation (VNS) in rats.

Sıçanlarda Kronik İmplantasyon için Periferik Sinir Stimülasyon Elektrotlarının Hazırlanması

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...