نشكر أنتوني Koleske J. ، دكتوراه عن توفير YFP الفئران.

الجزء 1 : بصريات والإعداد Microprism مجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وmicroprisms التي نستخدمها هي 1 ملم ، والحق الزاوية الموشورات مصنوعة من الزجاج BK7 شراؤها من شركة Optosigma (الشكل 1). يتم التعامل مع Microprisms باستخدام الملقط كلما أمكن ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير المغلفة ووتر من microprism بالفضة المعززة لتوفير انعكاسية أكبر من 97 ٪ 4-200 نانومتر. يوفر هذا التأمل الداخلي من كل من ضوء الليزر الإثارة ومضان المنبعثة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم معالجتها باستخدام الملقط Microprisms دائما عندما يكون ذلك ممكنا. يتم ارتداء القفازات في جميع الأوقات للحفاظ على المنشور نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم مبنية خصيصا اثنين الفوتون المجهر قادرة على تصوير الحيوانات الصغيرة. يوضع الحيوان ، والتي تعلق على الجهاز المجسم ، في مرحلة من 3 محاور بمحركات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل جهاز كمبيوتر المجهر لتشغيل ويندوز ScanImage البرمجيات. ScanImage هي الصورة البرمجيات اقتناء كتب في Matlab بواسطة Pologruto آخرون 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microprism للتصوير ، نقوم بجمع الصور في القرار 1024 x 1024 بكسل أو 512 512 س. بالإضافة إلى ذلك ، فإننا عادة تفحص في 2 مللي / سطر أو 4 مللي ثانية / السطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استخدام نوعين من الأهداف في التجارب : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأقل موضوعية الفتحة العددية الهواء (NA) للتصوير الميداني للرؤية واسعة (انظر الجدول من الكواشف والمعدات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> A الهواء العالي NA الهدف مع كوب طوق تصحيح قادرة على الحد من الانحرافات الناجمة عن كروية 0-2 ملم من الزجاج (انظر الجدول من الكواشف والمعدات). </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الحيوان هو على استعداد للتصوير تحت الهدف التكبير منخفضة ، محاذاة نمط النقطية مربع مسح الليزر مع الجزء العلوي من microprism. وهذا سيساعد على توجيه الصورة وجعل الاستخدام الكفء للطاقة الليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهدف باستخدام أعلى NA مع كوب طوق التصحيح ، تعيين ذوي الياقات تصحيح لتصحيح ما يقرب من 1 ملم من الزجاج. مرة واحدة في صورة الفلورسنت يظهر أثناء التجربة ، يمكن للمرء أن يصل بعناية داخل المجهر لتحسين طوق تصحيح لتعظيم قرار التصوير. </li></ol> الجزء 2 : عدم بقاء جراحة الحيوان والإدراج Microprism <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طول الإجراء بأكمله ، من شق مبدئي لحين الانتهاء من التصوير ، ويعتمد على أهداف التجربة. ومع ذلك ، يمكن توقع موضع غير البقاء على قيد الحياة العملية الجراحية وmicroprism لاتخاذ ما يقرب من 30 -- 40 دقيقة لإكمالها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وزن الفئران (P30 - P60) وتخدير مناسب باستخدام حقنة IP الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) إلى طائرة مناسبة لعمليات جراحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كافة مراحل التجربة برمتها ، يجب فحص الحيوان كل 15-20 دقيقة لتقييم مستواه من التخدير. إذا كان هذا الحيوان هو مطلوب يتفاعل مع شركة أخمص القدمين ، قرصة ، وجرعة إضافية من الكيتامين / زيلازين. عادة جرعة إضافية من ثلث الجرعة الأولي ، ويمكن أن تكون على استعداد في وقت مبكر في محقنة للحقن IP فوري إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة على الماوس تخدير بشكل صحيح ، حلق الأغلبية من الشعر على رأس الحيوان قبالة باستخدام الانتهازي بشفرة # 40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تطبيق ® ناير إلى الشعر المتبقية على رأسه للمساعدة على خلق سطح خال من الشعر التي قد تحصل في الطريق من خلال microprism التصوير. بعد 5 دقائق ، ويتم تنظيف ® ناير قبالة باستخدام مسحة القطن ذات الرؤوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعت بشكل صحيح في تخدير الحيوانات ماوس الجهاز المجسم. أثناء العمليات الجراحية وجلسات التصوير يبقى الحيوان على المياه المليئة سادة التدفئة وضعت في 36 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع رأس الحيوان ثابتة في مكانها الصحيح ، يتم شق واحد نظيف باستخدام مشرط أسفل خط وسطي من الجمجمة لفصل الجلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع كمية صغيرة من بيروكسيد الهيدروجين 3 ٪ على مسحة القطن ذات الرؤوس وتطبيقها على الجمجمة لازالة الأغشية بين الجمجمة والجلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيروكسيد الهيدروجين يساعد أيضا على الكشف عن bregma ، معلما رئيسيا في معرفة مكان لأداء حج القحف وإدراج microprism. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل بدء حج القحف ، تعدل بشكل صحيح أشرطة الأذن وشريط لدغة لإمالة الجمجمة يتعرض مثل هذا فإنه من مستوى أساسا مع الجدول. وهذا يوفر أفضل منصة لحج القحف. بالإضافة إلى ذلك ، وهذا يجعل السطح العلوي للعمودي المنشور مع ضوء الإثارة واردة. وهذا سيساعد على تقليل الانحرافات البصرية في حين التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم توصيل لدغ صغيرة الأسنان (~ 0،8 ملم حجم الرأس) إلى أداة ® DREMEL باستخدام ذراع تمديد مرنة. لcraniotomies ، وضعنا السرعة إلى حوالي 7000 إلى 10،000 RPMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير منزوع الدسم ولدغ الأسنان على طول الجمجمة حتى يتم تأسيس أخدود مربع في العظام. جوانب مربع تقريبا 2-3 ملم في الطول ، وتركزت الذيلية 1.5 مم و 1 مم الجانبي لbregma. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استمرار ترقق العظم حتى يتم من خلال فتحة صغيرة في الجمجمة. زوج من كاليفورنيا ملقطن رفع رفرف بعيدا عن العظام في الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والجافية يحتاج إلى إزالتها قبل أن يمكن إدراج microprism في القشرة. يتم التحكم أفضل نزيف الدم عن طريق السماح للتخثر على السطح لعدة دقائق. بعد ذلك ، تتم إزالة دم متخثر باستخدام اسفنجة جراحية قبل إدراج microprism. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للمساعدة على مساعدة في محاذاة المنشور مع القشرة ، واصطف الوجه العمودي للmicroprism حتى موازية لالمقابض على ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع المنشور الذي عقد بشكل صحيح ، يتم إدراج microprism كامل حتى في أعلى المنشور هو مطاردة مع سطح القشرة المخية الحديثة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما أدرجت بشكل صحيح ، يجب أن تبقى في microprism الموقف السليم. أي أن النتائج النزيف هو الحد الأدنى ويمكن استيعابها مع الاسفنج جراحية صغيرة. مرة واحدة المنشور في مكان الحيوان مستعدة للتصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم استخدام microprism في حيوان ، فإنه يمكن إعادة استخدامها مرات عدة. ومع ذلك ، فإنه يجب أن يتم تنظيفها بشكل صحيح لإزالة أي مواد المتبقية البيولوجية. ويمكن تحقيق ذلك من خلال غمس المنشور في حجم صغير من حمض الهيدروكلوريك ، يليه تراجع الى الميثانول. يمكن تنظيفها ثم microprism تكون ملفوفة في ورقة عدسة حتى استخدامها في المستقبل. </li></ol> الجزء 3 : النتائج الممثل <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 : صور من microprism حق الزاوية. المناشير المستخدمة في هذه التجربة هي واحدة عادية مواشير الزجاج BK7 مع طلاء الفضة المعزز على وتر للسماح التأمل الداخلي من الإثارة والخفيفة الانبعاثات. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 : صورة V طبقة الخلايا العصبية الهرمية YFP. مجال واسع للرؤية التصوير مع microprism يكشف عن عدد كبير من أجسام الخلايا الهرمية ~ 800-900 ميكرون عميقة من سطح القشرية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن التشعبات قمية تمتد نحو طبقة أنا أيضا أن تحل. مقياس بار = 200 ميكرومتر. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الرقم 3 : الهدف فتحة أعلى العددية المستخدمة في بالاشتراك مع microprism يوفر القرار المكانية كافية لحل العمود الفقري شجيري على التشعبات قمية على الخلايا العصبية طبقة هرمية V. مقياس بار = 10 ميكرومتر. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4 : الحصول على صورة باستخدام microprism وحقن الوريد الذيل صبغة الفلورسنت. صورة تظهر العمودي والسفن ذات عيار كبير يمتد من مناطق الدماغ العميق والشعيرات الدموية الصغيرة قبالة المتفرعة من خلال حجم القشرية. مقياس بار = 200 ميكرومتر. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5 : استخدام أعلى هدفا الفتحة العددية ، يمكن تصويرها على شبكة من الشعيرات الدموية في اللحاء الجديد بمزيد من التفصيل. مقياس بار = 50 ميكرومتر. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig6.jpg" alt="الشكل 6" /> الشكل 6 : Microprisms كما يسمح لخلايا الدم الحمراء والتصوير (كرات الدم الحمراء) التي تتدفق من خلال السفن. كرات الدم الحمراء لا تمتص صبغة الفلورسنت ، وبالتالي فهي تعتبر الظلام المشارب في جميع أنحاء السفينة. عن طريق المسح الضوئي عبر الإنترنت السفينة ، يمكن للمرء الحصول على قياسات تدفق RBC والسرعة. مقياس بار = 10 ميكرومتر (شريط أفقي في أعلى وأسفل الصورة) و 250 مللي ثانية (شريط عمودي في الصورة السفلى).

<ol>
	<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).</li></ol>

وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها IACUC جامعة ييل.

باستخدام microprism في تجربة التصوير واضح ومباشر نسبيا وتوفر العديد من المزايا لفي الدراسات المجراة على القشرة المخية الحديثة. أمثلة ممثل باستخدام هذه التقنية تشمل الصور المأخوذة من الفئران المعدلة وراثيا التعبير عن بروتين فلوري الصفراء في الخلايا العصبية الخامس طبقة ?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>With enhanced silver reflective coating-(R77)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)</td>
<td>055-0010</td>
<td>With enhanced silver reflective coating-(R77)</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescein-dextran</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>FD70</td>
<td>70 kDa </td>
</tr>
<tr>
<td>0.28 NA, 4x air objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>XLFLUOR 4x/340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.60 NA, 40x air objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>LUCPLFLN</td>
<td>With 0-2 mm coverglass correction</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo imaging of deep cortical layers using a microprism

نقدم لبروتوكول في مجال التصوير من الأنسجة الحية القشرية باستخدام مسبار التصوير في أعماق المخ في شكل microprism. Microprisms هي 1 ملم في الحجم ولها طلاء عاكسة على وتر للسماح التأمل الداخلي من الإثارة والخفيفة الانبعاثات. التحقيق microprism الصور في وقت واحد طبقات قشرية متعددة مع منظور ينظر عادة إلا في شريحة الاستعدادات. يتم جمع الصور مع حقل كبير من رأي (~ 900 ميكرون). بالإضافة إلى ذلك ، ونحن نقدم تفاصيل بشأن الإجراء غير الجراحي والإعداد بقاء المجهر. النتائج ممثل تضمين الصور طبقة من الخلايا العصبية الهرمية الخامس من خاصتك - 1 - H YFP الفئران تبين التشعبات التي تمتد من خلال قمية طبقة قشرية سطحية وتمتد إلى خصلات. وكان القرار كافية لصورة العمود الفقري شجيري قرب سوما طبقة من الخلايا العصبية الخامس. إن الحقن الذيل الوريد صبغة الفلورسنت يكشف عن شبكة معقدة من الأوعية الدموية في القشرة. خط المسح الضوئي لخلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) التي تتدفق من خلال الشعيرات الدموية RBC يكشف سرعة ويمكن الحصول على معدلات التدفق. هذا التحقيق microprism الرواية أنيقة ، طريقة جديدة لكنها قوية من تصور الهياكل الخلوية العميق وظيفة القشرية في الجسم الحي.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism at JoVE.com

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

الحق الزاوية microprisms إدراجها في القشرة المخية الحديثة الماوس يسمح للتصوير عميق للطبقات قشرية متعددة مع وجهة النظر التي توجد عادة في شريحة. واحد ملليمتر microprisms العرض حقل من رأي واسعة (900 ميكرون ~) والقرارات المكانية كافية لحل شجيري العمود الفقري. نظهر طبقة V التصوير العصبية والأوعية الدموية التصوير باستخدام microprisms القشرة المخية الحديثة.

في التصوير المجراة من الطبقات العميقة القشرية باستخدام Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

in-vivo-imaging-of-deep-cortical-layers-using-a-microprism

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

11.2K Views.  Yale University. الحق الزاوية microprisms إدراجها في القشرة المخية الحديثة الماوس يسمح للتصوير عميق للطبقات قشرية متعددة مع وجهة النظر التي توجد عادة في شريحة. واحد ملليمتر microprisms العرض حقل من رأي واسعة (900 ميكرون ~) والقرارات المكانية كافية لحل شجيري العمود الفقري. نظهر طبقة V التصوير ...

Video: In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

التحضير للثقافات ماوس العصبية القشرية نأت

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium indicator dyes, which are BAPTA-based organic molecules that change their spectral properties in response to the binding of Ca2+ ions. Calcium indicator dyes fall into two categories, ratio-metric dyes like Fura-2 and Indo-1 and single-wavelength dyes like Fluo-4. Ratio-metric dyes change either their excitation or their emission spectra in response to calcium, allowing the concentration of intracellular calcium to be determined from the ratio of fluorescence emission or excitation at distinct wavelengths.  The main advantage of using ratio-metric dyes over single wavelength probes is that the ratio signal is independent of the dye concentration, illumination intensity, and optical path length allowing the concentration of intracellular calcium to be determined independently of these artifacts. One of the most common calcium indicators is Fura-2, which has an emission peak at 505 nM and changes its excitation peak from 340 nm to 380 nm in response to calcium binding.  Here we describe the use of Fura-2 to measure intracellular calcium elevations in neurons and other excitable cells.

Calcium signals play a key role in many cellular processes including gene expression, survival and differentiation. Here we demonstrate how to perform calcium imaging using Fura-2 AM. Calcium imaging is a valuable tool to study the regulation of intracellular calcium in real time and its regulation of signaling cascades.

التصوير الكالسيوم من الخلايا العصبية باستخدام Fura القشرية ، 02:00

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

في التصوير Bioluminescent المجراة من أورام الثدي باستخدام IVIS الطيف

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

داخل الجسم الحي الطرد المركزي الجنين ذبابة الفاكهة

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

التصوير البروتين البروتين التفاعلات في الجسم الحي</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

واحدة جزيء التصوير من تنظيم الجينات<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; استخدام التنشيط بواسطة Cotranslational انشقاق (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

الكميات التعبير البروتين والتعاون التعريب عن طريق تعدد المناعية النسيجية تلطيخ والمتعددة الأطياف التصوير

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

قياس صلابة من<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

إعداد ذبابة الفاكهة والتصوير الطولي من وظيفة القلب في فيفو باستخدام البصرية بالاتساق المجهري (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...