우리는 YFP 마우스를 제공 앤소니 J. Koleske, 박사 학위를 주셔서 감사합니다.

1 부 : Microprism의 광학 현미경 설정 <ol><li> 우리가 사용하는 마이크로는 Optosigma 공사 (그림 1)에서 구입한 BK7 유리로 만든 1 mm, 오른쪽 - 각도 프리즘입니다. 마이크로가 가능한 집게를 사용하여 처리됩니다. </li><li> 2,000 NM - microprism의 hypotenuse 400에서 이상 97%의 반사율을 제공하기 위해 향상된 은으로 코팅됩니다. 이것은 레이저 여기 광과 형광 방출 모두의 내부 반사를 제공합니다. </li><li> 마이크로 항상 가능하면 집게를 사용하여 처리됩니다. 장갑은 프리즘을 더럽히지 않으 항상 착용하고 있습니다. </li><li> 우리는 작은 동물 이미징 수있는 맞춤식 두 광자 현미경을 사용합니다. stereotactic 장치에 부착된 동물은, 3 축 전동 무대에서 배치됩니다. </li><li> 현미경은 ScanImage 소프트웨어를 실행하는 윈도우 PC에 연결됩니다. ScanImage는 Pologruto 외 1 Matlab로 작성된 이미지 수집 소프트웨어입니다. </li><li> microprism 이미징 위해, 우리는 1024 X 1024 512 X 512 픽셀의 해상도로 이미지를 수집합니다. 또한, 우리는 일반적으로 2 MS / 라인 또는 4 MS / 라인에서 스캔. </li><li> 목표의 두 가지 유형이 실험에서 사용됩니다 : <ul><li> 다양한 뷰 필드 이미징을위한 낮은 수치 구경 (NA) 공기 목적 (시약 및 장비의 표 참조). </li><li> 0 유발 구형 aberrations을 최소화 수있는 유리 보정 칼라와 높은 NA 공기 목적 - 유리 2mm (시약 및 장비의 표 참조). </li></ul></li><li> 동물이 낮은 배율 목적에 따라 이미징을위한 준비가되면, microprism 상단으로 레이저의 제곱 래스터 스캐닝 패턴을 맞춥니다. 이것은 동양에게 이미지를 도움 레이저 파워를 효율적으로 사용할 수 있도록합니다. </li><li> 유리 보정 칼라와 높은 NA의 목표를 사용하여 유리의 약 1mm에 대한 해결하기 위해 보정 칼라를 설정합니다. 형광 이미지가 실험 도중 나타나면, 하나주의 깊게 이미지 해상도를 극대화하기 위해 보정 칼라를 최적화하기 위해 현미경 내부에 도달할 수 있습니다. </li></ol> 2 부 : 비 생존 동물 수술과 Microprism 삽입 <ol><li> 전체 프로 시저의 길이는 초기 절개에서 이미지의 완성까지, 실험의 목표에 따라 달라집니다. 완료 40 분 - 그러나, 이외의 생존 수술과 microprism 게재는 약 30을 기대하실 수 있습니다. </li><li> 마우스 (P30 - P60)은 무게가 있고 anesthetized 적절하게 수술 절차에 적합 비행기에 마취제 (100 MG / kg)과 xylazine (10 MG / kg)의 IP 주사를 사용합니다. </li><li> 전체 실험을하는 동안, 동물은 마취 자사의 수준을 평가하기위한 모든 15~20분을 확인하여야한다. 동물에 반응하는 경우 회사 발가락 - 찔러봐, 마취제 / xylazine의 추가 복용이 필요합니다. 일반적으로 보완 복용량은 초기 복용량의 1 세번째이며 필요한 경우 즉각적인 IP 주사 주사기에 미리 준비하실 수 있습니다. </li><li> 마우스가 제대로 anesthetized되면​​, 동물의 머리에있는 머리카락의 대부분은 # 40 블레이드와 트리머를 사용하여 해제 면도 있습니다. </li><li> 나이르 ®은 이미징 동안 microprism의 방법으로 얻을 수 머리카락 무료로 표면을 만들 수 있도록 머리에 남아있는 머리카락이 적용됩니다. 5 분 후에, 나이르 ®은 목화 - 스쳐 면봉을 사용하여 닦아입니다. </li><li> anesthetized 동물이 제대로 마우스 stereotactic 장치에 배치됩니다. 수술 절차 및 이미징 세션 동안 동물은 섭씨 36 도에 설정 물이 채워진 가열 패드에 보관됩니다. </li><li> 제대로 자리에 고정 동물의 머리를 한 깨끗한 절개는 피부를 분리 두개골의 중간 라인 아래 메스를 사용하여 이루어집니다. </li><li> 3 % 과산화수소의 소량은 목화 - 스쳐 면봉에 위치하고 두개골과 피부 사이의 세포막을 치워로 두개골에 적용됩니다. </li><li> 과산화수소는 bregma, craniotomy을 수행하고 microprism를 삽입할 위치를 파악하는 주요 랜드마크를 공개하는 데 도움이됩니다. </li><li> craniotomy이 시작되기 전에, 귀 바, 물린 표시줄이 올바르게 그것은 테이블과 기본적으로 수준 그러한 노출된 두개골을 기울 조정됩니다. 이것은 craniotomy을위한 더 나은 플랫폼을 제공합니다. 또한, 이것은 들어오는 여기 빛이 프리즘 직각의 상단 표면을합니다. 이것은 이미징하는 동안 광학 aberrations을 최소화하는 데 도움이됩니다. </li><li> 작은 치과 버는 (~ 0.8 mm의 머리 크기) 유연한 확장 팔을 사용하여 Dremel ® 도구에 연결되어 있습니다. craniotomies 위해, 우리는 약 7,000 만 RPM으로하는 속도를 설정합니다. </li><li> 광장 홈이 뼈 설립 때까지 치과 버는 두개골을 따라 미끄러져입니다. 광장의 양쪽 길이가 약 2~3mm하고 1.5 mm의 꼬리와 bregma하는 측면 1mm를 중심으로. </li><li> 작은 오프닝이 두개골을 통해 만들어진 때까지 뼈를 벗겨 계속. 포셉 CA의 쌍N 떨어져 두개골의 뼈 떼어 리프트. </li><li> 두라는 microprism가 피질에 삽입하기 전에 삭제해야합니다. 출혈이 가장 피가 몇 분 동안 표면에 응고시키는에 의해 제어됩니다. 그 후, coagulated 혈액은 microprism를 삽입하기 전에 수술 스폰지를 사용하여 제거됩니다. </li><li> 피질과 프리즘의 정렬을 지원하기 위해, microprism의 수직 얼굴 포셉의 처리에 평행하게 줄지어있다. </li><li> 프리즘의 상단이 neocortical 표면 플러시 때까지 제대로 개최 프리즘으로 전체 microprism가 삽입됩니다. </li><li> 제대로 삽입되면, microprism는 적절한 위치에 유지됩니다. 그 결과 모든 출혈이 최소화되고 작은 수술 스펀지로 흡수 수 있습니다. 프리즘은 장소에 일단 동물 이미징을위한 준비가 된 것입니다. </li><li> microprism가 동물에 사용되고 나면, 그것은 여러 번 다시 사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 제대로 남아있는 생물 학적 물질을 제거하는 청소해야 없습니다. 이것은 메탄올에 물놀이 다음 HCL 산의 작은 볼륨으로 프리즘 디핑하여 수행할 수 있습니다. 청소 microprism 그런 다음 나중에 사용하기 전까지는 렌즈 종이에 싸서 수 있습니다. </li></ol> 파트 3 : 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : 오른쪽 앵글 microprism 이미지. 본 실험에 사용되는 프리즘은 여기 및 방출 빛의 내부 반사를 허용하도록 hypotenuse에 고급 실버 코팅 한 mm, BK7 유리 프리즘입니다. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 : 레이어 V YFP 피라미드의 뉴런 이미지. 대뇌 피질의 표면에서 깊이 900 μm의 - microprism과 함께 다양한 현장의 뷰 영상은 피라미드 세포 기관 ~ 800의 큰 인구를 보여줍니다. 또한, 계층으로까지 확대 혀끝의 dendrites는 I도 해결할 수 있습니다. 스케일 바 = 200 μm의. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3 : microprism 공간적 해상도 레이어 V 피라미드의 뉴런에 혀끝의 dendrites에 돌기 쪽이를 해결하는 데 충분한 제공과 함께 사용 높은 수치 조리개 목적. 스케일 바 = 10 μm의. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4 : microprism와 형광 염료의 꼬리 - 정맥 주사를 사용하여 얻은 이미지. 이미지가 대뇌 피질을 통해 볼륨에서 분기 깊은 두뇌 지역 및 작은 모세 혈관의 확장 수직, 구경이 큰 선박을 보여줍니다. 스케일 바 = 200 μm의. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5 : 높은 수치 조리개 목표를 사용하여 네크로 텍스의 모세 혈관의 네트워크는보다 세부 군데하실 수 있습니다. 스케일 바 = 50 μm의. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig6.jpg" alt="그림 6" /> 그림 6 : 마이크로는 또한 혈관을 통해 흐르는 영상 붉은 혈액 세포 (RBCs)에 있습니다. RBCs은 형광 염료를 흡수하지 않으며 따라서 선박에 걸쳐 어두운 줄무늬로 볼 수 있습니다. 그릇에 걸쳐 라인 스캔하여, 하나는 RBC 유량 및 속도의 측정을 얻을 수 있습니다. 스케일 바 = 10 μm의 (상단 및 하단 이미지 가로 막대) 250 MS (아래 이미지에 수직 막대).

<ol>
	<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).</li></ol>

동물 실험은 예일 대학의 IACUC에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

이미징 실험에서 microprism를 사용하면 비교적 간단하고 네크로 텍스의 생체내 연구에 많은 장점을 제공합니다. 이 기술을 사용하는 대표적인 예는 레이어 V 피질 뉴런에 노란색 형광 단백질을 표현하는 유전자 변형 생쥐에서 찍힌 사진을 포함합니다. 마이크로 사용하여 하나는 레이어 V 대형 피라미드 세포 기관의 집합, 대뇌 피질의 표면 아래 약 1mm를 볼 수 있습니다. 또한 플로팅 (그림 2)에 divergi...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>With enhanced silver reflective coating-(R77)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)</td>
<td>055-0010</td>
<td>With enhanced silver reflective coating-(R77)</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescein-dextran</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>FD70</td>
<td>70 kDa </td>
</tr>
<tr>
<td>0.28 NA, 4x air objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>XLFLUOR 4x/340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.60 NA, 40x air objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>LUCPLFLN</td>
<td>With 0-2 mm coverglass correction</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo imaging of deep cortical layers using a microprism

우리는 microprism 모양의 깊은 두뇌 이미징 프로브를 사용하여 대뇌 피질의 조직의 생체내 이미징에 대한 프로토콜을 제시한다. 마이크로의 크기는 1 mm이며, 여기 및 방출 빛의 내부 반사를 허용하도록 hypotenuse에 반사 코팅 있습니다. 관점 microprism 프로브가 동시에 이미지를 여러 피질 층은 일반적으로 전용 슬라이스 준비 모습. 이미지가 크고 회수 필드 -보기 (~ 900 μm의). 또한, 우리는 아닌 생존 수술에 대한 자세한 내용 및 현미경 설정을 제공합니다. 대표 결과는 표면 피질 층을 통해 확장하고 플로팅에 걸쳐 자신의 혀끝의 dendrites를 보여주는 뜻이 - 1 YFP - H 마우스에서 레이어 V 피라미드의 뉴런의 이미지가 포함되어 있습니다. 해상도 계층 V의 뉴런의 소마 근처 이미지 돌기의 쪽이하기에 충분했다. 형광 염료의 꼬리 - 정맥 주입은 피질의 혈관의 복잡한 네트워크를 보여줍니다. 모세 혈관을 통해 흐르는 적혈구 (RBCs)의 라인 스캔은 RBC 속도 및 유량 속도를 얻을 수를 보여줍니다. 이 소설 microprism 프로브 깊은 세포 구조와 생체내에서 대뇌 피질의 기능을 시각화의 우아한 아직 강력한 새로운 방법입니다.

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In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

마우스를 네크로 텍스에 삽입 마우스 오른쪽 단추로 각도 마이크로 일반적으로 통에 발견 관점 여러 피질 레이어의 깊은 화상을 허용합니다. 원 - mm 마이크로는 다양한 현장의 전망 (~ 900 μm의)와 돌기 쪽이를 해결하기 위해 충분한 공간 해상도를 제공합니다. 우리는 계층 V의 연결 이미지와 마이크로를 사용하여 neocortical 혈관 영상을 보여줍니다.

Microprism를 사용하여 딥 두피 레이어의 생체내 이미징에서

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

11.2K 조회수.  Yale University. 마우스를 네크로 텍스에 삽입 마우스 오른쪽 단추로 각도 마이크로 일반적으로 통에 발견 관점 여러 피질 레이어의 깊은 화상을 허용합니다. 원 - mm 마이크로는 다양한 현장의 전망 (~ 900 μm의)와 돌기 쪽이를 해결하기 위해 충분한 공간 해상도를 제공합니다. 우리는 계층 V의 연결 이미지와 마이크로를 사용하여 neocortical 혈관 영상을 보여줍니다.

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Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Dissociated 마우스 두피 신경 세포 배양의 준비

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

연구

생물학

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium indicator dyes, which are BAPTA-based organic molecules that change their spectral properties in response to the binding of Ca2+ ions. Calcium indicator dyes fall into two categories, ratio-metric dyes like Fura-2 and Indo-1 and single-wavelength dyes like Fluo-4. Ratio-metric dyes change either their excitation or their emission spectra in response to calcium, allowing the concentration of intracellular calcium to be determined from the ratio of fluorescence emission or excitation at distinct wavelengths.  The main advantage of using ratio-metric dyes over single wavelength probes is that the ratio signal is independent of the dye concentration, illumination intensity, and optical path length allowing the concentration of intracellular calcium to be determined independently of these artifacts. One of the most common calcium indicators is Fura-2, which has an emission peak at 505 nM and changes its excitation peak from 340 nm to 380 nm in response to calcium binding.  Here we describe the use of Fura-2 to measure intracellular calcium elevations in neurons and other excitable cells.

Calcium signals play a key role in many cellular processes including gene expression, survival and differentiation. Here we demonstrate how to perform calcium imaging using Fura-2 AM. Calcium imaging is a valuable tool to study the regulation of intracellular calcium in real time and its regulation of signaling cascades.

Fura - 2 오전 사용하여 두피 뉴런의 칼슘 이미징

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광 생물

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

Drosophila의 배아들 중에서 - 생체내의 원심 분리

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

유전자 규정의 단일 분자 이미징<em&gt; 생체에</em&gt; 절단하여 Cotranslational 인증 (CoTrAC)를 사용

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...