Biz Dr teşekkür ederim. Yuh-Nung Jan ve Wes Grueber Bu çalışmada kullanılan uçucu stokları sağlamak için. Yazarlar Thomas F. ve bu araştırma desteği için Kate Miller Jeffress Memorial Trust (DNC) ve George Mason Üniversitesi Provost Ofisi (EPRI) kabul etmiş sayılırsınız.

Drosophila Periferik Nöronlar Manyetik Boncuk Sıralama Genel Yorumlar (Protokol tamamlanması için toplam Zamanlama: 2.5-3 saat) Temiz, RNAse ortamda sürdürülmesi için standart laboratuvar prosedürleri RNA bozulmasını önlemek için her zaman dikkat edilmelidir. Drosophila larva manikür disseke ve hücre disosiasyon tampon yerleştirilir, periferik nöronlar manikür ayırmak için son hücreleri biri. Biz bu özelliği, sömürülen ve bu protokol da izole nöronların önce yağ, kas ve manikür non-spesifik hücrelerin en kaldırmak için tasarlanmış. Uygulama ile, yaklaşık 2,5 saat içinde tüm protokolü başarıyla tamamlanmış olabilir. Antikor kaplı boncuklar hazırlanması, deney başlamadan önce tamamlanması gerekir. 1. Cilt Hücreler Manyetik Boncuk Hazırlanması: Bu adım, deney başlamadan önce tamamlanması gerekir. Hazırlanan boncuk gerekli ° C kadar 4 hazırlanan ve saklanan olabilir. <ol><li> 500 ul taze PBS resuspending ve güçlü bir manyetik alan her zaman bu peletleme 100 ul Dynabeads M-280 Streptavidin kaplı boncuklar PBS içinde üç kez yıkayın. </li><li> Sonunda sulandırılmamış biotinlenmiş sıçan anti-fare-CD8a antikor (antikor konsantrasyonu 100 mg / ml) 100 ul doğrudan boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Sedimantasyon önlemek için zaman zaman hafif bir vorteks ile buz karışımı 1 saat inkübe edin. [Dynabeads M-280 1 ul 0,05-0,10 mg biotinlenmiş antikor bağlayabilirsiniz. </li><li> Boncuk-antikor karışımı fazla antikor kaldırmak için adım 1.1 &#39;de açıklanan üç kez yıkayın. Manyetik boncuk şimdi antikor ile kaplı ve kullanıma hazır. 4 1X PBS 100 ul boncuk-antikor karışımı Mağaza ° C kullanana kadar. </li></ol> 2. (10-15 dakika): Larva Seçme ve Yıkama <ol><li> Pick 30-50 yaşı uyumlu üçüncü instar larvaları ve 1X Fosfat 1-1,2 ml 1.6 ml mikrofuge&#39;de tüp koyun Tamponlu Salin (PBS). (3-5 dakika) </li><li> Her 1 saniye ve maksimum ayarda vorteks üç kez tüp kapatın. </li><li> Bir yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak süpernatantı tamamen atın. (2.1) yıkama ve süpernatant gözle görülür herhangi bir gıda parçacıkları ve enkaz netleşene kadar vorteks (2.2) 3-4 kez adımları tekrarlayın. </li><li> Kısaca, 1 ml% 70 etanol ile yıkayın tekrarlayın ve supernatant atın. </li><li> Larvaların 1 ml ddH2O ile iki kez yıkayın ve supernatant atın. </li><li> Kısaca RNaz-away 1 ml yıkama ile bir kez daha tekrarlayın ve supernatant atın. </li><li> DdH2O 1 ml larva RNaz-away tümüyle kaldırılmasını sağlamak için üç kez yıkayın. </li></ol> 3. Diseksiyon: (10-12 dakika) <ol><li> Sylgard kaplı 35mm Petri plaka merkezinde yerleştirin larvaları 10-12. Onları birbirinden biraz uzakta yerleştirin. [Kritik Adım: Herhangi bir larva atın uygun gelişimsel aşamada görünmüyor] </li><li> Tüm larvalar için bir çift ince diseksiyon makas kullanarak larvalarının ön ucu kesilerek açılır. </li><li> Donuk Dumont No: 5 forseps invert larvaları iç-dış bir çift kullanma. Larva manikür içinde arka sonuna kadar tüm yol, bir forsepsle yerleştirin. Kütikül (Şekil 1a) (Sylgard yüzeyi kütikül kolaylaştırmak için aşağı doğru bastırarak deneyin) arka sonuna kapmak için forseps ipuçlarını bir araya Pinch. Forseps ikinci çifti kullanarak, larva manikür içeriden dışarı doğru itin. [Kritik Adım: hücre izolasyonu deney başlamadan önce bu yöntemi bir kaç kez pratik deneyin. Tüm yumuşak dokular için çözüm kolay disosiasyon maruz kaldığı sağlamak için tamamen ters larva elde etmeye çalışın.] </li><li> 3-4 larva diseksiyon sonra taze, buz gibi soğuk PBS (buz tüpü), 1.6 ml mikrofuge&#39;de tüp hemen aktarabilirsiniz. </li><li> Gerekli tüm larvaları toplanana kadar (bu protokolde 30-40 larvaları), 3.1 ve 3.4 için gerekli adımları tekrarlayın. [Kritik Adım:% 10-20 diseksiyon ve çözülmesi sırasında kaybı ve planı buna göre önceden kestirin.] </li></ol> 4. Gevşek yapışık non-spesifik hücreler Temizleme: (2-3 dakika) [Bu adım gibi yağ organları ve merkezi sinir sistemi gibi gevşek yapışık non-spesifik dokuların temizleyerek yardımcı olur.] <ol><li> Ters larva tırnak etlerini içeren 1.6 ml mikrofuge&#39;de tüpü alın ve taze buz PBS yaklaşık 700-800 ul süpernatantı değiştirin. </li><li> Pulse-girdap mikrofuge&#39;de tüp tam hızda 5 kez (puls başına 3 saniye). </li><li> Süpernatantı atın ve yaklaşık 700-800 ul taze, buz gibi soğuk PBS ile değiştirin. </li><li> Adımları 4.2 ve 4.3 &#39;üç kez tekrarlayın. </li><li> Restaze, buz gibi soğuk PBS 400 ul larva tırnak etlerini uspend </li></ol> 5. Tek bir hücre süspansiyonu doku Dissociating: (18-20 dakika) [Kritik Adım: Aşırı disosiasyon kötü hücre verim ve düşük hücre canlılığı yol açan hücre yüzey belirteci kaybına neden olabilir. Larva doku ya mekanik disosiasyon (sonikasyon douncing), enzimatik disosiasyon (tripsin, kollajenaz, vb.) Ya da her ikisinin kombinasyonu ile ayrılamaz. Bu larva dokuları ayırmak zor olduğu için, hem mekanik hem de enzimatik disosiasyon bir kombinasyonu en iyi sonuçları vermiştir bulundu.] <ol><li> PBS 400 ul askıya larva manikür 1X Liberase Blendzyme 3 (28 W nsch ünite / flakon) 1.5 ul ekleyin. </li><li> Maksimum ayarı (Bu çözüm manikür gevşek yapışık hücrelere kaldırmanız gerekir), her 1 saniye vorteksleyin çözüm 2-3 kez. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (22-25 ° C) çözüm inkübe edin. [Kritik Adım: İnkübasyon süresi son hücre sıralama verimliliği büyük ölçüde etkiler . Önerilen inkübasyon süresi doku gevşetme için yeterli olmalıdır. 15 dakika aşmayın.] </li><li> Pulse-vorteks tüp 20-30 kez tam hızda puls başına 2 saniye için maksimum ayarları. Bu çözüm içine kas ve diğer doku bültenleri. Küçük bir örnek, her adımda bir floresan stereo-mikroskop altında çözüm olmadığını kontrol edin. (Tecrübesi ile, bir mikrofuge&#39;de tüp floresan etkin bir stereo mikroskop altında doğrudan gözlemleyerek ayrışma düzeyini belirlemek mümkün olmalıdır) </li><li> Taze, buz gibi soğuk PBS ile larva, tırnak etlerini 2-3 kez yıkayın ve nihayet taze, buz gibi soğuk PBS içeren% 1 BSA 500 ul onları tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Larva manikür, 2 ml Kontes doku değirmeni ve büyük mesafe havaneli, ön kat doku değirmeni ve PBS solüsyonunda% 1 BSA BSA çözüm atmak durulama kısa bir sonra havaneli cam yüzeyine yapışmasını önlemek için. Daha sonra, bir yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak, BSA ile kaplanmış doku değirmeni adım 5.5 &#39;ten tırnak etlerini aktarmak. [Kritik Adım: Pre-cool, hücre hasarı / lizis önlemek için birkaç dakika buz koyarak doku taşlama / havaneli] . </li><li> Köpüklenmemesine (yaklaşık 20-30 vuruş) kaçınarak, yavaş ve istikrarlı bir vuruş ile doku Dounce. [Kritik Adım: Dounce, yavaş yavaş ve sürekli aksi takdirde olmuş akyuvarlar] </li><li> Hücre disosiasyon düzeylerini değerlendirmek için, temiz bir Kimwipe doku doku değirmeni dış duvar silin ve floresan stereo-mikroskop altında inceleyin. Nöronlar manikür müstakil olması gerekir ve çözüm görülebilir. Bu zor olduğu tespit edilirse, alternatif çözüm küçük bir örnek pipet, ve floresan stereo-mikroskop altında gözlemlemek. Hücre disosiasyon iyi bir göstergesi larva manikür nöronların yokluğunda. Biri hala manikür bağlı nöron gözlemler ya da eksik ayrışmış hücreleri gözlemler hücreleri tek bir hücre süspansiyonu elde kadar Ancak, daha Dounce. </li><li> 5 kez yangın cilalı Pasteur pipeti ile çözüm Karışım bir yangın cilalanmış Pasteur pipeti ile 10 kez standart ucu çapı yaklaşık% 25 daralmış, standart ucu çapı yaklaşık% 50 daralmış. [Kritik Adım: Forceful öğütme hücrelere zarar verebilir. Adımlar arasındaki hücreleri Monitör, prosedür ve buna göre ayarlamak]. </li><li> 30 mikron hücre filtresi aracılığıyla çözüm Filtre ve 1.6 ml mikrofuge&#39;de tüp hücre süzüntü toplamak. Ortaya çıkan çözüm, tek bir hücre süspansiyonu oluşur ve manyetik hücre sıralama için hazır olmalıdır. </li></ol> 6. Boncuk Manyetik Hücre Sıralama: (45 - 75 dakika, antikor kuluçka süresi bağımlı) <ol><li> Antikor kaplı manyetik bilye 15 ul ul hücre süspansiyonu 500 (adım 5.10) ekleyin. Kalan antikor konjuge manyetik boncuk sonraki hücre izolasyonların için gerekli kadar saklanabilir. </li><li> 30-60 dakika buz üzerinde zaman zaman el-karıştırma hücrelerin antikor kaplı manyetik bilye ile inkübe edin. [Kritik Adım: Kuluçka daha yüksek bir sıcaklık veya daha uzun süre non-spesifik antikor bağlanma neden olabilir.] </li><li> 2 dakika boyunca güçlü bir manyetik alan mikrofuge&#39;de tüp yerleştirin. Bağlanmamış boncuklar ile birlikte tüm olumlu seçili hücrelerin tüp tarafında ayrı olacaktır. </li><li> Yavaş yavaş, hücre pelletini rahatsız değil emin olun, süpernatantı pipetle. </li><li> Taze, buz gibi soğuk PBS hücrelerin kalan non-spesifik hücreleri çıkarmak için 3-4 kez yıkayın. </li><li> Taze, buz gibi soğuk PBS 30 ul hücrelerin yeniden süspanse edin. </li><li> Yaklaşık saflık ve hücre verim için, hücre süspansiyon 5 ul pipetcilalı yüzey üzerinde bir hemasitometre ension ve floresan stereo-mikroskop altında görünür floresan hücreleri saymak. Ayrıca floresan olmayan hücreleri ve kirleri herhangi bir işaret miktarını kontrol. Tipik bir örnek son derece floresan hücreler için zenginleştirilmiş olacaktır. </li></ol> 7. Manyetik Boncuk sıralama Hücreler RNA İzolasyonu: (60 - 75 dakika) <ol><li> Sonra, bir manyetik alan, pelet hücreleri sayma süpernatantı atmak ve ekstraksiyon tamponu 20 ul PicoPure ™ RNA İzolasyon Kiti (Moleküler Cihazlar) ekleyin. Hücre sayısı bağlı olarak bir ekstraksiyon tamponu daha yüksek bir hacim eklemek gerekebilir. </li><li> Vorteks tüp maksimum hızda ekstraksiyon tamponu ile hücre pelletini karıştırma sağlamak için. </li><li> Tüp 42 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. </li><li> RNA sütun arıtma (bkz: adım 7.5) önce manyetik boncuk kaldırılmasını sağlamak için, tüp kısaca pelet için 2 dakika manyetik boncuklar için 2.000 (x) g santrifüj edilir. Sonra pelet korumak için güçlü bir manyetik alan tüp yerleştirilir ve süpernatant, yeni bir mikrofuge&#39;de tüpe aktarılır. </li><li> Özü ve sütun PicoPure RNA ekstraksiyon kiti üreticinin talimatlarına göre RNA arındırmak. DNAz tedavi isteğe bağlıdır ve analiz ihtiyacına göre RNA saflaştırılması sırasında sütun üzerinde yapılabilir. Son olarak, kullanıma hazır olana kadar küçük bir hacim -80 elüsyon tampon ve mağaza ° C (11-30 ul) bağlı toplam RNA elute. İsterseniz 1 ul kısım bir Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.) Total RNA kalitesini değerlendirmek için kullanılan olabilir. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Manyetik boncuk sıralama Drosophila da nöronların (Şekil 1) izole etmek için kullanılır oldu. Bu da izole nöronların (Şekil 2a) arınmış RNA bir Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) Analiz edildiğinde keskin 5.8S, 18S ve 28S ribozomal RNA doruklarına varlığını gösterdiği gibi mükemmel kalitede olduğu tespit edilmiştir ( Şekil 2b). 30-40 üçüncü instar larvaları ile başlayarak kullanarak ortalama PPK GAL4 sürücüsünü kullanarak 300-500 sınıf IV da nöron ve 1500-2000 da nöronların (Sınıf I, II, III ve IV) izole yeteneğine sahip pan - da nöron spesifik GAL4 21-7 sürücü. Izole hücrelerinin nöronal özel zenginleştirme değerlendirmek için iki nöronal gen-spesifik belirteçler (elav ve futsch) kullanarak kantitatif ters transkripsiyon PCR (QRT PCR) uyguladık. Bu analizler protokolü (Şekil 3) kullanılarak akış ile karşılaştırıldığında da nöronlar için son derece özel bir zenginleştirme gösteren işaretleyici genler hem de önemli bir kat zenginleşme ortaya çıkardı. Son olarak, pan-da nöron ve sınıf IV da nöronların izole RNA transkripsiyonel ifade profil Agilent Drosophila melanogaster tüm genom oligo mikroarray&#39;ler (4 x 44K) (Şekil 4) gerçekleştirmek için kullanılır oldu. Bu analizleri önceden uncharacterized molekülleri ve potansiyel olarak da nöron gelişiminde önemli işlevsel roller oynar varsayılan sinyal iletim yolları geniş bir yelpazenin yanı sıra çok sayıda da nöron dendrit morfolojilerinden önceden karıştığı düzenleyiciler belirledi. Daha önce uncharacterized bu moleküllerin potansiyel rolü (lar) da nöron gelişimi ve özellikle dendrit morfolojilerinden arabuluculuk değerlendirmek için tasarlanmış çalışmalar, halen devam etmektedir. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure1tmb.jpg" border="0" /> Şekil 1: da nöron spesifik GAL4 taşıyan Drosophila da nöronların manyetik boncuk sıralama şematik (a) Yaş uyumlu üçüncü instar larvaları, UAS-mCD8-GFP muhabiri transgen tersine larva manikür, iç-dış açığa çıkarmak için disseke disosiasyon tampon PNS ve buz gibi soğuk PBS içinde saklanır. (b) Enzimatik ayrılma larva manikür içeren çözüm Liberase Blendzyme 3 ekleyerek gerçekleştirilir (c) larva dokular vorteks, öğütme bir kombinasyonu ile daha ayrışmış ve douncing gibi yağ organları, bağırsak ve MSS (d, e) hücreler daha sonra 30 mikron hücre filtresi süzülür non-spesifik etiketli dokuların kaldırmak için. Çözüm epitel, kas ve nöronlar da dahil olmak üzere farklı hücre tipleri, tek bir hücre süspansiyonu içerir. (F) Anti-fare CD8a-antikor kaplı Dynabeads M-280 hücre süspansiyonu eklenir ve 30-60 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. ( g) Manyetik boncuklar da nöronların bir fare CD8 tagged GFP füzyon proteini (h, i) güçlü bir manyetik alan çözüm koyarak manyetik boncuk kaplı hücreler ayrılır ifade bağlanır. Süpernatant atılır ve hücreleri (j) h, herhangi bir kalıntı non-spesifik hücreleri çıkarmak için üç defa yıkanır.ighly da nöron toplulukları saflaştırılmış. Lütfen Şekil 1&#39;de bir büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure1.jpg">buraya tıklayınız</a> . <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure2tmb.jpg" border="0" /> Şekil 2: (a) olumlu seçilen hücre disosiasyon ve manyetik boncuk sıralama ile izole GFP floresan sınıf IV da nöronların Temsilcisi görüntü. Nöronların çıkan nüfusu oldukça az ya da hiç kirlenmesine neden olan hücre kirleri sınıf IV da nöronlar için zenginleştirilmiş olarak tespit edilmiştir. (B) manyetik boncuk sıralaması da nöronların izole edilen total RNA bir Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) Elektroferogram 5.8S, 18S, ve 28S rRNA varlığı ile mükemmel bir total RNA kalitesini gösteriyor. Lütfen Şekil 2&#39;de büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure2.jpg">buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure3.jpg" border="0" /> Şekil 3: izole da nöronların (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) ve akış yoluyla fraksiyonu üç nüsha olarak yapıldı nöronal belirteç gen ekspresyonu QRT-PCR analizi. Iki nöron-spesifik bir işaretleyici genler (elav ve futsch) ekspresyon düzeyleri QRT-PCR ile değerlendirildi. Bu analizlerden elde edilen değerler endojen kontrol (rp49) normalize edildi ve fraksiyonu akış gözlenen göreli seviyeleri ΔΔCτ yöntemi 6 kullanılarak hesaplandı. Hem elav ve futsch fraksiyonu yoluyla akışı ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde izole da nöron nüfus zenginleştirildi. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure4tmb.jpg" border="0" /> Şekil 4: mikroarray etiketli görüntü dosyası Temsilcisi sınıf IV da nöron spesifik Cy3. Burada gösterilen manyetik boncuk sıralayarak arındırılmış sınıf-IV da nöronların izole Cy3-labeld toplam RNA ile melezleşmiştir bir Agilent Drosophila melanogaster tüm genom oligo mikroarray (4 x 44K). Lütfen Şekil 4 büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure4.jpg">buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+methods.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

Burada sunulan protokol, bir manyetik boncuk hücre sıralama stratejisi kullanarak Drosophila üçüncü instar larva manikür iç yüzeyine sıkıca yapışır periferik nöronların izolasyon ve saflaştırılması için optimize edilmiştir. Bu protokolün Drosophila da nöronların, uygulamalar, özellikle larva veya pupa aşamalarında gelişme manikür bağlı diğer hücre türleri izolasyon izole etmek için bu protokolü kullanılır olsa da (örneğin epitel, kas, diğer çevre nöronlar) tarafından adapte e...

Ekipman <ul><li> (10) alternatif ™ -2 DynaMag Neodimyum blok mıknatıslar (K &amp; J Manyetik, Inc, Kedi # B444B), (Invitrogen, Kedi # 123-21D) kullanılıyor olabilir. </li><li> Kontes büyük bir boşluk havaneli Cam Doku Öğütücü, 2 ml çalışma kapasitesi, (Kat. # 885.300-0002) </li><li> Hücre filtreler, örneğin MACS Ön-Ayırma Filtre (Miltenyi Biotec, Kedi # 130-041-407) </li><li> 35 mm petri-yemekleri Sylgard (Dow Corning Corporation, Kedi # 3.097.358-1004) ile kaplı </li><li> Diseksiyon araçları: Dumont No 5 forseps iki çift (Güzel Bilim Araçlar, Kedi # 11.251-20.) </li><li> Vannas bahar mikro diseksiyon makas (Güzel Bilimi Araçları, Kedi # 15.000-08) </li><li> Tek ipuçları Pipetler (P-1000, P-100, P-10) </li><li> Standart hemasitometre hücreleri saymak ve tahmini saflık </li><li> Standart çap yangın parlak ipuçları Pasteur pipetler, standart çap ~% 50 daralmış ve öğütme için standart çap ~% 25 daraldı </li><li> Masa üstü mikro santrifüj (1-16,000 (x) g) </li><li> Girdap </li><li> Floresan stereo-mikroskop (Leica MZ16FA bu protokolü kullanılmıştır) </li></ul>

isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting

<em&gt; Drosophila</em&gt; Periferik sinir sistemi (PNS), fonksiyonel ve moleküler düzeyde nöronal gelişim ve dendrit morfolojilerinden karmaşık süreçleri araştırmak için güçlü bir model. Bu analizlerde yardımcı olmak için, dendritik arborization (da) dendrit morfolojilerinden çalışmak için yaygın olarak kullanılan nöron adı verilen bir alt sınıfıdır PNS nöronların izolasyonu için bir strateji geliştirmiştir<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Bu nöronlar sert chitinous larva manikür altında konuma ulaşmak için çok zor saf bir nüfus olarak izole etmek için son derece düşük bir olay nedeniyle zor ve. Yeni geliştirilen yöntem, bu zorlukları aşar ve antikor kaplı manyetik boncuklar kullanarak hızlı ve belirli bir hücre zenginleştirme dayanmaktadır. Manyetik boncuk sıralama çalışmaları için, bir fare CD8 etiketli GFP füzyon proteini (ifade yaş eşleştirilmiş üçüncü instar larvaları kullanmış<em&gt; UAS-mCD8-GFP</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Sınıfı IV dendritik arborization ya kontrol altında nöron spesifik (da)<em&gt; Pickpocket (PPK)-GAL4</em&gt; Driver<sup&gt; 4</sup&gt; Ya da pan-da nöron-spesifik GAL4 kontrolü<sup&gt; 21-7</sup&gt; Driver<sup&gt; 5</sup&gt;. Bu protokol, birkaç parametre değişen, larva manikür iç duvara bağlı PNS hücreleri izole etmek için optimize edilmiş olsa da, aynı protokolü larva veya pupa aşamasında manikür bağlı birçok farklı hücre türleri izole etmek için kullanılır. geliştirme (örneğin epitel, kas, oenocytes vb), veya GAL4 özel sürücü ifade desen bağlı olarak larva organların diğer hücre türleri. Bu yöntem ile izole RNA yüksek kalitede ve kolayca mikroarray gen ekspresyon profili çalışmaları gibi downstream genomik analizler için kullanılabilir. Bu yaklaşım, izole çalışmaları gerçekleştirmek için yeni ve güçlü bir araç sunar<em&gt; Drosophila</emBöylece dendrit morfolojilerinden altında yatan moleküler mekanizmaları, yeni bakış açıları sunan dendritik arborization (da) nöronlar.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting at JoVE.com

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Bu video makalede, izolasyonu ve saflaştırılması için bir yöntem mevcut<em&gt; Drosophila</em&gt; Hızlı bir manyetik boncuk destekli hücre sıralama stratejisi kullanarak periferik nöronlar. Izole hücrelerinden elde edilen RNA kolayca mikroarray analizleri de dahil olmak üzere alt uygulamalar için kullanılabilir.

İzolasyon ve Arıtma Drosophila</emManyetik Boncuk Sıralama> Periferik Nöronlar

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

isolation-purification-drosophila-peripheral-neurons-magnetic-bead

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

13.3K Görüntüleme.  George Mason University. Bu video makalede, izolasyonu ve saflaştırılması için bir yöntem mevcut Drosophila Hızlı bir manyetik boncuk destekli hücre sıralama stratejisi kullanarak periferik nöronlar. Izole hücrelerinden elde edilen RNA kolayca mikroarray analizleri de dahil olmak üzere alt uygulamalar için kullanılabilir.

Video: Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biyoloji

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

İzolasyonu Drosophila melanogaster Testisler

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their prominent presence is often associated with poor prognosis1,2. CAFs are an activated subpopulation of stromal fibroblasts, many of which express the myofibroblast marker &alpha;-SMA3. CAFs originate from local tissue fibroblasts as well as from bone marrow-derived cells recruited into the developing tumor and adopt a CAF phenotype under the influence of the tumor microenvironment4. CAFs were shown to facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes tumor cell proliferation, angiogenesis, and invasion5-8. We demonstrated that CAFs enhance tumor growth by mediating tumor-promoting inflammation, starting at the earliest pre-neoplastic stages9. Despite increasing evidence of the key role CAFs play in facilitating tumor growth, studying CAFs has been an on-going challenge due to the lack of CAF-specific markers and the vast heterogeneity of these cells, with many subtypes co-existing in the tumor microenvironment10. Moreover, studying fibroblasts in vitro is hindered by the fact that their gene expression profile is often altered in tissue culture11,12 . To address this problem and to allow unbiased gene expression profiling of fibroblasts from fresh mouse and human tissues, we developed a method based on previous protocols for Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)13,14. Our approach relies on utilizing PDGFR&alpha; as a surface marker to isolate fibroblasts from fresh mouse and human tissue. PDGFR&alpha; is abundantly expressed by both normal fibroblasts and CAFs9,15 . This method allows isolation of pure populations of normal fibroblasts and CAFs, including, but not restricted to &alpha;-SMA+ activated myofibroblasts. Isolated fibroblasts can then be used for characterization and comparison of the evolution of gene expression that occurs in CAFs during tumorigenesis. Indeed, we and others reported expression profiling of fibroblasts isolated by cell sorting16. This protocol was successfully performed to isolate and profile highly enriched populations of fibroblasts from skin, mammary, pancreas and lung tissues. Moreover, our method also allows culturing of sorted cells, in order to perform functional experiments and to avoid contamination by tumor cells, which is often a big obstacle when trying to culture CAFs.

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes proliferation, angiogenesis, and inflammation. Here we describe a method to isolate pure populations of normal fibroblasts and CAFs from fresh mouse and human tissues by cell sorting, using PDGFR&#x03B1; as a surface marker.

Floresans Aktif Hücre Ayırma (FACS) Taze Dokular Normal ve Kanser ilişkili Fibroblastlar İzolasyonu

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Transkript ve Metabolitler gelen saflaştırılması<em&gt; Drosophila</em&gt; Kafaları

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Protein-protein etkileşimi belirlenmesi<em&gt; Drosophila</emTandem Affinity Arıtma tarafından&gt; Adult Başlar (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Skleraktin Hücre Popülasyonlarının İzolasyoniçin Floresan-Aktive Hücre Sıralaması

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

İzolasyon ve Arıtma Drosophila Periferik Nöronlar