Yazarlar Demêmes Danielle ve Douglas Cotanche teşekkür etmek ve bize Corti organı izolasyonu için öğretim yöntemleri çabaları için. Sherry Lin video animasyon onu katkıda sanat için; ve Matthew Chana Jason Meeker ve Kendra Marshall (Ayrıca, Elektroporatör elektrotlar mühendislik Stefanov-Wagner İsmail&#39;in teşekkür etmek istiyorum <a href="http://www.goodfightproductions.com">www.goodfightproductions.com</a> ) video üretimi için. Bu çalışma NIDCD hibeler (İşitme Araştırma P30DC05209-MEEI Çekirdek Desteği; RO1DC007174-Kenar R03DC010065-Parker) tarafından finanse edildi.

1. Gün. Sterilizasyon ve cam lamelleri kaplama. <ol><li> Cam mikroskop lamelleri otoklavda sterilize kurulayın. </li><li> Sterilize lamelleri önceden sterilize dört kuyu hücre kültürü çanak iki kuyu içine yerleştirin. </li><li> Coat 01:01 poli-L-ornitin ve laminin lamelleri 4 gecede% 20 fetal sığır serum (FBS) ° C ile desteklenmiş <ol class="lalpha"><li> 400 mcL poli-L-ornitin (4 saklanan% 0.01 çözüm ° C) </li><li> 400 mcL laminin (50 mikrogram / mL stok çözelti, -20 ° C&#39;de alikotları saklanan) </li><li> 200 mcL FBS (-20 ° C&#39;de alikotları saklanır) </li></ol></li><li> Isı-150 ° C inkübatör diseksiyon araçları gecede sterilize edin. </li><li> % 10 serum ve 10 mg / ml ampisilin içeren kültür ortamı olun. <ol class="lalpha"><li> 90 ml Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Orta </li><li> 5 ml FBS (-20 ° C&#39;de alikotları saklanan) </li><li> 5 ml at serumu (-20 ° C&#39;de alikotları saklanan) </li><li> 10 mcL ampisilin (4 saklanan 10 mg / ml stok solüsyonu ° C) </li></ol></li></ol> 2. Gün. Corti organı izolasyonu. <ol><li> Pozitif akış diseksiyonu kaput sterilize edin. <ol class="lalpha"><li> 20 dakika UV ışığı açmak </li><li> % 70 etanol ile tüm yüzeylerde püskürtme ve kullanmadan önce 5 dakika bekleyin. </li></ol></li><li> Işletim makas kullanarak foramen magnum dibinde yavru başını kesmek fare (P4). </li><li> Kısaca% 70 etanol içeren 10 cm çanak baş durulayın. </li><li> Epidermis bir neşter bıçak kullanarak çıkarın. </li><li> Bir neşter bıçak kullanarak sagital sütür boyunca kafatası açın ve sonra önbeyin iki eşit parçaya böler. Daha fazla diseksiyon için kaudal önbeyin saklayın. </li><li> Künt diseksiyon ile ön beyin, beyincik ve beyin sapı çıkarın. </li><li> Temporal kemikleri çıkarın (şekil 2A),% 70 etanol kısaca daldırma ve steril HBSS içeren 3 mm çanak aktarabilirsiniz. </li><li> Forseps kullanarak, temporal kemik petröz kısmı bül ve çevresindeki doku çıkarın. </li><li> Kabuklu şeklinde koklea (şekil 2B) bulun ve forseps kullanarak vestibüler sistem ayrı. </li><li> Gelişme bu aşamada, kemik labirent tamamen kalsifiye ve forseps kullanarak kolayca diseke edilir. Koklea bazal sonunda başlayan ve forseps kullanılarak apikal hareket dikkatli ayrılması ile kemik labirent çıkarın. </li><li> Spiral ligament ve Corti ekli organ modiolus (Şekil 2C) spiral boyunca kıvrılmış. Corti organı forseps kullanarak taban kanca bölgede spiral ligament ve apikal hareket olarak gevşemek dikkatlice çıkarın. </li><li> # 55 ince forseps (şekil 2B) kullanan Corti organı üssünde başlayarak, spiral ligament kaldırmak. Mikro-izolasyon, Corti duyu epitel (isteğe bağlı) organı . </li><li> Corti kanca bölgenin iki kullanarak temel organı çıkarın ½ cc İnsülin Şırınga ile kalıcı bağlı U-100 28G ½ forseps gibi iğneler. </li><li> Apeks başlayarak, iç saç hücrelerinin satır spiral limbus kaldırmak ve dorsalde devam (Şekil 2E-F). Corti eksplant organı Kaplama </li><li> Kültür kuyulardan poly-L-ornithine/laminin/FBS çözüm çıkarın ve 130 ul kültür ortamı ekleyin. </li><li> Corti organı disseke ve şark kültüründe kaplı cam lamel saç hücrelerinin silya işaret ediyor ki eksplant aktarın. </li><li> 200 mcL pipet kullanarak kültür orta çıkarın. Baziler membran kaplı cam lamel ile sürekli temas edinceye emin olun. </li><li> Corti organı, 200 ml&#39;lik pipet kullanarak dikkatlice kültür ortamı 130 mcL ekleyin. Corti organı yüzeye iki damla uygulayın ve sonra yavaş yavaş lamel tarafında kalan hacim kazandırmak. Corti organı lamel yapıştırılmış kalır kültür ortamı yüzer, ama yaptığı emin olun. </li><li> 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 &#39;nin varlığı bir gece inkübe edin. </li></ol> 3. Gün. Corti kültürlü organ haline muhabiri gen Elektroporasyon. <ol><li> Corti organı kültür kültür ortamı çıkarın. </li><li> 1 dakika için 130 mcL H 2 O ekleyin ve sonra 200 mcL pipet kullanarak kaldırın. </li><li> Plazmid DsRed muhabiri (-20 ° C&#39;de saklanan 2 mg / ml H 2 O) 30 mcL ekleyin. </li><li> Böylece bir micromanipulator kullanarak Elektroporatör elektrotlar Advance anot birnd katot kültürünün her iki tarafta. </li><li> Corti organı eksplant kültür içine muhabir gen electroporate bir darbe (27V, 30 ms süresi, 10 darbe trenleri) oluşturun. <ol class="lalpha"><li> İsteğe bağlı: modiolar ve eksplant spiral ligament her iki transgen elektroporasyon sağlamak için nabız kutuplarını ters. </li></ol></li><li> 5 dakika bekleyin. </li><li> DNA solüsyonu (3 2 parça DNA parçaları Fugene): Fugene 6 130 mcL ekleyin. Bu çözüm, bir laminer akış kaputu 3 ml&#39;lik bir yuvarlak alt polistiren test tüpü kullanarak elektroporasyon prosedürü start (20 adım) önce hazırlanmış olmalıdır. Bu çözüm yapmak için: <ol class="lalpha"><li> Opti-MEM (4 ° C&#39;de saklanan) 2.4 mcL test tüpüne ekleyin. </li><li> Fugene 6 reaktifin test tüpüne 0.6 mcL (4 ° C&#39;de saklanan) ekleyin. Opti-MEM Fugene doğrudan ve test tüpü iki ile doğrudan temas önlemek için emin olun. </li><li> 1 saniye vorteksleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> 2.0 mcL DsRed muhabiri plazmid çift iplikli DNA (100 mg DNA / ml H 2 O alikotları -20 ° C&#39;de saklanan) ekleyin. </li><li> 1 saniye vorteksleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. </li><li> Kültür ortamı 200 mcL ekleyin. </li><li> 1 saniye vorteksleyin. </li></ol></li><li> 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 &#39;gece inkübe edin. </li><li> 2 ml kültür ortamı kültürü de ekleyin ve 37 ° C de 10 gün öncesine kadar inkübe edin. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Biz perinatal bir fare Corti organı izolasyonu için bir yöntem mevcut. Bu prosedür, kemik labirent diseksiyonu hantal işlemek için yeterli kalsifiye olur ve bu noktada, postnatal günde yaklaşık 16 kadar embriyonik gün gibi genç fareler 6 için kullanılabilir. Corti organı disseke sonra, ya bütünüyle (Şekil 3) veya mikro-izole duyu epitel (Şekil 4) kaplama ve kültürlü olabilir. Biz daha Corti kültürlü organ ekzojen genlerin ifade etmek için bir teknik sunduk. Organotipik kültür Corti gen ekspresyonu RT-PCR veya in situ hibridizasyon, spiral ganglion hücrelerinin mikro-izole kullanarak veya eksojen kök hücreler ile Corti ko-kültür organ organ analizi gibi pek çok çalışma, diğer türleri için yararlıdır 3 veya saç hücre ölümü ve rejenerasyon in vitro analizi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig1tmb.jpg" alt="Şekil 1" border="0" /></a> Şekil 1. Corti P4 fare organ kesiti. (A) P4 fare elde cryosectioned koklea bazal kıvrımı bir kesit, bu protokolde tanımlanan fare kokleanın genel yapısını göstermektedir . Scala media yanal vascularis spiral ligament ve stria ile sınırlanmıştır Reissner s membran süperiora, spiral limbus mediale ve inferiora baziler membran. Kutusu B. genişletilmiş bölge (B) Corti organı baziler membran üst tarafında bulunan ve iç saç hücreleri, üç sıra dış saç hücrelerinin ve kendi destekleyen hücreleri tek bir satır içerir. Kesikli çizgi 1 Corti, bu organ diseksiyonu sırasında kaldırılır baziler membran boyunca yerini gösterir. Kesikli çizgi 2 mikro-izolasyon prosedürü sırasında kaldırılır baziler membran boyunca yerini gösterir. Yeşil immünohistokimyasal etiketleme, spiral limbus interdental hücreler, koklear saçlı hücreler, spiral ganglion nöronlar, spiral ligament ve 7 vascularis stria hücrelerinin yanı sıra etiketler Calbindin gösterir. Çekirdeğinin DAPI etiketleme mavi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig2tmb.jpg" alt="Şekil 2" border="0" /></a> Şekil 2. Corti diseksiyonu vurgulamak organ beraberindeki video Corti diseksiyonu Organ Görüntüleri A) izole temporal kemik (kırmızı) içinde bulunan koklea ve vestibüler sistem, B) koklea kemik labirent, C), spiral ligament ve ekli spiral ligament, kemik labirent, D çıkarılmasından sonra Corti organı) kaldırılması ve stria vascularis (kırmızı), E Corti organı) spiral limbus (kırmızı) duyu epitel mikro-izolasyon, ve F) izole spiral limbus (sol) ve duyu epitel (sağda). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig3tmb.jpg" alt="Şekil 3" border="0" /></a> Şekil 3. Corti eksplant Kültüre organın organ gösteren DIC görüntüCorti açıklandığı gibi beş gün için, izole, kaplama, ve kültürlü bir P4 Atoh1 nGFP fare. Bu fare yanlısı saç hücresi gen Atonal homolog 1 (Atoh1 aka Math1) ifade hücrelerin çekirdeğini 8 lokalize bir yeşil flüoresan protein sergi, böylece genetik olarak tasarlandı. Corti organları bu farelerden alınan tüm saç hücresi çekirdekleri bir nükleer GFP etiketi gösterirler ve bu nedenle duyu epitel epifluorescent bir mikroskop kullanılarak daha kolay görsellik için izin. Nispeten büyük sarmal limbus duyu epitel lateralinde görülebilir. Corti organı kaynaklı mezenkimal hücreler eksplant uzak geçirdim. Mavi nükleer etiket DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig4tmb.jpg" alt="Şekil 4" border="0" /></a> Şekil 4. Mikro-izole duyu epitel açıklanan ve bir gecede kültüre, Corti P4 fare organı izole edilmiştir duyu epitel elde Epifluorescent görüntü . Mikro-izole sonra% 4 paraformaldehid sabit ve koklear saçlı hücreler etiketler Miyozin 7a immunolabeling için işlendi. Şekil 3, nispeten daha büyük bir sarmal limbus olmadığına dikkat edin. Mavi nükleer etiket DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig5tmb.jpg" alt="Şekil 5" border="0" /></a> Şekil 5. Corti kültürlü organ haline DsRed muhabiri gen Elektroporasyon P4 Atoh1 nGFP fare yavrular Corti Tüm organlar izole edilmiştir, kaplama, ve sonra, epifluorescent bir mikroskop altında açıklanan ve daha sonra bakıldığında DsRed muhabiri gen ile electroporated. Transgenik DsRed muhabiri protein ifade Corti eksplant organ hücreleri duyu epitel sergi yeşil bir nükleer floresan kırmızı floresan ve endojen hücreler sergilerler. Transgenik hücrelerin spiral limbus ve duyusal epitel boyunca görülebilir.

<ol>
	<li>Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Development+of+the+Organ+of+Corti+in+Culture.">Organotypic Development of the Organ of Corti in Culture.</a> Journal of Neurocytology. 119 (4), 543-543 (1975).</li><li>Zheng, J. L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Math1+induces+robust+production+of+extra+hair+cells+in+postnatal+rat+inner+ears.">Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.</a> Nature Neuroscience. 3 (6), 580-580 (2000).</li><li>Martinez-Monedero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+POTENTIAL+ROLE+OF+ENDOGENOUS+STEM+CELLS+IN+REGENERATION+OF+THE+INNER+EAR.">THE POTENTIAL ROLE OF ENDOGENOUS STEM CELLS IN REGENERATION OF THE INNER EAR.</a> J Neurobiol. 66 (4), 319-319 (2006).</li><li>Saffer, L. D., Gu, R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RT-PCR+analysis+of+mRNA+for+growth+factor+receptors+in+damaged+and+control+sensory+epithelia+of+rat+utricles.">An RT-PCR analysis of mRNA for growth factor receptors in damaged and control sensory epithelia of rat utricles.</a> Hearing Research. 94 (1,2), 14-14 (1996).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+growth+and+differentiation+of+hair+cell+progenitors+from+the+newborn+rat+cochlear+greater+epithelial+ridge.">Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 271-271 (2007).</li><li>Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Differentiation+and+DNA+Binding+(Ids)+Regulate+Math1+and+Hair+Cell+Formation+during+the+Development+of+the+Organ+of+Corti.">Inhibitors of Differentiation and DNA Binding (Ids) Regulate Math1 and Hair Cell Formation during the Development of the Organ of Corti.</a> J. Neurosci. 26 (2), 550-550 (2006).</li><li>Daniela, B., Josef, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calbindin+and+S100+protein+expression+in+the+developing+inner+ear+in+mice.">Calbindin and S100 protein expression in the developing inner ear in mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 469-469 (2009).</li><li>Helms, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127 (6), 1185-1185 (2000).</li><li>Zheng, J. L., Wei-Qiang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Damage+to+Auditory+Neurons+and+Hair+Cells+by+Ototoxins+and+Neuroprotection+by+Specific+Neurotrophins+in+Rat+Cochlear+Organotypic+Cultures.">Differential Damage to Auditory Neurons and Hair Cells by Ototoxins and Neuroprotection by Specific Neurotrophins in Rat Cochlear Organotypic Cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 8 (9), 1897-1897 (1996).</li></ol>

Bu prosedürün başarısı için kritik olan pek çok ayrıntı vardır. Temporal kemik izolasyon Corti inkübasyon, organları canlı organ kültürlerinde lamel ve sonuç eklemek edeceği büyük şansı organ için kısa zaman. Bu nedenle, diseksiyon ve organları inkübatör yerleştirerek arasındaki süreyi sınırlamak için önemlidir. Antibiyotik seçimi, birçok aminoglikozid antibiyotikler ototoksik ve saç hücre ölümüne neden olacağından da çok önemlidir. Antibiyotik kullanımı tamamen vazgeçmek için tercih edilse de, bu kirlenme olasılığını açık bırakıyor. Bu nedenle, potansiyel kirlenme sorunların üstesinden gelmek için genel bir kural olarak 10 mikrogram / ml ampisilin kullanmanızı öneririz. Bu en sıkıntılı yönü ve diğer prosedürler Corti organı temel kültür, inkübasyon sırasında plakaları float organlarının eğilimidir. Kayan organ kültürleri, 5-7 gün boyunca canlı kalır rağmen, kültür yüzen organların sakıncaları vardır. Örneğin, mikroskopi sorunlu hale 4-5 gün sonra genellikle kendileri üzerine kat yüzen organ kültürleri. Daha sonra, lamel yapıştırılmış olan organlara kıyasla organın yapısal bütünlüğünü tehlikeye düşer. Corti organı kültür ortamı float olmadığından emin olmak için aşağıdaki teknikleri yardımcı olduğunu bulduk, ancak lamel yapıştırılmış kalır. Birincisi, 01:01 polyornithine / laminin kat cam lamelleri olarak açıklanan% 20 FBS ile desteklenmiştir. Bu protokol adı verilen gecede inkübasyon plaka kaplı olması gerektiği minimum süredir. Laboratuvarımızda, sık sık kat biz bir hafta boyunca ihtiyaç ve 4 tutmak plakaların ° C güne kadar biz onları bir gecede inkübasyon için inkübatör taşıdığınızda kullanımdan önce. İkincisi, organlar saç hücrelerinin silya bakacak şekilde yönlendirmek, kaplamalı lamelleri eksplant taşınır sonra. Bu yönelim, kültür çanak baziler membran bağlılık kolaylaştıracaktır. Üçüncü olarak, eksplant kaplı çanak yapıştırmayın kuyu içinde medya kaldırmak. Bu kültür çanağı ve baziler membran arasında temas sağlamak ve cama yapışır eksplantlar yeteneğini artıracaktır. Bu aynı zamanda saç hücrelerinin satır yapısal bütünlüğünü korumak yardımcı olacaktır. Son olarak, dikkatli bir şekilde yüzeye 200 mcL kapasitesi pipet kullanarak Corti organı kültür ortamı 2 damla damla ve daha sonra yavaş yavaş lamel tarafında kalan hacim (toplam 130 mcL) damlayan tarafından iyi doldurun. Corti organı kaplı lamel eki sağlamak için hızlı bir şekilde çalışmak için çok önemlidir. Eksplantlar kuluçka diseksiyon başlangıcından itibaren, genellikle uygulanan bir operatör için bu organ Corti izolasyon prosedürü tamamlamak için 10 dakika sürer. Bu protokol, biz de spiral Corti organı limbustan duyu epiteli mikro-izolasyonu için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemde, spiral limbus 28G kullanarak duyu epitel gaita ½ diseksiyon araçları olarak insülin iğneleri. Mikro-izole saç hücreleri ve bunlara karşılık gelen destekleyen hücrelerin (Şekil 3) satırları oluşur. Bu protokol açıklandığı gibi izole duyu epitel sonra yetiştirilebilir. Bu mikro-izolasyon prosedürü duyu epitel doku 4 çevreleyen enzimatik ayırma karşılaştırılmalıdır. Gibi tavuk, bodrum mezenkimal hücreler 4 duyu epitel izolasyon izole vestibüler organları thermolysin sindirim gibi memelilerin yanı sıra, non-memeli. Rat koklea, büyük epitel sırt ayrılması, daha az epitel sırt ve eşlik eden duyusal epitelde bazal membran 5 thermolysin sindirim sonuçları. Ancak, koklear duyu epitel beraberindeki mezenkimal hücreler olmadan kaplı plakalar ekleyebilirsiniz belirsizdir. Mekanik mikro-izolasyon yöntemi ve enzimatik sindirim yöntemi spiral limbustan duyu epitel ayrılması sonucu, thermolysin sindirim üzerinde mikro-izole diseksiyon avantajları hem de nispeten daha kısa bir protokol, ucuz reaktifler ve potansiyel olarak daha az stres sindirim enzimatik etkileri nedeniyle eksplant. Ayrıca, bazal membran kültür plaka duyu epitel eki artırabilir, bu yaklaşım sağlam bırakılır. Bu yöntemin dezavantajları bu hassas diseksiyon ve duyu epiteli mikro diseksiyon kaynaklanan potansiyel mekanik hasar becerilerini geliştirmek için ihtiyaç içerir. Bu prosedürün yardımcı programı bir örnek olarak, biz de organ kullanımının bir örnek sunmakCorti kültürleri; eksplant kültür ekzojen genlerin elektroporasyon. Corti elektroporasyon organ önceki yöntem, yukarıda açıklanan elektroporasyon prosedürü dayanır. Özellikle, Zheng ve Gao (2000) eksplantlar elektroporasyon için agaroz bir kalıp oluk tarafından yerinde tutulur ve daha sonra kolajen serum orta 2 kaplamalı 8-iyi LABTEK slayt kaplama Corti izole sıçan organlarının elektroporasyon açıklar. Kendi yaklaşımının bir avantajı organları eksplantlar üst yüzeyleri teorik eksplant üzerinde electroporated hücreleri düzgün bir dağıtım sonuçlanması gerekiyor katot, yüz böylece odaklı. Corti organı böylece elektroporasyon sonra eksplant manipülasyon azaltarak işlem boyunca lamel yapıştırılmış kaldı, çünkü bizim elimizde ise, tarif yöntemi bu yordamı geliştirilmiş. Ayrıca, Corti organların daha yüksek bir yüzdesi sunulan bu yöntemi kullanarak lamelleri bağlı kaldı. Bizim yöntemi Jones ve ark (2006) Fugene 6 reaktif elektroporasyon sonra gen ekspresyonu verimliliğini artırmak için ek kullanır alınır. Jones ve arkadaşları (2006) protokolü, organları, electroporated Fugene 6 transfeksiyon reaktif mcL 100 ve 6 kaplama ile 5 dakika inkübe. Bizim yöntem Fugene 6 reaktif bir 3:2 oranı minimum organ toksisitesi ile optimal transgenik ifade sağlamak için deneysel olarak bulundu. Plazmid DNA kullanımı farklıdır. Kültürlere toksisite neden olabilir, sulandırılmamış Fugene 6 reaktif kullanmayın. Bizim protokol elektrod yapılandırma yanı sıra spiral limbus veya katot pozisyonuna bağlı olarak duyu epitel birincil gen ekspresyonu Jones ve arkadaşları (2006), sonuçlar. Katot uzak kültürünün yan DsRed pozitif hücreler olmasına rağmen, katot yakın transgenik hücrelerin daha yüksek bir konsantrasyonu vardır. Transgen eksplant Corti organı her iki tarafında tam bir ifade sağlamak için, mevcut yol açar sadece tersini ikinci bir darbe tren ters olabilir. Corti organı (Şekil 5) boyunca transgen sağlam ifade sunulan protokol sonuçları.

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass microscope coverslips</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>DYNALAB Corporation (Rochester, NY)</td>
			<td>2010</td>
			<td>10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ringed cell culture dish</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>627170</td>
			<td>Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4957</td>
			<td>0.01% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) </td>
			<td>354232</td>
			<td>made in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>26140-095</td>
			<td>Qualified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>RS-6806</td>
			<td>Straight, sharp-blunt length 5"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blade</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>372611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#4 Dumoxel forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11241-30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Dumostar fine forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>10564-011</td>
			<td>High Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>2605088</td>
			<td>Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>11593-027</td>
			<td>Irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&frac12; cc Lo-Dose Insulin Syringe </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>329465</td>
			<td>U-100 28G&frac12;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6 Transfection Reagent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roche (Mannheim, Germany)</td>
			<td>11-815-091-001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene test tube</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>14-956-5A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>The Baker Company (Stanford, ME)</td>
			<td>Model SG603a</td>
			<td>SterileGARD III 
				Advanced Class II 
				Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced-Serum Medium</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>31985</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter plasmid</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Clontech (Mountain View, CA)</td>
			<td>632539</td>
			<td>pCMV DsRed-Express 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BioRad (Hercules, CA)</td>
			<td>165&#x2013;2662</td>
			<td>BioRad Gene Pulser Xcell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. 

Tüm memeliler, seçmelere için duyu epiteli, iç kulak (Şekil 1) kabuklu şeklinde koklea içinde bulunduğu spiral şeklindeki organ Corti boyunca yer almaktadır. Işitme sistemi mechanosensory hücreleri gelişmekte olan koklea, saç hücreleri tek bir satır ve iç saç hücreleri üç (temel ve orta-dönüşleri) dört (apikal sırayla) dış saç hücrelerinin satır hizalanır Corti organı süresini kapsar. Saç hücreleri, beyin yorumlayabilir sinirsel uyarılara çeviren baziler membran ses kaynaklı mekanik titreşimler transduce. Sensorinöral işitme kaybı vakalarının çoğu koklear saçlı hücreler ölüm veya işlev bozukluğundan kaynaklanır. Işitsel araştırma, giderek daha temel bir araç izolasyon ve organ eksplant 1,2,9 in vitro kültürü . Izole sonra, eksplantlar bilgilere ilişkin normatif, anormal, ya da terapötik fizyolojisi sağlamak için çeşitli şekillerde kullanılabilir. Gen ifadesi, stereocilia motilite, hücre ve moleküler biyoloji, yanı sıra saç hücre rejenerasyonu için biyolojik yaklaşımlar Corti eksplantlar organ deneysel uygulamaların örnekleridir. Bu protokol, yenidoğan farelerin Corti organı izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. İlişikteki video fare yavrular temporal kemik izolasyonu için adım adım talimatlar ve koklea, spiral ligament ve Corti organı sonraki izolasyon içerir. Bir kez izole edilmiş, duyusal epitel kaplama ve bütünüyle in vitro olarak kültüre, ya da bir başka disseke spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar yoksun olduğu mikro-izole eder . edilebilir Bu yöntemi kullanarak, birincil eksplantlar 7-10 gün süreyle muhafaza edilebilir. Bu prosedürün yardımcı programı bir örnek olarak, Corti eksplantlar organı dışsal DsRed muhabiri gen electroporated olacaktır. Izolasyon, mikrodiseksiyon ve Corti organı primer kültür, tekrarlanabilir, net, ve adım adım yönergeleri sağlar, çünkü bu yöntem yayınlanan diğer yöntemleri üzerinde bir iyileşme sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. at JoVE.com

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

primary-culture-plasmid-electroporation-murine-organ

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

25.7K Görüntüleme.  Harvard Medical School. Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.

Video: Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Mikobakteriler, Elektroporasyon

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

Biyoloji

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Yetişkin Sıçan Kalp miyositler İlköğretim Kültür

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

Plazmid DNA teslimat için fare mesane Urothelium elektroporasyon tarafından roman yöntemi

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Yetişkin Fare Damak Tadından Birincil Oral Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

Plazmid DNA'sının Fare İskelet Kasına Elektroporasyonu

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

İnflamatuar Artritin Ortaya Çıkarılması: Sinovyal Hücrelerin İşlevlerini Keşfetmek

Isolation and Culture of Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts from Murine Arthritis Tissue

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central roles in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. It is important to understand the functions of both cell populations to reveal the mechanisms underlying pathological progression and remission in inflammatory arthritis. In general, in vitro experimental conditions should mimic the in vivo environment as much as possible. Primary tissue-derived cells have been used in experiments characterizing synovial fibroblasts in arthritis. In contrast, in experiments investigating the biological functions of macrophages in inflammatory arthritis, cell lines, bone marrow-derived macrophages, and blood monocyte-derived macrophages have been used. However, it is unclear whether such macrophages actually reflect the functions of tissue-resident macrophages. To obtain resident macrophages, previous protocols were modified to isolate and expand both primary macrophages and fibroblasts from synovial tissue in an inflammatory arthritis mouse model. These primary synovial cells may be useful for in vitro analysis of inflammatory arthritis.

Yazar Spotlight: Murin Artrit Dokusundan Primer Sinovyal Makrofajların ve Fibroblastların İzolasyonu ve Kültürü  

The present study provides a modified protocol to isolate synovial macrophages and fibroblasts from murine inflammatory arthritis tissue.

Murin Artrit Dokusundan Primer Sinovyal Makrofaj ve Fibroblastların İzolasyonu ve Kültürü

Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that leads to chronic inflammation of joints. Synovial macrophages and synovial fibroblasts have central ...